一种低溶血性抗菌脂肽及其制备方法[发明专利]

2024年3月12日发(作者：同享)

(19)中华人民共和国国家知识产权局

*CN102311483A*

(10)申请公布号 CN 102311483 A

(43)申请公布日 2012.01.11

(12)发明专利申请

(21)申请号 2.9

(22)申请日 2011.07.13

(71)申请人大连伊美生物科技有限公司

地址116000 辽宁省大连市沙河口区富民路

120号

(72)发明人赵春晖 赖宏森

(51).

C07K 7/06

(2006.01)

C07K 1/20

(2006.01)

C07K 1/06

(2006.01)

C07K 1/04

(2006.01)

A61K 38/08

(2006.01)

A61K 8/64

(2006.01)

A61P 31/00

(2006.01)

A61Q 1/00

(2006.01)

A23L 1/305

(2006.01)

权利要求书 2 页 说明书 4 页

序列表 1 页 附图 1 页

(54)发明名称

一种低溶血性抗菌脂肽及其制备方法

(57)摘要

本发明属生物化学领域，具体涉及一种低溶

血性抗菌脂肽及其制备方法。本发明公开了一种

抗菌脂肽，其序列为Octanoly(C8)-KKKWPW

及其

衍生物或活性片段，其具有广泛的抗菌活性，并具

有较低的溶血性。该抗菌脂肽或其衍生物或与多

种载体混合，制成注射剂、口服制剂、透皮吸收制

剂、黏膜吸收剂等用于临床，也可作为抗菌制剂应

用于食品、化妆品等。

C

N

1

0

2

3

1

1

4

8

3

A

CN 102311483 A

CN 102311484 A

权 利 要 求 书

1/2页

1.一种低溶血性抗菌脂肽，其特征在于：其序列为Octanoly(C8)-KKKWPW。

2.一种低溶血性抗菌脂肽的制备方法，其特征在于：

（1）称取适量Fmoc Rink-Amide MBHA树脂置于固相反应器中，用大约2.5 倍体积的

DCM(二氯甲烷)充分溶胀30 min后真空泵抽干，加入DMF(N,N-二甲基甲酰胺)洗涤树脂

两次，然后将脱帽试剂放入固相反应器反应5 min，用真空泵抽干，重新加入脱帽剂反应10

min，用真空泵抽干，分别用DMF、无水甲醇、DCM洗涤树脂两次，接着用茚三酮法检测至树脂

成黑色或紫色；然后树脂用DMF润洗一次，加入Fmoc-Trp(Boc)-OH、DMF、DIEA及HBTU的混

和均匀液体，在室温下反应40 min，真空泵抽干，分别用DMF、无水甲醇、DCM洗涤，取少量树

脂用茚三酮法检测若无色，则说明反应完全；

（2）在步骤（1）得到的树脂中，加入脱帽试剂，室温反应5 min，抽干，重新加入脱帽剂

反应10 min，抽干，洗涤，加入Fmoc-Pro-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均匀液体，在室温下

反应40 min，抽干，洗涤，抽干，茚三酮法检测若无色，则说明反应完全；

（3）在步骤(2)得到的树脂中，加入脱帽试剂，室温反应5 min，抽干，重新加入脱帽剂

反应10 min，抽干，洗涤，加入Fmoc- Trp(Boc)-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均匀液体，在

