用牛肉膏和蛋白胨固体培养基进行大肠杆菌的纯化培养

2024年3月6日发(作者：三原色三间色)

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用牛肉膏和蛋白胨固体培养基进行大肠杆菌的纯化培养，包括两大阶段：

⑴制备牛肉高蛋白胨固体培养基

①计算：根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的比例，计算配制100ml培养基中各种成分的用量。

②称量：准确称取各种成分。

③溶化：将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯，加入少量的水，加热；

当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸；

箱烧杯中加入称量好的蛋白胨和氯化钠，玻璃棒搅拌，使其溶解；

加入琼脂，加热使其熔化。持续搅拌防止糊底导致烧杯破裂；

当琼脂完全熔化，补加自来水至100ml。

④灭菌：将配置好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，用皮筋勒紧，放入高压灭菌锅，压力为100KPa，温度为121℃，灭菌15～30min。

将培养皿用几层旧报纸包紧，5～8套培养皿一包，放入干热灭菌箱，160～170℃灭菌2h。

⑤倒平板：待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。

倒平板操作步骤：

A．将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞；

B．右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰；

C．用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10～20ml）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖；

D．等待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置，使皿盖在下、皿底在上。

小资料：牛肉膏蛋白胨固体培养基配方

成分

牛肉膏

蛋白胨

NaCl

琼脂

含量

5.0g

10.0g

5.0g

20.0g

提供的主要营养

碳源、磷酸盐、维生素

氮源、维生素

无机盐

承载物

⑵纯化大肠杆菌

①微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布法；还包括斜面接种、穿刺接种等方法。尽管操作方法各有不同，其核心都是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。

②平板划线法就是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。

（在数次划线后，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体——菌落。）

平板划线法操作步骤：

A．将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红；

B．在火焰胖冷却接种环，并打开棉塞；

C．将试管口通过火焰；

D．将已经冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液；

E．将试管口通过火焰，并塞上棉塞。

F．左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。（注意：不要划破培养基）

G．灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线，重复以上操作，在第三、四、五区域内划线。（注意：不要将最后一区的划线与第一区相连）

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H．将平板倒置，放入培养箱中培养。

③什么是稀释涂布法？

将菌液经过一系列的梯度稀释，然后将不同浓度的菌液分别涂布到培养基的表面进行培养。

（在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落）

稀释涂布法操作步骤：

A．将分别盛有9ml水的6支试管灭菌，并按10-1～10-6的顺序进行编号；

B．用移液管吸取1ml培养的菌液，注入10-1倍稀释液的试管中。

用手指轻压移液管的橡皮，吹吸三次使菌液与水充分混合。

C．从10-1倍稀释液的试管中吸取1ml培养的菌液，注入10-2倍稀释液的试管中。

重读进行，以此类推，直到完成最后一支试管的稀释。

注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2cm处。

涂布平板操作步骤：

A．将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中；

B．取少量菌液（不超过0.1ml），滴加到培养基表面；

C．将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s；

D．用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。

涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。

注意：将涂布器末端浸在盛有体积分数为70%的酒精的烧杯中，取出时，要让多于的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。

操作中一定要注意防火！不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。

将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37℃恒温箱中，培养12h和24h后，分别观察并记录结果。

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