基于分子学学角度探讨无尾目分类

2024年2月20日发(作者：辅导员培训心得)

XXXX大学

作业题目： 线粒体基因探讨无尾目的分类研究进展

课程名称： 动物分类学

任课教师姓名： XXXXX

研究生姓名： XXXXX

学 号： XXXXXXXX

年 级： 2010级

专 业： 动 物 学

学院（部、所）： 生命科学学院

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任课教师签名：

年 月 日

线粒体基因探讨无尾目的分类研究进展

摘 要：运用PCR技术和相关生物软件，对大头蛙Limnonectes kuhlii和脆皮大头蛙Limnonectes fragilis的线粒体CO I基因全序列进行了测定与分析．结合GenBank上已公布的无尾目1O个科22个物种的同源序列，以爬行纲楔齿蜥Spkenodon punctatus和密河鳄Alligator m ss厶s 如，2s厶为外群，基于核苷酸序列(选取前两位密码子)和氨基酸序列两种数据形式，分别构建NJ树和MP树．结果表明：系统树将无尾目1O个科分为两大支，一支为新蛙亚目Neobatrachia的5科15个物种，一支为古蛙亚目Archaeobatrachia的5个科9个物种(其中包括锄足蟾科Pelobatidae和负子蟾科Pipidae)，并推测这两个亚目均为单系群．古蛙亚目一支内的盘舌蟾科Discoglossidae与铃蟾科Bombinatoridae亲缘关系较近；新蛙亚目内蟾蜍科Bufonidae与雨蛙科Hylidae，蛙科Ranidae与树蛙科Rhacophoridae两两亲缘关系较近．蛙科中泽陆蛙Fejervarya limnocharis与大头蛙属3个种首先形成姐妹群，表明其较近的亲缘关系，同时推断大头蛙与福建大头蛙Limnonectes fujianensis亲缘关系近于脆皮大头蛙．

关 键词：大头蛙；脆皮大头蛙；CO I基因；无尾目；系统关系

目前，两栖动物的分类和保护工作一直是国际野生动物保护的热点。由于人们对两栖类资源的过度利用和捕杀，加之生境破坏，栖息地减少，造成野外种群数量逐渐减少，尤其是两栖类无尾目动物的保护现状更加严峻，例如：棘胸蛙已被列入濒危动物红皮书，而虎纹蛙在野外多年没有报道。

1.无尾目的分类进展

现存两栖动物(Lissamphibians)分为形态迥异的3个目，即无尾目(Anura)、有尾目(Caudata)和蚓螈目(Gymnophiona)．无尾目是其中最大的一个目(占88 左右)，已知现有29个科5 449个物种，广泛分布于全球(到2007年6月17日为止，分布于中国的330多种两栖动物中有无尾目290种左右，隶属7个科 ]．Reig 最初依据形态学特征将无尾目分为始蛙亚目(Archaeobatrachia)和新蛙亚目(Neobatrachia)两大类(或称古蛙类和新蛙类)．此后Laurent 将锄足蟾科(Pelobatidae)、负子蟾科(Pipidae)、异舌蟾科(Rhinophrynidae)和潜蟾科(Pelodytidae)从始蛙亚目中的分离出来建立了一个过渡类群—— 中蛙亚目(Mesobatrachia)．通过进一步的形态学研究，1993年Ford和Cannatella 将新蛙亚目和中蛙亚目作为姐妹群而一起归为Pipanura，并否定了始蛙亚目(包括，尾蟾科Ascaphidae，滑踱蟾科Leiopel—matidae，铃蟾科Bombinatoridae和盘舌蟾科(Disco—glossidae)这一单系类群．20世纪90年代以后，分子系统学研究成为动物进化研究的热点之一，在无尾目内不同谱系间系统发生关系的问题上，国内