室温下反应40 min，抽干，洗涤，抽干，茚三酮法检测若无色，则说明反应完全；

（4）在步骤(3)得到的树脂中，加入脱帽试剂，室温反应5 min，抽干，重新加入脱帽剂

反应10 min，抽干，洗涤，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均匀液体，在室

温下反应40 min，抽干，洗涤，抽干，茚三酮法检测若无色，则说明反应完全；

（5）在步骤(4)得到的树脂中，加入脱帽试剂，室温反应5 min，抽干，重新加入脱帽剂

反应10 min，抽干，洗涤，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均匀液体，在室

温下反应40 min，抽干，洗涤，抽干，茚三酮法检测若无色，则说明反应完全；

（6）在步骤(5)得到的树脂中，加入脱帽试剂，室温反应5 min，抽干，重新加入脱帽剂

反应10 min，抽干，洗涤，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均匀液体，在室

温下反应40 min，抽干，洗涤，抽干，茚三酮法检测若无色，则说明反应完全；

（7）在步骤(6) 得到的树脂中，加入脱帽试剂，室温反应5 min，抽干，重新加入脱帽剂

反应10 min，抽干，洗涤，加入正辛酸、DMF、DIEA及HBTU的混和均匀液体，在室温下反应40

min，抽干，洗涤，抽干，茚三酮法检测若无色，则说明反应完全，用DCM重新洗涤两次，树脂

真空干燥；

（8）把干燥后的树脂倒入玻璃的茄形瓶中，冰浴降温，加入切割试剂（81.5% TFA+1%TIS

+5%DIWater +2.5%EDT +5%苯甲硫醚 +5%苯酚）搅拌反应10 min后室温搅拌3-4 h，

过滤除去树脂，加乙醚沉淀，离心，乙醚洗涤，得到的固体减压抽干，即得粗品；粗品经制备

HPLC纯化，冷冻干燥，得到纯品。

3.根据权利要求2所述的一种低溶血性抗菌脂肽的制备方法，其特征在于：脱帽试剂

组分和体积比为：哌啶：DMF=1：4；Fmoc-Trp(Boc)-OH的摩尔数为树脂的2-4倍；HBTU的摩

尔数为树脂的2-4倍；DIEA的摩尔数为树脂的2-6倍；Fmoc-Pro-OH的摩尔数为树脂的2-4

倍；Fmoc- Lys(Boc)-OH的摩尔数为树脂的2-4倍；Fmoc- Phe-OH的摩尔数为树脂的2-4

倍；正辛酸的摩尔数为树脂的2-4倍。

4.根据权利要求2所述的一种低溶血性抗菌脂肽的制备方法，其特征在于：Fmoc

Rink-Amide MBHA树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5-15 mL/g；Fmoc Rink-Amide

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CN 102311483 A

CN 102311484 A

权 利 要 求 书

2/2页

MBHA树脂的重量与DMF的加入量的比例为5-12 mL/g；Fmoc Rink-Amide MBHA树脂的重量

与DMF、无水甲醇、DCM的加入量的比例为5-12 mL/g。

5.根据权利要求1所述抗菌脂肽在制备抗菌药物中的应用。

6.根据权利要求1所述的抗菌脂肽，其特征在于：其衍生物或活性片段包含权利要求1

所述的氨基酸序列或片段。

7.根据权利要求1所述的脂肽可以应用于食品、化妆品，可以与药学上可接受的载体

混合，制成注射剂、口服制剂、透皮吸收制剂、黏膜吸收剂。

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CN 102311483 A

CN 102311484 A

说 明 书

一种低溶血性抗菌脂肽及其制备方法

1/4页

技术领域

[0001]

本发明属生物化学领域，具体涉及一种低溶血性抗菌脂肽及其制备方法。

背景技术

抗生素自被发现以来就成为人类与感染性疾病进行斗争的有利武器。抗生素的发

现和进入临床应用，拯救了千千万万受病菌感染病人的生命。近年来，由于环境和人为因素

导致耐药菌不断产生，甚至出现了能抵抗大多数可用抗菌素的超级细菌。严重降低了普及

型抗生素的治疗效果，给感染性疾病的控制和治疗带来了极大的困难，同时也给人类的健

康带来了潜在的威胁(饶贤才,2004)。 新型抗生素因此成为当今药物研究领域中日益受

到重视的方向之一。

[0003]

抗菌肽广义上是指存在于生物体内具有抵抗外界微生物侵害、消除体内突变细胞

的一类小分子多肽。7 0年代末，研究者从昆虫体内发现了抗菌肽，也称为肽类抗生素，是生

物体内经诱导产生的一类具有生物活性的小分子多肽。后来，人们陆续从细菌，真菌，昆虫，

被囊类动物，两栖类动物，鸟类，鱼类，哺乳类以及人类中分离出1500多种阳离子抗菌肽。

这些从生物体中分离出来抗菌肽是组成生物体非特异性防御系统的重要组分，能够有效的

作用于革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、寄生虫、包膜病毒以及癌细胞。

[0004]

