培养基和温度对2株治蝗绿僵菌生长和毒力的影响

2024年2月13日发(作者：美术展)

培养基和温度对2株治蝗绿僵菌生长和毒力的影响

李树一;雷仲仁;李传仁

【摘 要】研究了不同培养基及培养温度对治蝗绿僵菌(Metarhizium anisopliae)菌株LA和LD菌落面积、产孢量及毒力的影响,结果表明:LA在SMAY和PPDA培养基上的菌落面积较大,在SDAY上次之,在PCA上最小,且在SMAY培养基上的产孢量最高;LD在SMAY、PPDA和SDAY培养基上的菌落面积较大,在PCA上较小,且也在SMAY培养基上的产孢量最高;LA在30 ℃下生长较快,而LD则在25 ℃生长较快,但2种菌株均在25 ℃下产孢量较高;在SMAY上培养的LA、LD对东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis (Meyen))毒力较高,LT50分别是4.321 2 d和4.890 2 d.

【期刊名称】《长江大学学报（自科版）农学卷》

【年(卷),期】2007(004)001

【总页数】4页(P4-7)

【关键词】培养基;温度;绿僵菌(Metarhizium anisopliae);东亚飞蝗(Locusta

migratoria manilensis (Meyen));毒力

【作 者】李树一;雷仲仁;李传仁

【作者单位】长江大学农学院,湖北,荆州,434025;中国农业科学院植物保护研究所,北京,100094;中国农业科学院植物保护研究所,北京,100094;长江大学农学院,湖北,荆州,434025

【正文语种】中 文

【中图分类】Q935;S432.44

真菌是最早被发现引起昆虫疾病的微生物，也是首先被研制成杀虫剂的微生物，并以其特殊的营养方式、独特的入侵方式和可行的宿存机制在害虫的综合治理中表现出强大的生命力[1]。近40年来，利用虫生真菌治虫受到了更高的评价。目前，真菌杀虫剂发展极为迅速，已经成为微生物杀虫剂的重要组成部分,其中绿僵菌(Metarhizium anisopliae)被认为是最有希望的微生物杀蝗剂之一[2]。

不同真菌或同种真菌不同菌株间在生长条件上存在着较大的差异。为了弄清2个新治蝗绿僵菌菌株的生物学特性和培养条件，笔者研究了常见4种虫生真菌培养基和2个常用培养温度对菌株的生长和毒力的影响，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

绿僵菌菌株LA系2000年从天津北大港东亚飞蝗(Locusta migratoria

manilensis (Meyen))上分离，菌株LD系1996年从河北大城县长翅素木蝗(Shirakiacris shirakii (.))上分离。2菌株均由中国农科院植物保护研究所保存。

1.2 培养基

选取蛋白胨马铃薯葡萄糖琼脂(PPDA)、萨氏葡萄糖琼脂+酵母膏(SDAY)、萨氏麦芽提取物琼脂+酵母膏(SMAY)和胡萝卜马铃薯琼脂(PCA)4种固体培养基，培养基成分分别如下：PPDA培养基：马铃薯200 g +葡萄糖20 g +蛋白胨10 g +琼脂20 g，无菌水定容至1 L；SDAY培养基：葡萄糖40 g +蛋白胨10 g +酵母膏2

g +琼脂20 g，无菌水定容至1 L；SMAY培养基：麦芽提取物40 g+蛋白胨10

g +酵母膏2 g +琼脂20 g，无菌水定容至1 L；PCA培养基：胡萝卜100 g +马铃薯100 g +琼脂20 g，无菌水定容至1 L。

1.3 绿僵菌生长量测定

将4种固体培养基灭菌后倾入已灭菌的培养皿(内径6 cm)中,每皿5 mL,制成平板备用。将各菌株孢子液通过研磨器充分研磨配成镜检单孢率为100%、浓度为1×107个/mL，用微量进样器吸取5 μL点植于培养基中央，每处理重复3次。置于光周期L∶D=14∶10、温度分别为25 ℃和30 ℃的光照培养箱内培养，记录产孢起始时间，测量第3、5、7、9和11 d的菌落直径。

1.4 绿僵菌产孢量测定

培养12 d后，用直径为4 mm的打孔器在菌落核心至边缘的1/2处打孔后,和5

mL吐温-80(0.05%)置入研磨器,研磨5 min后，镜检单孢率为100%时，用血球计数板计数。每处理重复3次。所得孢子浓度乘以吐温水体积(5 mL)，再除以单位圆面积(直径为4 mm)，所得数据为该菌株的相对产孢量(个/mm2)；将该相对产孢量乘以此菌株的菌落面积即为该菌株的绝对产孢量(个/皿)。

