一种快速分离检测产脂肽类生物表面活性剂枯草芽孢杆菌的方法_

2024年3月12日发(作者：300字日记大全)

一种快速分离检测产脂肽类生物表面活性剂枯草芽孢杆菌的方

法

王大威;张健;姜伟;张凤久

【摘 要】脂肽(Lipopeptide)是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等微生物产生的

一类具有较强表面活性的生物表面活性剂.枯革杆菌磷酸泛酰巯基转移酶基因(afp)

是枯草芽孢杆菌中参与脂肽代谢的功能性基因.采用sfp基因PCR对从环境中得到

的一组产生表面活性剂的微生物进行筛选,结合Tricine-SDS-PAGE电泳对PCR结

果呈阳性的菌蛛的代谢粗初提物进行检测,初步鉴定得到两株枯草芽孢杆菌.进一步

利用16S rDNA序列的系统发育学分析确定这两种菌株为枯草芽孢杆菌,并利用

TLC、HPLC鉴定其产物为脂肽类表面活性剂,从而建立了一套快速分离检测产生脂

肽类生物表面活性剂的枯草芽孢杆菌方法.

【期刊名称】《生物技术通报》

【年(卷),期】2011(000)009

【总页数】5页(P142-146)

【关键词】脂肽;枯草芽孢杆菌;sfp基因;Tricine-SDS-PAGE;电泳

【作 者】王大威;张健;姜伟;张凤久

【作者单位】中海油研究总院,北京100027;海洋石油高效开发国家重点实验室,北

京100027;中海油研究总院,北京100027;海洋石油高效开发国家重点实验室,北京

100027;中国海洋石油总公司,北京100027;中国海洋石油有限公司,北京100027

【正文语种】中 文

脂肽(Lipopeptide)又名脂酰肽(Acylpeptide)，是由亲水的肽键和亲油的脂肪烃链

两部分组成的小肽，由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，脂肽类生物表面活

性剂显示了十分优良的特性，在医药、食品、化妆品、环境治理和微生物采油等领

域都有广泛的应用[1] 。大多数脂肽来源于微生物，而其中以来源于细菌的脂肽居

多。目前发现的脂肽类生物表面活性剂有10余种，主要包括Surfactin、

Lichenysin、Iturin和Fengysin等[2] 。其中表面活性素(Surfactin)是一类环状结

构的脂肽(图1)，具有良好的表面活性，能增加憎水烃类的生物可获得性，激发烃

的生物降解，与部分重金属结合能移除被污染的土壤和沉积物中的重金属;同时，

还具有特殊的生物活性，能提高尿激酶的活性，防止血液凝结。脂肽类生物表面活

性剂发现35年来，尽管相比于化学合成表面活性剂，其具有诸多优点，但目前脂

肽类表面活性剂的应用还十分有限。这主要是因为发现的产生脂肽的菌株较少，公

开报道只有20株菌株可以产生脂肽[3] 。

近年来，人们一直采用血平板法和扩油圈法筛选产生物表面活性剂的菌株，这些方

法不仅工作效率低，且不能有效将产脂肽的微生物从中区分开;同时鉴定微生物产

生的脂肽的方法一般都采用高效液相色谱(HPLC)、核磁共振(NMR)、质谱对纯化

的产物进行分析，这些检测手段对产物的纯度要求较高，但脂肽类生物表面活性剂

纯化需要经过酸化沉淀、冷冻干燥、真空抽干等繁琐的工序，费时而且效率低，因

此如何快速筛选产生脂肽类表活剂的微生物一直是困扰研究人员的主要问题。

枯草杆菌磷酸泛酰巯基转移酶基因(sfp)位于srf操纵子的下游(图2)，片段长4 kb，

是参与脂肽代谢的第二调控元件。Nakano等[4] 确定了sfp基因的核酸序列，其

编码枯草杆菌磷酸泛酰巯基转移酶(SFP)属于 4-phosphopantetheinyl

transfera超家族。Hsieh等[5] 曾报道针对sfp基因合成引物，建立快速鉴定产

脂肽的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的方法，但该方法后期同样采用传统的

HPLC(高效液相色谱)对菌株产物进行分析，在产物纯化时还是会消耗大量的时间

和人力。

考虑到采用常规方法分离纯化微生物产生的脂肽存在的诸多困难，本研究拟采用以

往蛋白质分离常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法对代谢产物进行分析。聚

丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法是分离蛋白质的常用生化方法，该方法简便、快