来自自然界的抗菌肽具有来源广泛、结构多样、活性确切等优点，但它们大多数具

有分子量较大、易于代谢失活、具有抗原性或者具有一定的毒性、天然提取工艺复杂、天然

资源有限等等缺点，真正将天然抗菌肽推向市场可能还要面临很多挑战。因此，通过研究分

析天然抗菌肽的特点，了解其结构功能，分析序列特点，对这些活性先导物进行结构改造或

是以其为蓝本进行全新设计及合成的化学合成抗菌肽为解决这一难题提供了有效途径，具

有重要的意义。

[0002]

发明内容

[0005]

本发明的目的是提供一种能够抑制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及真菌生长的抗

菌脂肽。并提供一种工艺简化、成本降低、工时减少、操作安全的脂肽固相合成方法。

[0006]

本发明的另一个目的是提供上述抗菌脂肽的化学合成方法。

[0007]

本发明的另一个目的是提供上述抗菌脂肽及其活性片段在制备抗菌药物中的应

用。

[0008]

本发明的抗菌脂肽，其序列为Octanoly(C8)-KKKWPW。

[0009]

本发明的抗菌脂肽采用化学合成法合成，可以是液相合成，也可以是固相合成。

[0010]

本发明筛选得到的抗菌脂肽可广泛地对抗已具有抗药性的菌株及医药上重要的

真菌。本发明的抗菌脂肽对于人的红血球有非常低的溶血性。

[0011]

本发明还提供了一种低溶血性抗菌脂肽的制备方法。

[0012]

（1）称取适量Fmoc Rink-Amide MBHA树脂置于固相反应器中，用大约2.5 倍体积

的DCM(二氯甲烷)充分溶胀30 min后真空泵抽干，加入DMF(N,N-二甲基甲酰胺)洗涤树

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CN 102311483 A

CN 102311484 A

说 明 书

2/4页

脂两次，然后将脱帽试剂放入固相反应器反应5 min，用真空泵抽干，重新加入脱帽剂反应

10 min，用真空泵抽干，分别用DMF、无水甲醇、DCM洗涤树脂两次，接着用茚三酮法检测至树

脂成黑色或紫色。然后树脂用DMF润洗一次，加入Fmoc-Trp(Boc)-OH、DMF、DIEA及HBTU的

混和均匀液体，在室温下反应40 min，真空泵抽干，分别用DMF、无水甲醇、DCM洗涤，取少量

树脂用茚三酮法检测若无色，则说明反应完全。

[0013]

（2）在步骤（1）得到的树脂中，加入脱帽试剂，室温反应5 min，抽干，重新加入脱

帽剂反应10 min，抽干，洗涤，加入Fmoc-Pro-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均匀液体，在室

温下反应40 min，抽干，洗涤，抽干，茚三酮法检测若无色，则说明反应完全。

[0014]

（3）在步骤(2)得到的树脂中，加入脱帽试剂，室温反应5 min，抽干，重新加入脱

帽剂反应10 min，抽干，洗涤，加入Fmoc- Trp(Boc)-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均匀液体，

在室温下反应40 min，抽干，洗涤，抽干，茚三酮法检测若无色，则说明反应完全。

[0015]

（4）在步骤(3)得到的树脂中，加入脱帽试剂，室温反应5 min，抽干，重新加入脱

帽剂反应10 min，抽干，洗涤，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均匀液体，

在室温下反应40 min，抽干，洗涤，抽干，茚三酮法检测若无色，则说明反应完全。

[0016]

（5）在步骤(4)得到的树脂中，加入脱帽试剂，室温反应5 min，抽干，重新加入脱

帽剂反应10 min，抽干，洗涤，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均匀液体，

在室温下反应40 min，抽干，洗涤，抽干，茚三酮法检测若无色，则说明反应完全。

[0017]

（6）在步骤(5)得到的树脂中，加入脱帽试剂，室温反应5 min，抽干，重新加入脱

帽剂反应10 min，抽干，洗涤，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均匀液体，

在室温下反应40 min，抽干，洗涤，抽干，茚三酮法检测若无色，则说明反应完全。

[0018]

（7）在步骤(6) 得到的树脂中，加入脱帽试剂，室温反应5 min，抽干，重新加入脱

帽剂反应10 min，抽干，洗涤，加入正辛酸、DMF、DIEA及HBTU的混和均匀液体，在室温下反

应40 min，抽干，洗涤，抽干，茚三酮法检测若无色，则说明反应完全。用DCM重新洗涤两次，

树脂真空干燥。

[0019]