外学者进行了大量的研究，然而，对于无尾目各科间的系统关系至今还没有统一的意见．能快速进化并呈母系遗传的线粒体DNA，是无尾目动物分类和保护工作中经常利用的分子信息。在大多数脊椎动物中，线粒体DNA在进化上十分保守，多数物种均含有37个基因，包括编码12SrRNA、16SrRNA 2个RNA的编码基因；细胞色素c氧化酶亚单位基因CO1、COIl、COlll、ATP酶亚单位6、8和细胞色素b的基因及7个呼吸链NADH脱氢酶亚单位基因ND1、ND2，ND3、ND4L、ND4、ND5和ND6等13个蛋白质编码基因，以及22个为tRNA基因，这些基因的排列顺序在脊椎动物中是十分保守的。但是在无尾目动物中，由于线粒体基因组的演化速度较其它动物快，所以常发生基因重排现象；尤其在高等的新蛙亚目中，目前的研究表明，线粒体基因的重新排列是一种很常见的现象。无尾目动物线粒体基因组结构研究现状自从2001年Sumida等分析了黑斑蛙(Rana nigromaculata)的线粒体全序列，并首次发现D—loop区附近有四个tRNA发生了交换与重排以来，越来越多的不同于典型的脊椎动物的线粒体结构在无尾目动物中被发现。2004年Sano等分析了树蛙科卡吉卡蛙的线粒体全序列，结果表明D—loop区附近的四种tRNA基因发生重合，形成ND5tRNALel/tRNAThr／tRNAPm，tRNAPhe／l 2S的基因簇，除此之外，还发现其基因组中蛋白质编码基因ND5发生了移位圈。2005年Liu Z Q等分析了泽蛙的线粒体基因排列，发现一种新的脊椎动物线粒体排列方式。D—loop区附近的几种tRNA基因重排,形成ND5，tRNAThr／tRNAPro／tRNALeu／tRNAPhe／1 2S的基因簇，并且多了一个拷贝的tRNAMet，蛋白质编码基因ND5也发生移位，并且分析了ND5的重排以及这些基因重排的可能机制。2005年Zhang P等分析了树蛙科的斑腿泛树蛙的线粒体全序列，发现两栖动物中的一种新的基因排列方式，D—loop区附近的四种tRNA基因发生重排，形成tRNAThr／tRNALeu(CUN)／tRNAPro／tRNAPhe的基因簇。更特别的是ATP8被一段853bp的非编码区所取代，因而失去其作为蛋白质编码基因的功能，ND5彻底缺失。2006Kurabayashi等研究了曼蛙科马达加斯加彩蛙的线粒体全序列，并应用于高等蛙科动物的系统进化分析罔。曼蛙科马达加斯加彩蛙的基因组结构十分复杂：五种tRNA基因(tRNAIle／tRNAMet／tRNALeu(CUN)／tRNAPro／tRNAPhe)串联在一起形成基因簇，位于ND5和12S

rRNA之间；tRNAThr转移到tRNALeu(UUR)和ND1中间；ND5移位到CR1的下游；基因组中多了一段控制区以及一个tRNAMet的拷贝。这种现象可用“倍增一随机删除”模型进行解释。2007年SuX等研究了凹耳蛙的线粒体全序列，并应用于无尾目动物的系统进化分析。凹耳蛙不同于其他的蛙科动物，tRNAHis从ND4后移位到D—loop区后，形成一种新的线粒体基因排列方式。截止2009年1月，在GenBank上已公布的无尾目动物线粒体全序列有24个物种(表1)，涉及到无尾目两大亚目中l0个科。分别为铃蟾科(Bombinatoridae)4种，盘舌蟾科(Discoglossidae)2种， 负

子科(Pipidae)2种， 锄足蟾科(Pelobatidae)1种，蟾蜍科(Bufonidae)2种，雨蛙科(Hylidae)1种，蛙科(Ranidae)5种，树蛙科(Rhacophoridae)3种，姬蛙科(Microhylidae)3种，曼蛙科(Mantellinae)1种。对这些无尾目动物的线粒体基因组进行分析， 可见基因组中最短的是黑眶蟾(Bufomelanosfictus(16328bp)，最长的是马达加斯加彩蛙(Mm Jtella madagascariensis)(22874bp)，其余多数都在16—17 kb之问。大部分物种的线粒体基因组包含13个蛋白质编码基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因和控制区。

