抗菌脂肽制备羧甲基壳聚糖纳米粒稳定混悬液及其抑菌活性

2024年3月12日发(作者：户籍是籍贯吗)

抗菌脂肽制备羧甲基壳聚糖纳米粒稳定混悬液及其抑菌活性

李振华;孙力军;王雅玲;王林;徐德峰;刘唤明;张永平;聂芳红

【摘 要】The gathering problem appeared during the preparation of

carboxymethyl chitosan nanoparticles ( CCN) was solved by antibacterial

lipopeptide, and investigated the effect of it on the inhibitory activity of

carboxymethyl chitosan nanoparticles. The CCN were prepared by

emulsion-disperd with antibacterial lipopeptide ionic crosslinking

method and obrved its stability by tting it still aside, and measured its

viscosity changes by Ubbelohde viscometer, obrved its morphological

change by scanning electron microscope. The effect of different

concentration of nanoparticles on the inhibition against Streptococcus

aureus and E. coli were tested by turbidimetry. It was found that

nanoparticles which were prepared by adding antibacterial lipopeptide

were highly homogeneous and had good stability and low viscosity. It also

significantly enhanced the inhibitory effect on S. aureus and E. coli. The

results indicated that adding antibacterial lipopeptide could not only solve

the gathering phenomenon in the preparation of the CCN but also

improve its antibacterial effect.%利用抗菌脂肽解决羧甲基壳聚糖纳米粒制备过

程中出现的团聚问题,并考察其对羧甲基壳聚糖纳米粒的抑菌效果影响.通过抗菌脂

肽乳化分散离子交联法制备羧甲基壳聚糖纳米粒,静置观察其稳定性,乌氏粘度计测

定其粘度变化,扫描电镜考察其形态改变,比浊法测定不同浓度纳米粒溶液对金黄色

葡萄球菌和大肠埃希菌的抑制作用.实验发现,加入抗菌脂肽制备的纳米粒稳定性好,

粘度降低,形态均一,并能显著增强对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑制作用.结果

表明,抗菌脂肽的加入能很好的解决纳米粒制备过程中出现的团聚现象,而且其抑菌

效果也有很大改善.

【期刊名称】《微生物学杂志》

【年(卷),期】2013(033)001

【总页数】4页(P4-7)