速、价廉、不需要对蛋白或肽类进行过多处理，并具有相对较高的分辨率，但由于

Bacillus属细菌所合成脂肽的相对分子量多在1 kD左右，为避免SDS微团对蛋白

质分离产生干扰，本研究采用80年代末由Schagger和von Jagow首创的三羟

甲基氨基甘氨酸Tris-tricine缓冲系统[6] 对脂肽进行分析。该系统可使小蛋白质-

SDS复合物与SDS微团分离，去除干扰，最小可分离1－10 kb的蛋白质，10多

年来，一直利用这种较简便的不连续梯度胶分离小分子肽。

本试验采用sfp基因PCR结合Tricine-SDSPAGE电泳拟建立一套快速分离检测

枯草芽孢杆菌及其产物脂肽的方法，减少在菌株分离和产物纯化过程中的对人力和

时间的浪费，加快分离目标菌株的进程，为今后现场筛选脂肽类表面活性剂产生菌

株提供可靠的方法。

1.1.1 菌株 10株现场分离的产生生物表面活性剂的未知菌株，标准菌株为本实验

室保存的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZW-3。

1.1.2 培养基 液体培养基用基本无机盐培养基：K2HPO4·3H2O 4.8 g，

KH2PO41.5 g，MgSO4·7 H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.2 mg，三水合柠檬酸钠

0.5 g，酵母浸出物0.1 g，氮源为1 g硫酸铵，葡萄糖为碳源，加水配成1 L溶液。

固体培养基另加2%的琼脂，121℃灭菌20 min。

1.1.3 标准品 脂肽标准品购自于Fluka(Sigma)。

1.2.1 sfp基因的PCR扩增 将初筛的菌株接种于摇瓶培养基中180 r/min 37℃振

荡培养3 d。基因组 DNA的提取参考分子克隆实验指南(第3版)[7] 。sfp基因的

PCR扩增方法参考文献[5] 。提取细菌基因组DNA，以其为模板PCR扩增sfp基

因。引物f(5'-ATGAAGATTTACGGAATTTA-3')和r(5'-

TTATAAAAGCTCTTCGTA-3')由上海生工生物工程有限公司合成。PCR体系采用

20 μL，反应体系：10×PCR 缓冲液(含 MgCl220 mmol/L)2 μL，Taq DNA 聚合

酶 0.2 μL，10 μmol/L 引物各 1 μL，DNA 模板 1 μL，去离子水 13.8 μL。PCR

扩增程序：94℃ 10 min;94℃ 1 min，46℃ 30 s，72℃ 1 min。共25个循环;72℃

10 min。PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳进行检测。

1.2.2 Tris-tricine缓冲系统丙烯酰胺凝胶电泳

参照文献[8] ，将PCR阳性菌株接种于摇瓶培养基中180 r/min 37℃振荡培养3

d，发酵液8 000 r/min离心10 min，弃菌体沉淀。制胶方法与普通Tris-Gly系

统相同，注意电泳槽内分别加入阴极和阳极电泳缓冲液，将上清液和Surfactin脂

肽标准品溶液(400 μg/mL)上样后，先在30 V恒压下电泳1 h，然后在150 V恒

压下电泳4 h，溴酚蓝前沿即可移动到离底部约0.5－1 cm，停止电泳，凝胶小心

取下后，浸入染色液中染色，而后脱色、保存。电泳后，凝胶首先经考马斯亮蓝

G-250染色液初染，再使用油红O进行了第二次染色，油红O为脂溶性染料，用

于脂类染色。

1.2.3 16S rDNA基因的序列分析 为最终确定PCR扩增呈阳性及产物经Tricine-

SDS-PAGE电泳为脂肽的目标菌株的种属，对其进行16S rDNA基因的序列分析。

以细菌基因组DNA为模板，扩增引物采用细菌通用引物B14926(5'-

CCGGATCCAGAGTTTGATCCTGGTCAGA-ACGAACGCT-3')和B14927(5'-

CGGGATCCTACGCCTACCTTGTTACG ACTTCACCC-3')(上海生工生物技术有限

公司合成)。PCR反应体系选用20 μL反应体系：10×PCR缓冲液(含 MgCl220

mmol/L)2 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL，10 μmol/L 引物各 1 μL，DNA 模板 1