1.5 毒力测定

2006年从山东泰山采集东亚飞蝗的无病蝗蝻，室内饲养至4龄大小时作为供试虫源。取培养12 d的斜面菌种，配成孢子浓度为5.2×107个/mL的油剂。用微量进样器吸取0.5 μL在每头试虫右腹侧点滴。每处理试虫25头，均单独饲养于直径6.5 cm，高17.5 cm的塑料筒中。筒两端安装纱盖通气，筒上方约25 cm处悬挂60 W白炽灯，白天供给8 h辐射热。环境温度设(30±2 ) ℃。用新鲜玉米叶作食料，每天更换1次。逐日记录死亡虫数，死亡虫体保湿培养，以僵虫且体表所产孢子镜检为绿僵菌者为罹病虫数。用POLO几率分析系统计算LT50；用DPS软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 培养基对绿僵菌LA和LD营养生长的影响

绿僵菌LA和LD菌株在4种培养基上25 ℃下培养3、5、7、9、11 d后，其菌落直径见表1和表2。

表1 绿僵菌LA在不同培养基上菌落生长比较Table 1 Comparison of the

growth of isolate LA colony on different media培养基菌落直径/cm第3d第5d第7d第9d第11dPPDA1．27±0．09bA2．07±0．09abAB3．00±0．30bB3．37±0．68bB4．03±0．83bBSDAY1．43±0．28aA2．27±0．18bB2．97±0．12abB3．33±0．12bB3．93±0．15abASMAY1．33±0．15aA2．37±0．20bB3．07±0．12bB3．43±0．15bB4．07±0．03bBPCA1．17±0．21bB1．77±0．13aA2．06±0．14aA2．60±0．04aA3．63±0．20aA

表2 绿僵菌LD在不同培养基上菌落生长比较Table 2 Comparison of the

growth of isolate LD colony on different media培养基菌落直径/cm第3d第5d第7d第9d第11dPPDA1．80±0．06aA3．93±0．03bB4．97±0．09bB6．00±0．00aA6．00±0．00aASDAY1．60±0．06aA3．93±0．09bB4．53±0．09bB5．50±0．17aA5．67±0．17aASMAY1．57±0．03aA4．17±0．22bB5．07±0．27bB5．70±0．21aA5．97±0．03aAPCA1．2±0．22aA1．93±0．03aA2．90±0．21aA3．93±0．09bB5．03±0．21cC

LA菌株在PPDA培养基上生长较平缓，无菌丝快速生长期，各相邻时段间菌丝生长速率差异不显著,但整体差异极显著(F=12.107,P=0.001)，而在SDAY、SMAY和PCA培养基上，整体生长速度差异亦极显著(F=28.880,P<0.001；F=27.170,P<0.001和F=36.901,P<0.001)，且第5 d出现生长加速期。

LD菌株在PPDA(F=186.242,P<0.001)、SDAY(F=175.638,P<0.001)和SMAY(F=94.079,P<0.001)培养基上,第5 d生长速度激增，随后保持稳定，而第9 d进入第2次生长高速期，随后其菌丝生长速度保持稳定。在PCA培养基上(F=185.395,P<0.001)，LD在第5 d、第9 d和第11 d 3次出现菌丝生长加速现

象，但菌落直径小。

从菌丝生长面积来看,LA的营养生长以PPDA和SMAY最适(F=3.942,P=0.044),而PCA上的菌丝面积最小。LD在4种培养基上菌丝生长面积差异性极显著(F=11.941,P=0.003)，且在PPDA和SMAY生长面积最大,在PCA上面积最小(表3)。

表3 LA、LD在不同培养基上菌丝生长面积的比较Table 3 Comparison of the

colony areas of isolates LA and LD colonies on different media菌株不同培养基下的菌丝面积/cm2PPDASDAYSMAYPCALA15．49±1．22aA12．18±0．90abA15．46±0．94aA10．53±1．74bALD28．27±0．00aA25．26±1．50aA27．96±0．31aA19．96±1．61bB

2.2 培养基对LA和LD产孢量的影响

(1)不同培养基对LA、LD相对产孢量的影响 25 ℃培养12 d后,绿僵菌LA和LD在4种培养基上相对产孢量差异性显著(F=27.232,P<0.001和F=4.937,P=0.032),2个菌株均在SMAY培养基上相对产孢量最高，且绿僵菌LA在SMAY和PPDA培养基上相对产孢量极显著高于其在SDAY和PCA培养基上产孢量(图1)。