（8）把干燥后的树脂倒入玻璃的茄形瓶中，冰浴降温，加入切割试剂（81.5%

TFA+1%TIS+5%DIWater +2.5%EDT +5%苯甲硫醚 +5%苯酚）搅拌反应10 min后室温搅拌3-4

h。过滤除去树脂，加乙醚沉淀，离心，乙醚洗涤，得到的固体减压抽干，即得粗品。粗品经制

备HPLC纯化，冷冻干燥，得到纯品。

[0020]

3、根据权利要求2所述的一种低溶血性抗菌脂肽的制备方法，其特征在于：脱帽

试剂组分和体积比为：哌啶：DMF=1：4；Fmoc-Trp(Boc)-OH的摩尔数为树脂的2-4倍；HBTU

的摩尔数为树脂的2-4倍；DIEA的摩尔数为树脂的2-6倍；Fmoc-Pro-OH的摩尔数为树脂

的2-4倍；Fmoc- Lys(Boc)-OH的摩尔数为树脂的2-4倍；Fmoc- Phe-OH的摩尔数为树脂的

2-4倍；正辛酸的摩尔数为树脂的2-4倍。

4、根据权利要求2所述的一种低溶血性抗菌脂肽的制备方法，其特征在于：Fmoc

Rink-Amide MBHA树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5-15 mL/g；Fmoc Rink-Amide

MBHA树脂的重量与DMF的加入量的比例为5-12 mL/g；Fmoc Rink-Amide MBHA树脂的重量

与DMF、无水甲醇、DCM的加入量的比例为5-12 mL/g。

[0022]

5、根据权利要求1所述抗菌脂肽在制备抗菌药物中的应用。

[0023]

6、根据权利要求1所述的抗菌脂肽，其特征在于：其衍生物或活性片段包含权利

[0021]

5

CN 102311483 A

CN 102311484 A

说 明 书

3/4页

要求1所述的氨基酸序列或片段。

[0024]

7、根据权利要求1所述的脂肽可以应用于食品、化妆品，可以与药学上可接受的

载体混合，制成注射剂、口服制剂、透皮吸收制剂、黏膜吸收剂等。

附图说明

[0025]

图1 为本发明抗菌脂肽Octanoly(C8)-KKKWPW对人的红血球的低溶血性实验结

果。

具体的实施方式

实施例1：称取15g Fmoc Rink-Amide MBHA树脂置于250ml固相反应器中，用大120ml

的DCM(二氯甲烷)充分溶胀30 min后真空泵抽干，加入100ml DMF(N,N-二甲基甲酰

胺)洗涤树脂两次，然后将脱帽试剂放入固相反应器反应5 min，用真空泵抽干，重新加

入脱帽剂反应10 min，用真空泵抽干，分别用100ml DMF、100ml 无水甲醇、100ml DCM洗

涤树脂两次，接着用茚三酮法检测至树脂成黑色或紫色。然后树脂用DMF润洗一次，加入

Fmoc-Trp(Boc)-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均匀液体，在室温下反应40 min，真空泵抽干，

分别用DMF、无水甲醇、DCM洗涤，取少量树脂用茚三酮法检测若无色，则说明反应完全。

[0027]

在得到的树脂中，加入脱帽试剂，室温反应5 min，抽干，重新加入脱帽剂反应10

min，抽干，洗涤，加入Fmoc-Pro-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均匀液体，在室温下反应40

min，抽干，洗涤，抽干，茚三酮法检测若无色，则说明反应完全。

[0028]

在上述得到的树脂中，加入脱帽试剂（60ml 20%哌啶/DMF），室温反应5 min，抽

干，重新加入脱帽剂反应10 min，抽干，洗涤，加入1.5eq Fmoc- Trp(Boc)-OH、60ml DMF、

DIEA（2.5eq）及HBTU（1.5eq）的混和均匀液体，在室温下反应40 min，抽干，洗涤，抽干，

茚三酮法检测若无色，则说明反应完全。

[0029]

