抑菌实验步骤

2024年3月6日发(作者：好习惯)

抑菌实验：待测菌金色葡萄球菌；枯草芽孢杆菌；大肠杆菌；绿脓杆菌

菌种活化：菌种，进行活化，可以划线，也可以涂布，

划线：直接用接种环在酒精灯上烧过之后，等之冷却，蘸取进行划线！

涂布：用枪头吸取100ul的菌液涂布既可！本实验采用涂布法

1.金色葡萄球菌最佳生长条件(过夜培养一般为12h)

2. 枯草芽孢杆菌培养条件（过夜培养）

3.绿脓杆菌最佳培养条件（14-17h）

培养基

MH（A）培养基( Mueller-Hinton Agar)成分：牛肉浸粉（牛肉膏） 5g；酪蛋白水解物 17.5g；淀粉 1.5g；琼脂 12.5g

MH液体培养基配制方法：称取本品36.5克，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。

牛肉膏蛋白胨固体培养基（LB培养基）：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，琼脂15g，NaCl 5 g，双蒸水1000mL，pH 7.2-7.5，121℃灭菌20min。

牛肉膏蛋白胨液体培养基：不加琼脂，其他同牛肉膏蛋白胨固体培养基。

菌悬液的配制

将冰箱保存的大肠杆菌移接到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养24 h，用接种环挑取少许菌体与装有无菌生理盐水的试管中，震荡均匀，制成菌悬液。具体为用接种环挑取一环（本实验是吸取100uL菌悬液）于5 mL的无菌生理盐水中，每10倍稀释一次地逐级稀释，取（10-8、10-9、10-10 、10-11）的浓度100μL做涂布实验，每个梯度平行三组，加100μL药品溶剂（二甲基亚砜）的空白对照3个平板，完全不加任何样品即只是LB培养基的完全空白对照1个平板，调整菌悬液浓度，用平板菌落法测定其菌液浓度，使其含菌体数为103 cfu/mL，即为供试菌悬液。

抑菌作用初步筛选

将灭菌固体培养基加热至熔化，待冷却至50℃时，每20ml培养基倒入无菌培养皿中。待平板自然晾干后，分别移取0.1ml待测药品，0.1 mL供试菌悬液，均匀涂布于加药平板上，每个处理3次重复。(涂布30min后再倒置)另设置对照组，涂菌，以等量无菌水（溶解药品物质）代替药液。上述操作在超净工作台内进行。将做好的细菌平板在37℃恒温培养24 h，统计菌落个数，按照下式计算抑菌率。

抑菌率对照菌落数处理菌落数100%

对照菌落数实验结果表示为：平均数±标准误差（Mean±SDE）。

菌种活化：37℃培养；约24H

挑取两环于50ml 液体培养基上活化：先恒温150r/min震荡12h,再静置培养8-12h。达到稳定期后，4度保藏，备用。

生理盐水：8.5gNaCl加入到1000ml 蒸馏水中，121度高压蒸汽灭菌15-20min即可。