硫酸铵分级沉淀法分离纯化酵母蔗糖酶实验报告

2024年3月15日发(作者：手工制作风筝)

硫酸铵分级沉淀法分离纯化酵母蔗糖酶实验报告

实验方法原理：

当高浓度盐存在时，蛋白质往往凝聚并析出沉淀。称为盐析。

不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀，所以盐析常用于蛋白质

的分离纯化。几种因素如pH、温度、蛋白质纯度在测定各种蛋白质

的盐析时起着重要作用。

选择硫酸铵是因为它具有一些优良性质，如盐析的有效性、pH

范围广、溶解度高、溶液散热少和经济适用。

实验材料：

蛋白质溶液、试剂、试剂盒、硫酸铵、用于悬浮沉淀物的缓冲

液、仪器、烧杯、磁力搅拌器和搅拌子、离心机和转头。

实验步骤：

1.将盛有蛋白质溶液的烧杯放在装另一装有冰水的大烧杯内，

并置于磁力搅拌器上搅拌；

2.边搅拌，边徐徐加入56.8g硫酸铵至饱和，该步骤应在5或

10min内完成；

3.继续搅拌10～30min；

4.10000g离心10min或3000g30min；

5.弃去上清液。将沉淀悬浮于1或2倍沉淀物体积的缓冲液

中，残留的不溶性物质可能是变性蛋白，通过离心除去；

6.硫酸铵能够通过透析，超滤或脱盐柱除去。

注意事项：

1.搅拌必须是有规则的和温和的。搅拌太快将引起蛋白质变

性，其变性特征是起泡。用磁力搅拌器不明显产热，这一点也很重

要。

2.大多数蛋白质在盐溶解后的前20min沉淀，一些蛋白质要经

数小时才能完全沉淀。

3.为了平衡硫酸铵溶解时产生的轻微酸化作用，沉淀反应至少

应在50mm/L缓冲液中进行。

4.缓冲液应含有合剂以除去硫酸铵中微量的重金属离子，因为

这些离子对目的蛋白质是有害的。

5.为确保获得最大量沉淀，使用蛋白质初始浓度至少为

1mg/ml。

6.硫酸铵沉淀反应通常是贮存和稳定蛋白质的良好方法。

7.少数蛋白质在硫酸铵浓度低于24％时就产生沉淀，而大多数

要在80％以上才能沉淀。在纯化的初始阶段，常利用蛋白质在硫酸

铵中溶解度的差异分离蛋白质。硫酸铵沉淀可除去RNA和DNA。

8.在蛋白质的等电点其溶解度降低，在此条件下，静电的相互

作用可导致蛋白质凝聚和沉淀在蛋白质的等电点，低浓度的硫酸铵

就能沉淀蛋白质。

9.在蛋白质结晶实验中，采用硫酸铵沉淀十分有效。