植物基因工程考试总结

2024年3月9日发(作者：中国税务师)

1、名词解释部分

GFP：绿色荧光蛋白基因,利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签。

SiRNA：是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAa Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。

MAR或SAR：指被限制性内切酶消化后仍与核骨架结合的DNA序列，位于染色体的端粒附近，长度一般为30bp-1000bp，通常富含AT，两个MAR之间的染色质区域可形成大小为5kb-200kb的DNA环，构成独立的表达结构。MAR通过对染色质结构的直接限制而起作用，使转基因不能形成稳定的凝聚染色质结构，保证了转录的正常进行，使RNA酶聚合酶容易接近这种结构，从而提高了转基因的表达效率。

BIBAC：双元细菌人工染色体,使大片段外源DNA稳定整合到宿主细胞基因组中。

LHCP a/b or Cab：光诱导型启动子,在叶中具有叶绿体依赖的光诱导增强特性,在根中具有组织特异的沉默子功能.

RNA interference (RNAi)：RNA干扰,与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象，使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达。

Dicer酶：是RNA酶Ⅲ家族的一个成员。Dicer酶参与RNAi反应，广泛存在于蠕虫，果蝇，真菌，植物及哺乳动物。

RdRP：RNA合成的聚合酶，在RdRP的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增。

CAT：氯霉素乙酰转移酶基因，一种报告基因，是第1个用于检测细胞内转录活性的报告基因。

IPCR：反向PCR，它的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。

RDA：

RT-PCR：逆转录PCR,是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。

GUS：β-葡萄糖苷酸酶基因,其反应产物可用多种方法检测出来。因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中。

SSH：抑制性消减杂交，是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术，其原理是以抑制性多聚酶链反应(PCR)反应为基础的cDNA 消减杂交技术。

DDRT：传统mRNA差异显示技术，根据绝大多数真核细胞mRNA 3'端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含dT的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。将差别表达条带中的DNA回收，扩增至所需含量，进行Southernblot或Northernblot或直接测序，从而对差异条带鉴定分析，以便最终获得差异表达的目的基因。

RAD：代表性差示分析，充分发挥了PCR以指数形式扩增双链模板，而以线性形式扩增单链模板的特性，通过消减和富集，使得目的基因片段得到特异性扩增。

RdRP：RNA为模板指导RNA合成的聚合酶,在RdRP 的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增。

T-DNA标签：以T-DNA为标签，通过农杆菌转化植物，构建突变体库，获得大量具表型的突变体，根据插入片段和插入点的基因组序列和突变性状进行分离检测。是一种高通量的分离和克隆植物功能基因的方法。

NPTⅡ：编码新霉素磷酸转移酶,能赋予细胞抗卡那霉素的能力，这是核基因转化中常用的一种筛选标记。

2、简答部分

1）筛选标记基因与报告基因的比较：

筛选标记基因（Selective Marker genes）：它的基因产物能给予植物细胞产生一种抗选择压力，在选择剂存在时，转化细胞生长、发育、分化基本不受影响，而没有转化的细胞不能正常生长。

报告基因（reporter genes）：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，其表达产物非常容易被鉴定。把

它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。它的基因产物能使植物细胞带上一种标记，起报告和识别作用。

报告基因，必须具备几个条件：

(1)已被克隆和全序列已测定；

(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；

(3)其表达产物能进行定量测定。

2）一元载体和二元载体系统的比较：

双元载体（binary vecter）系统是指由两个分别含TDNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒系统,又因为其T-DNA与Vir基因在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移,故称之为反式载体（trans vecter）.

（1）一元载体系统由两个质粒重组而成，分子量大，需要整合；二元载体不需要整合过程，

（2）Mini T-DNA具有大肠杆菌复制位子，可在大肠杆菌内复制，拷贝数高，10-100倍，本身小，便于操作。

（3）一元载体构建时操作比较困难；二元载体系统操作简单。

（4）Mini-Ti质粒小，所以进入农杆菌容易，转化率高。

（5）一元载体构建好后，稳定性好；二元载体稳定性差，易丢失。

（6）二元载体系统工作效率高，转化效率高。

3）基因图谱与物理图谱的比较：

基因图谱（genetic map）：用以表示基因在一个DNA分子(染色体或质粒)上相对位置、连锁关系或物理组成(序列)的图示。

物理图谱：是把Ti质粒，用限制性内切酶处理以后，经琼脂糖凝胶电泳作片段分离，就能得出有20多条大小不同的DNA酶切片段。然后这些片段进行比较分析、测定顺序，再排列成完整的物理图，也即不同酶切片段的相对位置。物理图谱是制作Ti质粒基因图的基础。

4）顺式作用元件与反式作用因子：

顺式作用元件：是指与结构基因串联的特定DNA序列，是转录因子的结合位点，它们通过与转录因子结合而调控基因转录的精确起始和转录效率。主要组成：启动子，增强子，沉默子