2.无尾目动物线粒体基因组结构改变的规律

根据前人对无尾目动物线粒体结构的研究成果进行分析， 可以发现：在始蛙亚目(Archaeobatrachia)中，线粒体基因组具有和典型脊椎动物相同的排列方式，很少发生重排。已测序的东方铃蟾、红服铃蟾、dplc、多彩铃蟾、盘舌蟾、产婆蟾、强刃锄足蟾、非洲爪蟾和非洲蛙的线粒体基因组都没有发生明显重排。但在高等的新蛙亚目(Neobatrachia)中，线粒体基因组的结构常常由于基因重排而发生改变。这种改变主要表现

在三个方面：

2．1 tRNA基因的改变在新蛙亚目中，tRNA基因常发生添加现象，比如，泽蛙具有多余的一个tRNAMet的拷贝，马达加斯加彩蛙更是多了两个tRNAMet的拷贝。而tRNA基因的缺失夜常有发生，例如：黑眶蟾蜍中tRNALeu(GUN)，tRNAThr,tRNAPro三个tRNA基因都发生了缺失。更多的情况下tRNA基因会发生移位现象，特别是D—loop区附近的几个tRNA常发生了交换与重排，黑斑蛙、小弧斑姬蛙、花狭口蛙、中国雨蛙、泽蛙、卡吉卡蛙、斑腿泛树蛙、马达加斯加彩蛙等都发生了不同类型的重排。

2．2蛋白质编码基因的改变在新蛙亚目中，蛋白质编码基因也常发生改变，尤其是蛋白质ND5编码基因的移位或缺失尤为明显，泽蛙、卡吉卡蛙、马达加斯加彩蛙等的ND5编码基因都发生移位，史立积绿树蛙ND5彻底缺失，ATP8被一段85360的非编码区所取代，因而失去其作为蛋白质编码基因的功能。

2．3非编码区被分割开， 出现两个D-loop区，史立积绿树蛙和马达加斯加彩蛙mtDNA中存在两段D-loop区的现象。通过对目前的无尾目线粒体DNA的分析，发现无尾目线粒体具有8种排列方式(A，B，c，D，E，F，G，H)。根据重排的方式不同，我们将这8种排列方式归纳为三大类，第一大类：始鲑亚目具有的典型的排列方式，第二大类：新蛙目具有典型的排布方式和变种，第三大类：桐蛙科和蔓蛙科的独特挥列方式。

第一类是始蛙亚目具有的典型的排列方式(A)，这种排列方式和已知的典型的脊椎动物典型的线粒体排列方式一致。已测出的始蛙亚目的东方铃蟾(Bombina

orientalis)、红服铃蟾(Bombina bombina)、 盘舌蟾(Discoglossusgal ganoi)、多彩铃蟾(Bombina variegata)、产婆蟾(Alytes obstetricans pertinax)、强刃锄足蟾(Pelobates cuhripes)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、非洲蛙(Xenopus

tropicalis)线粒体排列方式都是这种类型。第二类是新蛙亚目较为常见的排列方式及这种排列方式的变化形式，大部分新蛙亚目的线粒体排列顺序都是这种重排(B)，包括：金线蛙(Rana plancyi)、小弧斑姬(Microhyla heymonsi)、花狭口蛙(Kaloula pulchra)、饰纹姬蛙(Microhyla omata)、中国雨蛙(Hyla

