牛肉膏蛋白胨培养基 接种等

2024年3月6日发(作者：月夜古诗杜甫)

实验一 培养基的制备

一、目的与要求

（一）学习制备培养基的基本技术。

（二）制备牛肉膏蛋白琼脂培养基。

二、原理

牛肉膏蛋白培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌培养基，这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，可供作繁殖之用，制作固体培养基时须加2%琼脂，培养细菌时，应用稀酸或稀碱将PH调至中性或微碱性。牛肉膏蛋白培养基的配方：

牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，pH7.4～7.6。

三、材料与仪器

（一）试剂 牛肉膏，蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。

(二)其他 试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，漏斗，乳胶管，弹簧夹，纱布，棉花，牛皮纸，线绳，pH试纸，电炉，台称。

四、操作步骤

（一）称量 根据用量按比例依次称取成分，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，蛋白胨易吸湿，称量时要迅速。

（二）溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，加热，ZHU一加入各成分，使其溶解，琼脂在溶液煮沸后加入，融化过程需不断搅拌。加热时应注意火力，勿使培养基烧焦或溢出。溶好后，补足所需水分。

（三）调PH 用1mol/L NaOH或1mol/L HCl把PH调至所需范围。

（四）过滤 趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察，如无特殊要求时可省去此步骤。

（五）分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三解瓶内，分装装置如实验图8所示；分装时注意，勿使培养基沾染在容器口上，以免沾染棉塞引起污染。

1．液体分装 分装高度以试管高度的1/4左右为宜，分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的1/2为宜。

2．固体分装 分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，斜面长度不超过管长的1/2。分装三解瓶，以不超过容积的1/2为宜。

3．半固体分装 装置以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。

（六）加棉塞 分装完毕后，在试管口或三解瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等，以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性能。

（七）包扎 棉塞头上包一层牛皮纸，扎紧，即可进行灭菌。

（八）保存 灭菌后的培养基放入37℃养箱中培养24小时，以检验灭菌的效果，无污染方可使用。

五、实验报告

（一）结果 说明你配制培养基过程中的情况。

（二）思考题

1．培养基配制时应注意什么问题？为什么？

2．分装培养基时为什么要使用弹簧夹？

3．培养基配好后，为什么要立即灭菌？

实验二 消毒与灭菌

一、目的与要求

了解干热灭菌及高压蒸汽灭菌的操作方法。

二、原理

干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白凝固变性而达到灭菌的目的，细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白凝固越快，反之含水量越小凝固越慢。因此与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160～170℃），时间长（1～2h）。高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放入一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾产生蒸汽，水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于水蒸汽不能溢出而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点升高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

一般培养基用0.1MPa、121.1℃.

15～30min可达到彻底灭菌,灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变.

三、材料与仪器

吸管、培养皿、试管、电热干燥箱，手提试高压蒸汽灭锅，牛肉膏蛋白胨培养基、蒸馏水。

四、操作步骤

（一）干热灭菌法 适用于空的、干燥的玻璃器皿的灭菌。培养基不适用。

1．将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电热干燥箱（注意留有一定的间隙），关好箱门。

2．接通电源，打开排气孔，使箱内湿空气能逸出，旋动恒温调节器，保持加热升温状态，至箱内达到100℃时关闭排气孔。

3．当温度升到160～170℃时，借恒温调节器的自动控制，保持此温度2h。

4．切断电源，冷却至70℃时，打开箱门，取出灭菌物品（未降至70度以前，切勿打开箱门，否则温度骤降导致玻璃器皿炸裂）。

（二）高压蒸汽灭菌

1．首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角架相平为宜。

2．放回内层锅，并装入待灭菌物品（内装培养基或小的三角瓶），不要装得太挤，以免妨碍汽流通影响灭菌效果，三角瓶口不要与桶壁接触，以免冷凝水淋温包口的纸而透入棉塞。加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个棉栓，使螺栓松紧一致，，勿使漏气。

3．用电炉或其他方法加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气，待冷空气排尽后，关上排气阀让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内达到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。

4．停止加热，待压力表的压力降至零位时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

注意：当压力不为零时，不能开盖取物否则由于压力突然下降，容器内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染而发生污染，甚至灼伤操作者。

5．高压灭菌锅上的安全阀，是保障安全使用的重要机构，不得随意调节。

五、实验报告

（一）结果 检杳灭菌是否彻底。

（二）思考题

1．干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？

2．为什么干热灭菌所需温度要比湿热灭菌高？

3．高压蒸汽灭菌时，为什么要排尽锅内的空气？

实验三 接种和纯化

一、目的与要求

（一）掌握微生物各种接种、分离方法。

（二）掌握无菌操作的基本环节。

（三）完成一定数量的微生物接种任务。

二、原理

在自然界中，各种微生物是在互为依赖的关系下共同生活的。因此，为了取出特定的微生物进行纯培养，必须把它们分离出来。将一种微生物移到另一种灭菌的培养基上称为接种。

分离培养微生物时，要考虑微生物对外界的物理、化学等因素的影响。即选择该类微生物最适合的培养基和培养条件。在分离、接种、培养过程中，均需严格的无菌操作，防止杂菌侵入，所用的器具必须经过灭菌，接种工具无论使用前后都要经过火焰灭菌，且在无菌室或无菌箱中进行。