反式作用因子：指由不同的染色体上基因编码的、直接或间接识别或结合各种顺式作用元件并参与调控基因转录效率的结合蛋白。也称为转录因子。反式作用因子有两个重要的功能结构域:DNA结合结构域和转录活化结构域,它们是其发挥转录调控功能的必需结构。

顺式作用元件（cis-actingelement）存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，它们的作用是参与基因表达的调控，本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子相互作用而起作用。转录因子的作用机制有3种：转录因子结合RNA聚合酶II形成起始复合物，并与启动子的TATA框元件结合启动转录过程；转录因子可以使DNA形成环状，将远处的顺式作用元件拉到起始部位；多个转录因子的组合效应决定了转录起始的速率。

5）启动子：确保转录精确而有效地起始的DNA序列，主要包括：TATA box –25~-35 （负责转录起始的精确性），CAAT box和 GC box –80~-110 ( 控制转录起始频率）

增强子：增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都发挥作用。其功能是通过结合特定的转录因子或影响DNA的构象而实现的。增强子作用的三个特点：1.它与启动子的相对位置和取向无关，具有远程效应

2.需要特定的蛋白质因子的参与3.有些（如SV40的增强子)能在几乎所有类型细胞中发挥

作用，而大多数具有相对的组织特异性

增强子和启动子均为表达调控的瞬时作用元件，启动子是转录起始位点上游与RNA聚合酶结合的一段DNA序列，增强子是通过启动子来增加转录的，他的位置不固定可以在启动子下游或上游。

6）酵母双杂交系统：是将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子(如GAL4等)的DNA结合结构域基因和GAL4激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质

相互作用的系统。

Ac-Ds双系统法：该方法利用Ds转座子在Ac转座子的编码的转位酶作用下插入到某个基因中导致其功能失活，得到稳定的形态变异植株后，用IPCR方法扩增与Ds相邻的植物DNA片段并用之扩增相应的基因。

酵母双杂交系统可以根据兴趣蛋白的基因序列即可筛选与其作用的目的蛋白，也可以直接获得目的蛋白的基因序列，从而可以初步判断目的蛋白的结构和功能。还可以检测两种蛋白质的瞬时作用。Ac-Ds系统则可以根据表型的突变来寻找相应的目的基因，不需要知道目标基因结构信息。

7）基因组文库：用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA，可以得到大量的基因组DNA片段并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。

CDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。

cDNA文库具有组织细胞特异性，cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。

3、论述题：

1、植物原生质体转化系统的方法，优缺点和局限性。

2、外源基因在转基因植物细胞内的表达调控

3、根据功能蛋白分离目的基因的技术路线

步骤：

一、分离纯化功能蛋白

1首先从组织或细胞中把蛋白质溶解出来,与杂蛋白分离后根据蛋白质的分子量大小、溶解度、电荷、吸附性质、对配体分子的生物学亲和力等进一步分离纯化。方法有透析、密度梯度离心、凝胶过滤、等电点沉淀、盐溶盐析、等电聚焦电泳（IEF）、SDS—PAGF、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等。

二、氨基酸序列分析

策略为：1测定多肽链的数目

2多肽链、或亚基的拆分

3肽链氨基酸组分测定

4多肽链的部分断裂（Ｅｄｍａｎ化学降解法、酶裂解法）和肽段的分离

5肽段氨基酸序列测定（Ｅｄｍａｎ化学降解法、酶解法、质谱法、氨基酸自动测序仪测序法）

6肽段在多肽中次序的决定

一般用两种以上方法断裂多肽，做成两套或几套肽段，这两套或几套肽段的切口是彼此错位的

7二硫键位置的确定

三、基因分离

方法有：

１根据已知氨基酸序列设计简并性ＰＣＲ引物从植物基因组中克隆出目的基因２根据氨基酸序列设计寡聚核苷酸探针筛选基因组或ｃＤＮＡ文库

３免疫学法筛选表达文库

ａ根据已纯化蛋白制备相应的抗体

ｂ构建表达型基因文库或ｃＤＮＡ文库

ｃ利用抗体筛选表达文库找出阳性克隆

4、根据mRNA分离目的基因

1 mRNA differential display PCR （ DDRT PCR ）：mRNA 差式显示

原理：通过反转录与PCR扩增mRNA中特定的一小部分。用DNA序列分析胶同步分离显示扩增产物以进行比较。首先以3端锚定引物（5-TMN- 其中T为10-20个，M为Ａ／Ｃ／Ｇ，Ｎ为Ａ／Ｔ／Ｃ／Ｇ）进行逆转录，之后以单链cDNA为模板进行PCR，3端引物即为上述锚定引物，5端引物为10-13bt的随机引物，5端引物较短，特异性较低，能以相对较高的机率与cDNA 5端结合，从而保证每一对引物都能扩增出适当数量的DNA片段（约50-150条）。通过12个3端引物和25个5端引物的不同组合，可在95%的情况下分析15000个不同的基因，基本包括单个细胞所能表达的全部基因数。在细胞A中特异表达的基因，若引物合适就可能在A的PCR产物中出现而不在B的PCR产物中出现。用DNA变性测序胶分离扩增产物，X光片曝光后即可检测到差别条带，回收分析差别条带后即可以该片段做探针筛选全长cDNA 或DNA文库得到全长目的基因。

