硫酸铵分级沉淀原理及实验方案

2024年3月15日发(作者：单薄)

一， 基本原理

硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免

疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋

白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。

各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称

之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白变

性而应用最为广范。

二， 试剂及仪器

1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等

2. 硫酸铵（ NH 4 ） SO 4

3. 饱和硫酸铵溶液（ SAS ）

4. 蒸馏水

5. PBS( 含 0.2g /L 叠氮钠 )

6. 透析袋

7. 超速离心机

8. pH 计

9. 磁力搅拌器

三， 操作步骤

以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫

酸 铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% — 50% 。

（一）配制饱和硫酸铵溶液（ SAS ）

1.将 767g （ NH 4 ） 2 SO 4 边搅拌边慢慢加到 1 升 蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸

pH7.0 。此即饱和度为 100% 的硫酸铵溶液（ 4.1 mol/L, 25 ° C ）.

2.其它不同饱和度铵溶液的配制

（二）沉淀

1.样品（如腹水） 20 000 ′ g 离心 30 min ，除去细胞碎片；

2.保留上清液并测量体积；

3.边搅拌边慢慢加入等体积的 SAS 到上清液中，终浓度为 1 ： 1 （

4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或搅拌过夜（ 4 ° C ），使蛋白质充分沉淀。

（三）透析

1.蛋白质溶液 10 000 ′ g 离心 30 min （ 4 ° C ）。弃上清保留沉淀；

2.将沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对

PBS -0.2g /L 叠氮钠透析 24-48 小时（ 4 ° C ），每隔 3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻

底除去硫酸氨；

3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。

四，应用提示

（一） 先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。

1.边搅拌边慢慢加 SAS 到样品溶液中，使浓度为 0.5:1 (v/v) ；

2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时 或过夜（ 4 ° C ）；3.3000 ′ g 离心 30 min （ 4 °

C ），保留上清液；上清液再加 SAS 到 0.5:1(v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于 PBS ，

同前透析，除去硫酸氨；

4.上清液再加 SAS 到 0.5:1 (v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于 PBS ，同前透析，除

去硫酸氨；

5.杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效

（二）为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表 1 ）；硫酸氨沉淀

法与层析 技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。

今天作的实验是利用硫酸铵沉淀蛋白质，从之前作过的经验知道，这一个步骤是有名的烦，

要慢慢用敲的把硫酸铵缓缓的加入蛋白质溶液中。

相关的原理可以在庄荣辉学习网站中找到，与盐溶刚好相反，在蛋白质溶液中加入硫酸铵，

会使得蛋白质的溶解度下降，因而沉淀出来。因为硫酸铵所解离的离子容很大，所带的电子

数也多(NH4+, SO42-)，因此当其溶入水中时，会吸引大量水分子与这些离子水合。

蛋白质分子表面多少有一些较不具极性的区域，水分子会在这些非极性区的表面聚集，形

成类似『水笼』的构造(请见下图)，以便把蛋白质溶入水中。一旦蛋白质溶液加入硫酸铵，

后者吸引了大量水分子，使水笼无法有效隔离蛋白质的非极性区，造成这些非极性区之间的

吸引，因而沉淀下来。因此，分子表面上若有越多的非极性区域，就越容易用硫酸铵沉淀下

来。

在计算所添加的硫酸铵的重量方面，找到了一个不错的网站——硫酸铵计算机

这个网页上可以靠着输入实验温度、溶液体积、想要到达的百分浓度以及初始的百分浓度这

四个数值，就可以得到需要添加的硫酸铵克数，以及在加入固体硫酸铵后所增加的体积，算

是一个很不错的网站。

此外另一个比较值得提的，是我有用两种方式加入硫酸铵，第一种是固体的硫酸铵模碎加入，

另一种是将硫酸铵溶成饱和溶液再加入，各有各的优缺点，比较如下：

1.造成蛋白质变质的程度：固体的硫酸铵>硫酸铵饱和溶液

利用硫酸铵饱和溶液真的超棒，滴入的速度可以很快而不造成变质(没试过用倒入的)。 不

像固体的硫酸铵只能磨碎慢慢加入，速度一快蛋白质就坏了(溶液有致密的白色气泡产生)。

2.操作的容易度： 硫酸铵饱和溶液>>固体的硫酸铵

固体硫酸铵最大的缺点就是操作不容易，要一直敲敲敲又不能太快，所以当你要溶解的蛋白

质很多时，这是很累的步骤。然而硫酸铵饱和溶液比较麻烦只有在配制部分，要先加热让它

饱合后，回到操作温度让它过饱和，最后用滤纸把硫酸铵结晶去掉。

3.蛋白质溶液的体积放大程度 硫酸铵饱和溶液>>固体的硫酸铵

这是使用硫酸铵饱和溶液最头痛的部分，举例来说，要让100 ml的硫酸铵百分比从0%到

25%， 如果是加入固体的硫酸铵，只会让溶液从100 ml变成107 ml左右，但若是加入硫酸

铵饱和溶液，会让溶液变成125 ml！而且若是要提高到50%，须加等量的硫酸铵饱和溶液，

所以会让蛋白质溶液从100 ml变成200 ml。

因此在加入硫酸铵时，若是低百分浓度可以利用硫酸铵饱和溶液，然而如果是高百分浓度的，

除非不在意蛋白质溶液体积的放大(反正都要离心离下来)，否则还是用固体硫酸铵来的好。

所以今天从0%拉到25%及从25%拉到50%时，都是利用硫酸铵饱和溶液，但是当要从50%

拉到75%时，我选择利用固体硫酸铵，因为如果用硫酸铵饱和溶液， 离心机无法离那么多

的溶液体积。