重复上述步骤依次加入Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、

Fmoc-Lys(Boc)-OH进行偶联及Fmoc脱除。全部肽序列偶联完成的树脂依次加

入DMF（100ml）、MeOH（100ml）、DCM（100ml），洗涤完成后放置于真空干燥箱中

干燥过夜。干燥后的树脂倒入玻璃的茄形瓶中，冰浴降温，加入切割试剂（81.5%

TFA+1%TIS+5%DIWater+2.5%EDT+5%苯甲硫醚+5%苯酚）搅拌反应10 min后室温搅拌3-4

h。过滤除去树脂，加乙醚沉淀，离心，乙醚洗涤，得到的固体减压抽干，即得粗品。粗品经制

备HPLC纯化，冷冻干燥，得到纯品。所使用的反相高效液相层析是半制备C18反相柱。纯

化的流动相是不同比例的乙腈和水的混合。波长220和280纳米检测。流速是4毫升/分

钟。所得的主要胜肽产物以液质联用仪（LC-MS）确定分子量。

[0030]

实施例2：体外抗菌活性测试

将倍比稀释后不同浓度的抗菌脂肽溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至

第11孔加药液，每孔10μl，第12孔不加药作为生长对照。将用生长法或直接菌悬液法制

备的浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经MH（Meuller-Hinton）肉汤1∶1000稀释

后，向每孔中加100μl，密封后置35℃普通空气孵箱中，孵育16~20h判断结果。以在小孔

内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当阳性对照孔（即不含抗生素）内细菌明显生

长试验才有意义。重复试验3次，求得平均值，如表一。根据结果，发现本发明的抗菌肽及

其衍生的短肽具有很强的抗菌活性。

[0026]

6

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CN 102311484 A

[0031]

说 明 书

4/4页

表一 抗菌脂肽对不同菌株的最小抑制浓度（μg/ml）

大肠杆菌

10

10

20

20

金黄葡萄球菌

10

20

20

20

枯草杆菌

10

20

20

20

绿脓杆菌

20

20

20

20

抗菌脂肽序列

Octanoly(C8)-KKKWPW

Octanoly(C8)-KKK

Octanoly(C8)-KKKW

Octanoly(C8)-KKKWP

实施例3：溶血实验

采取人的血液，加入肝素（每10ml血加1%肝素1ml）混合，放入离心机中，800g离心 5

分钟，取出后弃去上清液。加入生理盐水混合后再离心，后除去上清液。同法重复一次，得

洗涤红细胞，用生理盐水配成10%混悬液以每管50微升的体积分装备用。将溶解于生理盐

水中的抗菌脂肽加入，37℃培养一小时（最后红血球浓度为5% V/V）。800g离心10分钟，将

前处理过的红血球和不同浓度的抗菌脂肽培养而分别得到其溶血性百分比。结果（表二）显

示，本发明的抗菌脂肽对于人的红血球有较低的溶血性。

[0032]

表二 抗菌脂肽的溶血百分比测定（%）

抗菌脂肽序列

Octanoly(C8)-KKKWPW

Octanoly(C8)-KKK

Octanoly(C8)-KKKW

Octanoly(C8)-KKKWP

5μg/ml

1.20

1.15

1.33

1.18

20μg/ml

2.8

100μg/ml

5tt

500μg/ml

12

11

15

17

3.5 11

6.0 12

6.6 11

以上描述了本发明的优选实施方案，并非用于限定本发明。本领域技术人员对在此公

开的实施方案可以进行不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

7

CN 102311483 A

CN 102311484 A

序 列 表

1/1页

＜110＞ 大连伊美生物科技有限公司

＜120＞ 一种低溶血性抗菌脂肽及其制备方法

＜130＞

＜160＞ 4

＜170＞

＜210＞ 1

＜211＞ 3

＜212＞ PRT

＜213＞ 人工序列

＜400＞ 1

Lys Lys Lys

＜210＞ 2

＜211＞ 4

＜212＞ PRT

＜213＞ 人工序列

＜400＞ 2

Lys Lys Lys Trp

＜210＞ 3

＜211＞ 5

＜212＞ PRT

＜213＞ 人工序列

＜400＞ 3

Lys Lys Lys Trp Pro

＜210＞ 4

＜211＞ 6

＜212＞ PRT

＜213＞ 人工序列

＜400＞ 4

Lys Lys Lys Trp Pro Trp

8

CN 102311483 A

CN 102311484 A

说 明 书 附 图

1/1页

图1

9