μL，去离子水13.8 μL。PCR扩增程序：94℃ 10 min;94℃45 s，55℃ 60 s，72℃

70 s，共 30 个循环;72℃ 10 min。扩增的PCR产物连接到载体pMD18-

T(TaKa-Ra)上，转化 DH5α。提取有16S rDNA插入的质粒并测序，序列

测定由北京三博远志公司完成。1.2.4 脂肽薄层层析(TLC)鉴定 脂肽薄层层析方法

参照文献[9] ，将分离得到的表面活性剂样品溶解在二氯甲烷中配成溶液。取两块

活化的薄板，记为A板、B板，每块板分别点样，在氯仿∶乙酸=8∶2(V/V)中展

开10 min。挥发掉溶剂后，A板直接以茚三酮试剂(0.15%的茚三酮丙酮溶液)显

色。把B板放入耐高温的密封瓶内，瓶中预先以小杯盛约1 mL浓盐酸，110℃烘

箱中熏蒸1 h进行原位酸水解，通风橱中冷却，吹去盐酸后，以茚三酮试剂显色。

1.2.5 脂肽高效液相色谱(HPLC)鉴定 为进一步验证Tricine-SDS-PAGE电泳的有

效性和稳定性，对脂肽表面活性剂进行纯化。纯化样品采用高效液相色谱进行检测，

流动相 A(40%乙腈 +60%10 mmol/L醋酸铵，pH6.9)，流动相 B(乙腈)，进行梯

度洗脱，0－10 min内B相由10%变到25%，流动相1.0 mL/min、反相C18柱、

紫外215 nm检测即可。

sfp基因PCR产物电泳(图3)显示10株生物表面活性剂代谢菌株中，ZW-4、

ZW-8在675 bp处有条带，与正对照菌株一致，可以初步判定为枯草芽孢杆菌。

对细菌发酵液离心上清电泳后，凝胶首先经考马斯亮蓝G-250染色液初染，发现

发酵液最前沿条带呈浅蓝色，其迁移距离与Surfactin脂肽标准品相同。为了进一

步确认该条带为脂肽，经油红O染色后，原本呈浅蓝色的最前沿条带和Surfactin

脂肽都被染成红色，可确定该条带为脂肽，电泳结果如图4所示。

染色体DNA用PCR扩增出单一条带，PCR产物回收纯化后，经DNA测序，序

列长度为1 426 bp，与GenBank中现有的菌种的16S rRNA基因序列比对，进

一步确定 ZW4、ZW8菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，与sfp基因PCR

结果、Tris-tricine凝胶电泳结果吻合。

将纯化脂肽进行薄层层析，使用氯仿/乙酸为展开剂，以Surfactin标准样为对照，

层析结果如图5所示，样品与Surfactin相当，并且只呈现1个斑点，证明样品被

纯化，菌株代谢产物为脂肽(Surfactin)。

细菌发酵液经纯化后得到脂肽纯品采用HPLC与标准品进行检测。由图6可见，

脂肽经HPLC分离后出现了5个主要的峰，保留时间分别为14.386、19.982、

24.680、27.392 和28.098 min，标准品 HPLC 结果在 14.562、21.280、

24.091、29.081 和29.827 min处也各有5个峰，这5个峰可能是表面活性素

(Surfactin)的同系物，因此初步认定纯化样品中保留时间为为 14.386、19.982、

24.680、27.392和28.098 min的峰为表面活性素(Surfactin)。因此证明Tris-

tricine电泳的正确性。

脂肽的生物合成是由表面活性素合成酶基因操纵子(srf operon)复合多酶体系催化

进行的，其中，SrfA-C起硫酯酶的作用，SrfA-C-TE基因位于它的C-末端，直接

参与脂肽生物合成，其他一些研究认为sfp基因在脂肽合成中也起重要作用[10] 。

换言之，srfA-C-TE和sfp基因在脂肽的合成中都是必不可少的。所以在本研究中，

针对sfp基因序列和srfA-C-TE基因序列设计了探针，试验发现sfp基因PCR结

果相对于SrfA-C-TE基因PCR结果更加稳定，说明它是严格保守的基因序列，所

以本研究选择该段基因序列设计了一组探针。

本研究采用SDS-PAGE对细菌代谢物进行快速分离和鉴定，但脂肽分子多为1 kD

左右，而常规的Tris-甘氨酸－盐酸系统中电泳分离分子量小于10 kD的多肽效果

差。国外曾经报道了分离小分子肽的三羟甲基氨基甘氨酸(Tricine)-SDS-PAGE方

法(有效分离 1 kD小肽 Tricine-SDS-PAGE方法-1)，用Tricine代替甘氨酸作为

尾随离子，在pH8.45的浓缩胶中，它的迁移速度远远快于甘氨酸，使快慢离子间

的区域更窄，其结果是对小分子蛋白质的浓缩更有效。凝胶制作采用二层不连续胶

的结构，由致密胶+夹层胶+浓缩胶构成，静置以聚合形成三明治式的不连续梯度

凝胶。通过调整聚丙烯酞胺凝胶的分子组成后，可以改善分离脂肽的效果;同时进

一步加入尿素后，凝胶能清晰地显示1 kD的带型，可见尿素能增强分离效果。

脂肽是一类重要的生物表面活性剂。相比于化学合成表面活性剂，生物表面活性剂

具有可生物降解和低毒的特点，但目前由于生产成本，生物表面活性剂在食品、农

业化工、石油开发方面的应用还不广泛。因此，进行目前的研究有利于快速发现产

脂肽生物表面活性剂的菌种对于降低脂肽生产成本意义重大。

【相关文献】

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