chinensis)、黑斑蛙(Rana nigromaculata)、中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)等。这种排列方式是其他两种排列方式(C，E) 的基础。黑眶蟾蜍(Bufomelanostictus)是一种较为特殊的类型(C)，它和(B)比较可以发现其丢失了三个tRNA基因。如果(B)的排列方式中tRNAHis发生移位，就产生凹耳蛙(Amolops tormotus)的排列方式(E)。在这一类型中，排列(B)是最常见也是最基础的一种类型，通过对这一重排现象的研究有助于研究新蛙亚目物种的进化关系。第三类就是树蛙科和曼蛙科的线粒体排布，其顺序更为复杂。目前公布的3种树蛙科的线粒体排布顺序各不相同，各自代表一种排列方式(D、F、H)。卡吉卡蛙(Buergeria buerg)的为(D)，它的ND5发生了重排；史立积绿树蛙(Rhacophorus schlegelii)为(F)，斑腿泛树蛙(Polypedates megacephalus)的ND5和ATP8缺失成为(H)型。除了三种树蛙外，曼蛙科(有时也作为一个亚科列入树蛙科)的马达加斯加彩蛙(Mantella madagascariensis)发生了大量的重排，它的线粒体排布顺序为(G)，这一类的排列方式是重排涉及基因最多，重排顺序最复杂的一类。树蛙科的这种复杂的排列方式的变异说明树蛙科可能是新蛙亚目中进化上较为高级的一科。TDRL模型，是解释基因重排的最常用也是最重要的一种模型。根据TDRL模型，一般认为发生变化的基因顺序的产生是来自于对原来正常的序列在串联复制或倍增后进行了多余拷贝的随机删除，而原来位置上的基因或者保留或者改变，这样就形成了新的基因排列方式。进一步研究表明这种基因的串联复制或倍增并不是随机的，它有一种位置效应，多分布在两个复制起始位点附近，并伴随控制区的倍增或分割。由于这种位置效应，新的基因排列方式造成的无尾目动物的线粒体基因组的结构改变也就可能具有规律性。例如Kumazawa的研究认为，爬行动物线粒体基因组中的tRNA基因重排大多集中在HSL、WANCY、和IQM区线粒体基因组结构研究展望脊椎动物线粒体基因结构一般比较稳定，重排相对较少发生，但是当重排出现时，能够很好的鉴别单系群。这是因为同样的基因顺序不可能是通过不同的变异而独立地产生， 同样的基因顺序往往说明有共同的祖先，因此具有共同的基因排列顺序很可能表明有共同的祖先 。线粒体基因的排布可为评估脊椎动物系统发生关系提供重要信息，尤其较高分类阶元间

的系统发生关系上，基因排列的比较将是解决具有争议的系统发生关系的有力工具，在分析生物系统发生关系上通常被认为是一个很有价值的分子标记，这对于无尾目动物的系统进化分析具有重要的意义。基于核苷酸(P1，2)和氨基酸的序列数据分别构建出了无尾目动物1O个科24种的NJ树和MP树，两种系统树显示出很高的相似性．它们均将24个物种分成两大支，一支为蛙科6种、树蛙科4个物种、姬蛙科和蟾蜍科各2个物种及雨蛙科1个物种(属于新蛙类)；而铃蟾科3个物种、负子蟾科和盘舌蟾科各两个物种及尾蟾科和锄足蟾科各一个物种构成了第二大支(属于古蛙类)，推断两者均为单系群．蛙科、树蛙科10个物种与姬蛙科2个物种首先形成姐妹群后，再与雨蛙科、蟾蜍科3物种形成一大支，且均具有较高的支持值(自检值≥75 )．铃蟾科3物种、负子蟾科2物种间以较高支持值各自聚为一支，锄足蟾科的强刃锄足蟾Pelo—bates cultripes位于第二大支的基部．在第二大支中，NJ树结果(图3)显示：铃蟾科3物种一支与盘舌蟾科2物种一支形成姐妹群，表明两者具有较近的亲缘关系．而MP树显示：尾蟾科、铃蟾科和盘舌蟾科6物种先聚为一支，再与负子蟾科物种形成姐妹群．对6种蛙科动物而言，大头蛙属3个物种与泽陆蛙的亲缘关系表现为：与脆皮大头蛙相比，大头蛙与福建大头蛙亲缘关系更近，泽陆蛙再与三者的形成姐妹群．此外，系统树还表明，同属于林蛙属(Rana)的金线蛙与黑斑蛙具有很近的亲缘关系．作为线粒体中度保守的蛋白质编码基因，无尾目24个物种的CO I基因的3个不同编码位置碱基含量变化表现出一定的规律性，从图1的标准差可以看出，第3位点各碱基含量变化最大，而第2位点碱基组成较为“稳定”．另一方面，碱基替换频率同样表现出第2位点最为保守(8：10，R一0．9)，而密码子第3位点承担较小的进化压力，其替换频率明显高于前两位点，转换／颠换为146：131(R一1．2)．Knight和Mindell 认为在重建系统树时，转换与颠换的比值若小于2．0，此基因序列突变已达到饱和状态，受进化噪音的影响可能性较大，重建系统发生时如不进行特别加权就会出现错误信息．本研究中无尾目物种线粒体CO I基因R值约为1．2，第3位点的转换数趋于饱和，对于这种现象一些学者建议去除第3位密码子(或加权分析) ．因此，本研究在构建NJ树时只选择了3位密码子的前两位(P1，2)数据进行分析处理．