三、材料与仪器

（一）菌种

大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、青霉菌

（二）缓冲葡萄糖肉汤培养基试管垂直；缓冲葡萄糖肉汤半固体培养基试管垂直；缓冲葡萄糖肉汤固体培养基试管斜面；缓冲葡萄糖肉汤固体培养基平板；察氏培养基试管斜面；察氏培养基平板。

（三）接种环、接种针、接种钩。镊子、酒精灯、火柴、酒精棉、试管架、浆糊、标签纸、恒温培养箱等。

四、操作方法

（一）接种

1．接种前的准备工作

（1）检查接种工具。

（2）在欲接种的培养基试管或平板上贴好标签，标上接咱的菌名、操作者、接种日期等。

（3）将培养基、接种工具和其他用品全部放在实验台上摆好，进行环境消毒。

2．接种方法

（1）试管接种方法

①将菌种试管与待接种的试管培养基依次排列，挟于左手的拇指与食指之间，用右手的中指与食指或食指与小指拔出棉塞并挟出。

②置试管口于酒精火焰附近；

③将接种工具垂直插入酒精火焰中烧红，再横过火焰三次，然后再放入有菌试管壁内，于无菌的培养基表面待其冷却。

④用接种工具取少许菌种置于另一支试管中，按一定的接种方式把菌种接种到新的培养基上。

⑤取出接种工具，试管口和棉塞进行火焰灭菌。

⑥重新塞上棉塞。

⑦烧死接种工具上残留余菌，把试管和接种工具放回原处。

（2）试管菌种接到平板培养基的方法

①左手持平板和试管菌种，右手松动试管试管棉塞，烧接种工具。

②右手小指与四指取下棉塞，取菌，打开平皿。

③将菌种接种到平皿上，立即盖上平皿。

④酒精灯火焰上烧接种工具灭菌

⑤棉塞过火，重新塞上试管。

（二）分离

分离微生物的方法很多，其目的都是把混杂的微生物分离为单个细胞使其生长繁殖，形成单个菌落，以便得到纯菌种。

本实验以平板划线法分离。

1．在无菌的条件下，分别取一接种环酵母菌和青霉菌放入盛有无无菌水的试管中，制混合菌液。

2．在近火焰处，左手拿平板稍抬皿盖，右手持接种环蘸取一环混合液伸入皿内划线。

（三）培养

1．将接种的细菌培养基放在32～37℃恒温箱内培养24h后观察。

2。将接种分离后的酵母菌和霉菌放在25～28℃的恒温箱内，酵母菌培养48h，霉菌培养72h后观察。

3．平板培养基置于恒温箱内倒置培养。

五、实验报告

（一）结果

将实验结果填于下表：

实验表 接种情况

菌名

培养基名称

生长情况

接种方法

有无污染及原因

实验表 分离情况记录表

菌名

（二）思考题

1．为什么从事微生物实验工作的最基本要求是无菌操作？

2．指出你所分离的平板上单个菌落分属于哪种微生物类群，并简述它们的菌落形态特征。

3．大肠杆菌接种于葡萄糖肉汤培养基内培养24小时后，会出现什么情况？

培养基名称

有无单个菌落 有无污染情况

实验四 普通光学显微镜的构造和使用

一、目的与要求

（一）学习普通光学显微镜的结构、各部分功能及使用方法。

（二）学习并掌握油镜的原理工科使用方法。

二、原理

普通光学显微镱由机械装置和光学系统2大部分构成。在光学系统中，物镱的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜中配置的几种物镱以油镱的放大倍数最大，与其它物镜相比，使用较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，以增加照明亮度和提高分辨率。

三、材料与仪器

（一）菌种 金黄色葡萄球菌及枯草杆菌染色玻片标本，啤酒酵母水浸片。

（二）其他 香柏油、二甲苯、显微镱、擦镜纸。

四、操作步骤

（一）显微镜的安置 置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘3～4cm，镱检时姿势要端正。

（二）调节光源 安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镱采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或平面反光镜度调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。

（三）低倍镜观察 将标本玻片置于载物台上，用标本夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方，下降10×物镜，使其接过标本，用粗调节器（粗调螺旋）慢慢升起镜筒，出现图像后再用细调节器（细调螺旋）调节图像至清晰。通过标本夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适目的物，仔细观察。