【关键词】抗菌脂肽;羧甲基壳聚糖;纳米粒;稳定;抑菌

【作 者】李振华;孙力军;王雅玲;王林;徐德峰;刘唤明;张永平;聂芳红

【作者单位】广东省水产品加工与安全重点实验室广东海洋大学食品科技学院,广

东湛江524088

【正文语种】中 文

【中图分类】Q539

壳聚糖是一种天然多糖中唯一的阳离子碱性氨基多糖，具有抑菌活性，安全、无毒，

可生物降解，与机体之间具有良好的生物相容性［1-2］，在食品保健、生物医药、

生物材料等工业上有着广泛的应用［3］。由于壳聚糖只溶于酸性溶液，大大地限

制了应用范围。通过改性后的羧甲基壳聚糖(CMCS)可以明显得到改善，但仍然存

在粘性大、整体分散性差等缺点，影响了其活性载体的有效性能的充分发挥。有研

究者试图将其制备成纳米级粒子来解决上述问题，取得了一定进展。目前，壳聚糖

纳米粒的制备多采用离子交联法，常用的离子交联剂是三聚磷酸钠，利用壳聚糖的

分子链上的氨基阳离子与三聚磷酸盐的阴离子通过静电作用发生分子间或分子内交

联反应，从而制备出壳聚糖纳米粒。但壳聚糖本身具有一定粘度，制备出的纳米粒

之间又会聚集在一起，使制备出的纳米粒发生团聚［4］。因此，要获得粒径小且

分散性好的颗粒，必须选择恰当的分散体系，而分散体系中乳化剂的选择起着最关

键的作用。纳豆菌抗菌脂肽(Bacillusnatto antimicrobialpeptide，BNAP)是一类

由传统发酵食品纳豆生产菌种纳豆芽胞杆菌产生的抗菌脂肽，它是一种很好的表面

活性剂，且安全无毒［5］。因此，能否将其用于解决CMCS纳米粒制备过程中出

现的团聚问题，制备稳定的CMCS纳米粒混悬液，值得进一步探索。本研究拟采

用离子交联法将纳豆菌抗菌脂肽以表面活性剂的形式乳化分散羧甲基壳聚糖，形成

均匀微囊后以三聚磷酸钠交联，制得抗菌脂肽羧甲基壳聚糖纳米粒混悬体系，考察

其均一性、稳定性和抗菌性能，旨在解决CMCS纳米粒混悬液的稳定性问题和提

高其抗菌性能。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)，广东微生物菌种保藏中心;大肠埃希

菌(AS1.487)，实验室保藏菌种，经中国科学院微生物研究所鉴定。

1.1.2 原料 羧甲基壳聚糖(脱乙酰度≥90%)，购自浙江澳兴生物科技有限公司;纳豆

菌抗菌脂肽(实验室自制)。

1.1.3 主要仪器及试剂 扫描电镜，荷兰PHILIPS公司;E22-H01-1C型磁力搅拌器，

上海创赛科学仪器有限公司;高速冷冻离心机3-18K，德国Sigma公司;Thermo

Multiskan MK3酶标仪;乌氏粘度计(0.6～0.7 mm);恒温装置。三聚磷酸钠(TPP，

分析纯)，购自厦门仁驰化工有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗菌脂肽羧甲基壳聚糖(BNAP-CMCS)纳米粒的制备 用电子天平称取80 mg

的CMCS，溶于40 mL蒸馏水中，加至锥形瓶中振荡摇匀，缓慢加入10 mg/mL

的BNAP溶液8 mL，室温下不断搅拌30 min。再逐滴加入2.5 mg/mL的TPP

溶液6 mL，继续搅拌30 min，对照组不加BNAP。将制得的胶体溶液进行冷冻

干燥。

1.2.2 稳定性观察 将制成的纳米粒配成0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%的溶液，

室温下静置1周，观察其稳定性。

1.2.3 粘度的测定 将制备好的纳米粒配置成0.1%的溶液，取25 mL于乌氏粘度计

中，置于恒温水槽中恒温10 min后，测定流出时间t，由此得出相对于同体积时

溶剂(流出出时间t0)的相对粘度η=t/t0，比较BNAP加入前后溶液相对粘度的变

化。

1.2.4 抑菌活性测定 向96孔板各孔中加入BNAP-CMCS纳米粒溶液，加入营养

肉汤培养基二倍稀释，使纳米粒最终浓度分别为0.156、0.313、0.625、1.25、

2.50、5.00、10.00 mg/mL，无菌条件下向各样品中加入20 μL制备好的金黄色

葡萄球菌与大肠埃希菌的菌悬液(107cfu/mL)，培养24 h后，取出96孔板，于

630 nm下测定培养液的吸光值，以空白培养基对照。

1.2.5 纳米颗粒形态扫描电镜观察 将制备好的BNAP-CMCS纳米粒子用超纯水离

心洗涤3次后，超声分散在超纯水中，再滴到铜网上，室温下干燥后，观察制备

出的纳米粒的形态［6］。

2 结果与分析

2.1 BNAP-CMCS纳米粒的制备

经扫描电镜观察(图1)，制备出的纳米颗粒粒径在50～100 nm之间，BNAP的加

入与否对粒径大小变化不明显，但对粒子的形态规则影响较大。CMCS制成纳米

粒后会发生聚集，加入BNAP后制备出的纳米颗粒分散性好。因为CMCS本身具

有粘性，当制备成纳米粒后，由于颗粒之间的静电作用和分子间作用力的影响又会

发生团聚，而BNAP本身亦是一种乳化剂和稳定剂，它能防止CMCS纳米粒之间

的团聚，因此制备出的纳米粒均一、分散性好。

图1 纳米粒扫描电镜图Fig.1 Scanning electron microscope images of

nanoparticlesa:CMCS纳米粒(20 000×);b:BNAP-CMCS纳米粒(20 000×)