2 cDNA reprentational difference analysis cDNA ＲＤＡ

ｃＤＮＡ代表群差别分析

原理：将减法杂交和PCR扩增相结合，通过引物序列的选择使得只有特异存在于检测组中的序列能够被指数扩增，从而达到对其进行富集的目的。

RDA是近几年发展起来的一种对基因水平上的差异进行分离基因的方法。现在该法和DD－PCR法已成为分子生物学中进行基因差别分析的两个重要的方法。与差示杂交和cDNA文库突变体补偿等传统方法相比，它们具有简便迅速的优点。

3 ｃＤＮＡ substraction cDNA 差别选择

将对照材料的mRNA 逆转录成单链cDNA后与实验材料的mRNA 进行杂交，去除杂交双链，回收单链mRNA,即为试验材料中特异表达的基因

SSH：是差减杂交与PCR结合的简单、快速分离差异基因的方法。运用杂交动力学原理，即丰度高的单链DNA在退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，从而使不同

丰度的单链DNA得到均衡；抑制PCR则利用链内退火优于链间退火的优点，使非目的基因片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构, 无法作为模板与引物配

对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增，从而使目的基因得到富集、分离。

cDNA文库差别选择：改技术需要两种不同的细胞群体：在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达，制备两种不同的mRNA的提取物，其一是含有目的基因的mRNA类型的总MRNA群体，另一个是不含有目的基因mRNA的总mRNA群体，用这两种总mRNA为探针，对有目的基因的细胞mRNA构建的克隆库进行筛选，当使用存在目的基因的mRNA作探针时，所有包含重组体的菌落都呈阳性反应，在x光片下呈黑色斑点，而使用不存在目的基因的mRNA探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的都呈阳性反应，在x光片下呈黑色斑点，比较这两种底片并对照原平板，便可挑选出目的基因的菌落。

5、 关于基因沉默：

答：（1）转基因沉默现象（transgene silencing）。

是指利用遗传转化方法导入并稳定整合进受体细胞中的完整的外源基因在当代转化体或在其后代中表达受到抑制的现象。

（2）转基因沉默是由DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA 分子之间的相互作用而引起的；

根据其作用机制和水平不同可分为三种：位置效应、转录水平的基因沉默TGS和转录后水平的基因沉默PTGS；

a:位置效应：插入位点的微环境影响了外源基因启动子的活性从而导致基因沉默；

b:转录水平：具有重复序列的核酸序列相互作用使得启动子甲基化或导入基因的异染色质化，导致DNA水平的基因沉默；

c:转录后水平：即RNA水平的基因调控。有三种作用方式：①与具有同源序列的特异的靶mRNA结合导致其降解②与特定的靶mRNA的非编码序列结合导致其翻译阻断；③引起受体细胞的防御系统导致非特异性的降解

重复序列是基因沉默的普遍诱因，甲基化是基因沉默的直接原因

（3）克服基因沉默的策略：

a:转基因密码子优化及转化载体的合理修饰.;

b: 在有性生殖后代中筛选单拷贝转基因个体

c: 选择合适转化方法

d: 利用MAR或SAR

e: 去甲基化试剂5-氮胞苷的使用

(4)下面是RNAi导致基因沉默的过程：

a:siRNA的构建：包括化学合成，体外转录，长片断dsRNAs经RNa III 类降解，siRNA表达载体构建，PCR制备siRNA表达框；

b:导入，磷酸钙共沉淀法，阳离子脂质体，电击法，显微注射法等；

c:发挥作用：①双链RNA进入细胞后，Dicer酶的作用下被裂解成siRNA；②RdRP的作用下自身扩增③SiRNA的双链解开变成单链，在蛋白质的作用下与靶mRNA结合，导致其降解，或以其为模板RdRP作用下合成出mRNA的互补链，形成的双链RNA在Dicer酶作用下产生大量的siRNA④新形成的siRNA加强了基因沉默的效果。

6、 原核基因在真核细胞中表达要进行的修饰：

答：因为原核基因和真核基因在组成及表达上存在一些差异（此处可扩充），所以要使其在真核细胞中表达要进行一些修饰：

（1）采用植物基因的表达调控体系；

（2）优先使用植物偏爱的密码子.

（3）改变基因的GC 含量（36~45%），使之与植物基因

GC含量一致.

（4）. 注意XCG/XCC和XTA/XTT的比值。对植物而言，该比值低好。Thr, Pro, Ala和Ser密码子第三位避免用G。

（5）翻译起始区第4个核苷酸用G，以符合ATG GC的要求。.

（6）去除隐含的poly（A）信号。.

（7）去除隐含的RNA聚合酶II终止序列。CAN1~9AGTNNAA.

（8）清除发夹环结构。CUUCGG

（9）消除隐含的内含子剪切序列AAG GTAAGT等