（四）高倍镜观察 在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置，以聚光镜器光圈及视野进行适当调节后微调细调节器使物象清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录。

（五）油镜观察 在低倍镜或高倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高约2厘米，然后在待观察区域滴加1—2滴香柏油，将油镜转到工作位置，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接，将聚光器升至最高位置并开足光圈，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物象并用细调节器使其清晰为止。

（六）显微镜用后处理

1、上升镜筒，取下载片。

2、用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上残留的油迹，然后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。

3、用擦镜纸清洁其他物镜和目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。

4、将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八字形”再向下旋，同时把聚光镜降下，以免物镜与聚光镜发生碰撞危险。

五、实验报告

（一）结果 分别绘出在不同物镜下观察到的不同的菌种的形态，同时注明放大倍数。

（二）思考题

1．油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？

2．显微镜中调节光线强弱的装置有哪些？

实验五 细菌的革兰氏染色

一、目的要求

了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。

二、基本原理

革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal

violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。

三、器材

大肠杆菌，金黄色葡萄球菌；草酸铵结晶紫，番水水溶液，碘液，95%乙醇，载玻片，显微镜等。

四、操作步骤

1．涂片将培养24小时的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1～2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

2．染色

（1）初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。

（2）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。

（3）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20～30秒钟，立即用水冲净酒精。

（4）复染用番红液染1～2分钟，水洗。

（5）镜检干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合制片，作革兰氏染色对比。

革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。

五、实验报告

1．结果

在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各染成何色？它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌

2．思考题

P30 思考题1、2、4

（1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？

（2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？

六、实验总结

实验六 酵母菌及子囊孢子的形态观察

一、目的要求

１、观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式。

２、学习并掌握酵母菌子囊孢子的观察方法。

二、基本原理

酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化，菌体比细菌大。繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。

酵母菌的子囊孢子生成与否及其形状，是酵母分类上的重要依据。一部分酵母菌只有当它在最适条件下，才能观察到形成的子囊孢子，不同种属的酵母菌，形成子囊孢子的条件不同。葡萄糖-醋酸盐培养基特别有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。本实验用生长在此培养基上的酿酒酵母为材料，进行子囊孢子的观察。

三、器材

酿酒酵母装片；酿酒酵母；吕氏碱性美蓝染液，石炭酸复红染液，3％的酸性酒精，孔雀绿芽孢染液，麦芽汁琼脂斜面培养基，葡萄糖-醋酸盐培养基等；显微镜。

四、操作步骤

一）酵母菌的形态观察

二）酵母菌子囊孢子的观察

1．将酿酒酵母先移种到新鲜麦芽汁琼脂斜面上，25℃培养24小时左右。如此活化二次后，备用。

2．用接种环取活化后的培养物，接种到葡萄糖-醋酸盐斜面上，25℃培养二周左右。

3．用接种环挑取少许生长在葡萄糖-醋酸盐培养基上的酿酒酵母于载玻片上，制成涂片，干燥、固定。

4．用两种方法进行染色。一种方法是加石炭酸复红染液于固定涂片处，在火焰上加热5—10分钟（不能沸腾），用酸性酒精冲洗30—60秒钟，再用水洗去酒精，加吕氏碱性美蓝染液数滴，数秒钟后用水洗去，水干后置显微镜下观察，结果孢子为赤色，菌体为青色；另一种方法是用孔雀绿芽孢染液进行染色，但无需加热，干后置油镜下观察子囊孢子。

1.菌落观察

①取啤酒酵母、假酵母菌以三点点植法接种于麦芽汁平板培养基上，置于28～30℃下培养3天，形成菌落。

②观察菌落表面、高度、边缘、质地和颜色等方面的特点。

2.观察出芽生殖

①在载玻片上滴1滴蒸馏水，挑取少量啤酒酵母放入蒸馏水中，盖好盖玻片，制成临时装片（注意不要产生气泡）。

②观察菌体细胞的大小与出芽方式。

五、实验报告

1、结果：

（1）绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征。

（2）绘图说明你所观察到的酵母菌子囊孢子的形态特征。

2、思考题

六、实验总结

实验七 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定

一、实验目的

1.观察酵母菌的形态特征、出芽生殖方式，并掌握酵母菌与细菌形态特征的区别。

2.学习鉴别死活细胞的实验方法。

二、实验原理

酵母菌是单细胞的真核微生物，菌体比细菌大而且不运动。酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种，以无性繁殖为主。芽殖是酵母菌普遍的无性繁殖方式，少数为裂殖；有性繁殖是产生子囊和子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和芽殖方式。

美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。

三、试剂与器材

1.材料 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或卡尔酵母(Saccharomyces

calsbergensis)培养2天左右的麦芽汁(或豆芽汁)液体培养物。

2.试剂 0.05％和O.1％吕氏碱性美蓝染色液、革兰氏染色用的碘液。

3.器材 显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、洒精灯等。

四、实验内容

1.美蓝浸片观察 酵母培养→制片→染色→镜检→30分钟后再镜检

2.水-碘浸片观察

五、关键步骤及注意事项

1.染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液溢出或出现大量气泡。

2.用镊子取一块盖玻片，先将一侧与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下，使其盖在菌液

上，盖玻片不宜平着放下，避免气泡产生。

六、思考题

1.吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响?试分析其原因。

2.在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌?