3 讨论

无尾目内亚目及科间系统关系一直存在争议，焦点主要集中于古蛙亚目(或古蛙亚目和中蛙亚目)各科间系统发生关系，即其为单系还是并系(Monophyly or

Paraphyly)问题．1986年Duellman和Truebn 依据形态学数据支持古蛙亚目为并系群，此后一些学者运用分子系统学方法也支持这一观点 ．而另一些分子方面的研究均支持1975年Duellman。。将古蛙亚目(这里包含中蛙亚目)视为单系群的观点 ．基于线粒体CO I基因的两种序列数据形式，文分别运用两种不同方法(NJ

与MP法)构建出的系统树均将无尾目10个科分成两大支—— 古蛙亚目和新蛙亚目(各支支持值均大于75 )，其中古蛙亚目包括了Laurent 认为隶属中蛙亚目的锄足蟾科和负子蟾科，这与Hay等 基于线粒体基因构建无尾目22个科的NJ树结果一致．在古蛙亚目中，铃蟾科原为盘舌蟾科中的铃蟾属，1993年Ford和Cannatella将它提升为铃蟾科，目前有不少分类学家将它们仍视为一个科—— 盘舌蟾科．本研究中构建的2种系统树均显示盘舌蟾科和铃蟾科为姐妹群关系(虽然白检值不高)，这表明了两者亲缘关系较近，该观点在最近的一些研究中同样被证实了．系统树同时显示锄足蟾科的强刃锄足蟾P．cultripes位于古蛙亚目一大支的最基部，这一结论在早期的线粒体rRNA 基因的研究。 Hay等 将新蛙亚目分为3个主要支系，分别为Bufonoidea(蟾蜍总科)E2o]、Ranoidea(蛙总科)和一个独立的Sooglossidae(塞舌蛙科)．依据此，本文中的雨蛙科(Hylidae)和蟾蜍科(Bufonidae)归属于Bufonoidea中，而姬蛙科(Microhylidae)、蛙科(Ranidae)和树蛙科(Rhacophoridae)归属于Ranoidea中．中国学者费梁等 根据椎体不同类型将无尾目分为4大类(后凹型亚目Opisthocoela、变凹型亚目Anomoeoela、前凹型亚目Procoela和参差型亚目Diplasiocoela)，因此，本研究中的蟾蜍科和雨蛙科归属于前凹型亚目，而蛙科、树蛙科和姬蛙科归属于参差型亚目．本文2种系统树将新蛙亚目分为两支，一支为蛙科、树蛙科和姬蛙科12个物种，另一支为蟾蜍科和雨蛙科3个物种，这与上述传统分类观点一致．在第一支中，树蛙科与蛙科首先形成一小支，再与姬蛙科形成姐妹群，表明树蛙科与蛙科亲缘关系较近，并推测在进化过程中，姬蛙科动物可能是首先从该群祖先物种中分化出来的一支．此外，从系统树可以看出，蛙科内大头蛙属Limnnonectes与陆蛙属FeJervarya亲缘关系较近，而大头蛙属3个种间，福建大头蛙与大头蛙的亲缘关系近于脆皮大头蛙，这与先前的研究结果一致。当然，本文基于线粒体CO I基因全序列构建的两种分子系统树也存在细微的差异，且部分科间或物种间的白检支持值较低，这给本文推演部分科间系统关系带来了一定的干扰．要更科学、准确地推演出无尾目各科间的系统发生关系，可能需要增加更多“有效的”分子信息，选择更多代表物种和不同的聚类方法(如：ML和Bayesian法)，结合形态学和细胞生物学等相关数据综合考虑才能实现．

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