2.2 稳定性测定

实验发现，BNAP与CMCS制成的纳米粒溶液在各浓度下均能稳定存在，不会发

生相分离现象。因为CMCS在溶液中发生解离，使大分子链带负电荷，而BNAP

是一种阴离子表面活性剂，因此，溶液体系能稳定存在。

2.3 粘度的测定

经计算，CMCS相对于水的相对粘度为1.69，CMCS纳米粒相对于水的相对粘度

为1.21，加入BNAP制备的纳米粒相对于水的相对粘度为1.12。说明通过离子交

联法制备出的CMCS纳米粒较未制纳米粒之前粘度降低，因此能制备出一定规则

的纳米颗粒，但仍有部分聚集。而加入BNAP制备的纳米粒其粘度更小，因为

BNAP是一种表面活性剂，加入BNAP使羧甲基壳聚糖溶液的表面能定向排列，

从而使其表面张力显著下降，因此使溶液和表面粘度降低。

2.4 抑菌活性测定

由图2、3可以看出，BNAP-CMCS纳米粒对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的生

长均具有很好的抑制作用。对于金黄色葡萄球菌，随着纳米粒浓度的增加，到达5

mg/mL时，菌悬液的OD值明显下降，说明BNAP-CMCS纳米粒对于金黄色葡

萄球菌的最小抑菌浓度为5 mg/mL。对于大肠埃希菌，它的抑制能力也是随着纳

米粒浓度的增加而增强，最小抑菌浓度为10 mg/mL。另外，从图2、3还可以看

出，加入BNAP制备出的纳米粒较未加前的抑菌活性有明显提高，因为加入

BNAP后体系的分散性得到很大改善，提高了CMCS的扩散能力，从而使其抑菌

性能增强。

图2 不同纳米粒浓度对金黄色葡萄球菌生长的影响Fig.2 Effect of different

nanoparticles concentration on the activity of

图3 不同纳米粒浓度对大肠埃希菌生长的影响Fig.3 Effect of different

nanoparticles concentration on the activity of

3 讨论

离子凝胶法制备CMCS纳米粒简单易行，所使用的交联剂三聚磷酸钠安全、无毒，

无需使用有机溶剂，但是制备出的纳米粒同样会发生团聚现象，这也是当今纳米技

术领域内的一个普遍关心、急待解决的问题。造成纳米颗粒团聚的原因很多，归纳

起来主要有以下几个方面:①颗粒细化到纳米级以后，其表面积累了大量的正、负

电荷，纳米颗粒的形状极不规则，这样就造成表面电荷的聚集，使纳米粒子极不稳

定;②纳米颗粒的表面积大，表面能高，处于能量不稳定状态，很容易发生聚集而

达到稳定状态;③纳米颗粒之间的距离极短，相互间的范德华引力远大于自身的重

力，因此往往相互吸引而发生团聚;④纳米颗粒之间表面氢键、化学键的作用导致

纳米粒子之间的相互吸附而发生团聚。目前，对纳米颗粒分散性及团聚控制的研究

取得了一定的进展，何强芳［7］研究了乳化剂对壳聚糖微球的影响，实验发现，

加入一定浓度的乳化剂制得的微球球形规整，分散性好，团聚问题较未加之前有很

大改善，但在后处理过程中，乳化剂的去除比较困难。

本研究采用高生物相容性的微生物表面活性剂BNAP作为分散剂，利用其在固液

界面上的吸附作用，形成一层分子膜阻碍颗粒之间相互接触，同时它还可以降低表

面张力，因此，制备出的纳米粒分散性好。而且BNAP的加入使CMCS纳米粒的

抑菌性能有很大提高。加入BNAP制备出的纳米粒不仅能解决纳米粒制备过程中

出现的团聚问题，还具有很高的抑菌活性，因此，可作为纳米抑菌的优质生物材料，

具有广阔的发展潜力。

参考文献:

【相关文献】

［1］Chung YC，Chen cterial characteristics and activity of acid-soluble

chitosan［J］.Bioresource Technol，2008，99(8):2806-2814.

［2］杨艾玲.壳聚糖研究进展［J］.山西化工，2010，30(1):30-32.

［3］Eldin MSM，Soliman EA，Hashem AI，et cterial activity of chitosan

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［4］林爱华，刘奕明，平其能.壳聚糖纳米粒表面游离氨基与纳米粒特性研究［J］.药学学报，

2007，42(3):323-328.

［5］孙力军，王雅玲，陈宏.芽孢杆菌抗菌肽应用于水产品安全控制研究展望［J］.食品与发酵工

业，2010，36(10):127-130.

［6］陈晓华.纳米材料的合成、表征及其在生物传感器中的应用［D］.华南理工大学硕士学位论文，

2010.

［7］何强芳.乳化剂对壳聚糖微球形成的影响［J］.广东教育学报，2005，25(3):67-70.