实验八 微生物细胞大小测定和微生物的数量测定

一、微生物的显微直接计数法

（一）实验目的

掌握显微镜下直接计数的技能。

二、实验原理

测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。

显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof

Hausr）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。

血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图21-1），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。

计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。

使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。

已知：1mm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3

所以：1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K=4×106 。

因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d）

三、实验器材

1．活材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培养液。

2．器材：显微镜、血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。

四、实验方法

1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2），以每小格的菌数可数为度。

2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。

3．将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。4．静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。

5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。

7．测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。

五、实验作业 将实验结果填入下表中：

计数次数 每个大方格菌数

1

第一次

第二次

二、微生物细胞大小的测定

（一）实验目的了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理，掌握微生物细胞大小的测定方法。

（二）实验原理

2

3

4

5

稀 释

倍 数

试管斜面中的平均值

总菌数

微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。

目镜测微尺（图20-1）是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10

mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。

镜台测微尺（图20-2）是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，

图 20-1目镜测微尺

由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。

（三）、实验器材

1．活材料：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)斜面菌种、枯草杆菌(Baccillus subtilis)染色标本片。

2．器材：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、盖玻片、载玻片、滴管、双层瓶、擦镜纸。

（四）、实验方法

1．目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野

中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度(图20-3)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长l0μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。

例如目镜测微尺5小格正好与镜台测微尺5小格重叠，已知镜台测微尺每小格为l0μm，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/5＝10μm

用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。

由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。

2．细胞大小的测定

(1)将酵母菌斜面制成一定浓度的菌悬液（10-2）

(2)取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。

(3)移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定10—20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。

（4）同法用油镜测定枯草杆菌染色标本的长和宽。

（五）、实验作业：

将实验结果填入下列表格

表20-1 目镜测微目尺校正结果

物镜 目尺格数 台尺格数 目尺校正值（μm）

10×

40×

100×

表20-2 酵母菌大小测定记录 （格）

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 平均值

长

宽

表20-3 枯草杆菌大小测定记录 （格）

细胞数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 平均值

长

宽

结果计算 长μm＝平均格数×校正值

宽μm＝平均格数×校正值

大小表示：宽μm×长μm

六、实验总结

实验九 土壤中微生物分离纯化培养

一、实验目的

掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。

二、实验原理

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法 稀释涂布平板法步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。

三、试剂与器材

1.器材 盛9m1无菌水的试管、盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。

2.试剂 牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，查氏培养基

四、实验内容

1.土壤稀释液的制备

2.微生物分离纯化：稀释涂平板法，平皿划线分离法，微生物培养技术

五、关键步骤及注意事项

1.掌握含菌培养基的配制，严格控制温度。

2.平板划线应防止染菌，同时应注意划线深度及密度。

六、思考题

1.如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养?请写出实验的主要步骤。

2.如果要分离得到极端嗜盐细菌，在什么地方取样品为宜?并说明理由。

实验十 淀粉酶产生菌的筛选

一、实验目的

1）设计淀粉酶产生菌检出方案。

2）学习淀粉酶产生菌的筛选方法。

二、实验用品

菌种：

黑曲霉（Pr3）；枯草杆菌(7658)；

卡尔丝酵母(2604)

其它：

察氏培养基；无菌培养皿；碘液

三、实验原理

淀粉酶产生菌向胞外产生淀粉酶，使淀粉分解成麦芽糖。

利用淀粉遇碘变蓝的特性进行检测

四、实验方法

 1）配制察氏培养基

 2）制作平板

 3）在三个不同区域接入三种菌，进行培养

 4）菌长好后，加入碘液，进行观察

五、实验结果

菌种 黑曲霉

（Pr3）

透明圈

（有无、大小）

䦋㌌㏒㧀좈໱ 䦋㌌㏒㧀좈໱琰 䦋㌌㏒㧀좈໱琰琰茞໱㵂Ü 茞໱㵂Ü 茞໱㵂Ü

枯草杆菌(7658) 卡尔丝酵母(2604)

六、思考题

1.说明透明圈产生的原因。

2.如何判断产淀粉能力的强弱？