(2)不同培养基对LA、LD绝对产孢量的影响 在各菌种25 ℃下培养12 d后，LA、LD在各培养基上绝对产孢量均差异显著(F=51.197,P<0.001和F=5.524,P=0.024)(图2)，且LA、LD均在SMAY培养基上绝对产孢量最高且显著高于其在培养基PCA上的绝对产孢量。

图1 LA、LD在不同培养基上的相对产孢量Figure1 Relative conidia

production of LA and LD isolates on different media

图2 LA、LD在不同培养基上的绝对产孢量Figure2 Absolute conidia

production of LA and LD isolates on different mediua

2.3 温度对菌株LA和LD的影响

表4 不同温度下LA和LD的菌落直径Table 4 The colonies diameters of LA

and LD isolates菌株温度/℃菌落直径/mm第3d第5d第7d第9d第11dLALD

253025

3013．3323．6730．6734．3340．67±0．13aA9．6720．3330．3336．6746．67±0．12bB15．6741．6750．6757．0059．67±0．33aA

13．6725．3336．6747．3347．33±0．93bB

(1)温度对LA、LD营养生长的影响 在25 ℃和30 ℃下，LA、LD在SMAY培养基上的菌落直径测量结果见表4。

对第11 d的菌落直径进行t检验后发现，LA在30 ℃菌落生长直径显著性大于25 ℃环境下菌落直径(t=0.756,v=4,P=0.002)，说明绿僵菌LA更适宜在30 ℃下生长。2种温度对绿僵菌LD影响差异亦显著(t=6.002,v=4,P=0.004)，25 ℃更适宜LD的生长。

(2)温度对LA和LD产孢量的影响 在25 ℃和30 ℃2种温度下，LA和LD在SMAY培养基上的产孢量及初始产孢时间有明显分化(表5),LA在30 ℃下产孢更早，但相对产孢量较25 ℃略低，t检验表明二者差异性不显著(t=2.121,v=4,P=0.101)。绿僵菌LD同样在30 ℃产孢更早，但相对产孢量显著低于其在25 ℃下产孢量(t=3.374.,v=4,P=0.008)。

表5 温度对LA和LD产孢的影响Table 5 Effect of different temperatures on

conidia productions of LA and LD isolates菌株温度/℃初始产孢时间/d相对产孢量/(106个/mm2)LALD 253025

303．39．55±0．92aA3．08．49±0．53aA4．38．76±2．11aA

4．01．64±0．10bB

2.4 不同培养基对绿僵菌LA和LD毒力的影响

在SMAY和SDAY培养基上生长的LA和LD孢子粉，配成同浓度油剂接种4龄东亚飞蝗若虫，发现SMAY培养基上的绿僵菌LA、LD具有更强的毒力(表6)。

表6 不同培养基对LA和LD毒力的影响Table 6 Virulence of isolates LA and

LD colonies on different media菌株培养基斜率LT50(95%置信限)/dLT90(95%置信限)/dLASMAY9．901±1．4734．321(3．976～4．644)5．886(5．126～7．902)LASDAY17．329±3．2474．782(4．250～5．346)5．669(5．140～7．856)LDSMAY7．746±0．9954．890(4．512～5．255)7．158(6．522～8．212)LDSDAY13．810±2．2765．262(4．626～5．879)6．515(5．842～8．915)

3 讨论

不同昆虫寄主、不同气候条件中分离到的大量绿僵菌具有不同的寄主范围，对不同的环境具有不同的致病力，在田间防治表现出不同的防治效果。这些差异的存在是由它们各自不同的生物学习性所决定的，因此研究菌株的生物学特性是进一步开发利用绿僵菌生物防治的基础。

本研究所选的4种培养基中，SMAY有利于绿僵菌LA和LD的营养生长和生殖生长，同时由于SMAY培养基培养的菌株对东亚飞蝗的毒力较由SDAY培养基培养的菌株更强,因此治蝗菌株LA和LD用SMAY培养基培养，以免续代培养的过程中出现菌株退化和毒力下降等问题。

本研究结果显示，LA较耐高温，在30 ℃下的营养生长迅速，产孢时间早，且产孢量在25 ℃、30 ℃ 2种温度下无差异，因此LA培养温度为 30 ℃;LD在25 ℃条件下营养生长和产孢量均显著优于其在30 ℃下的2指标，所以LD的培养温度为25 ℃。

治蝗绿僵菌菌株LA和LD对东亚飞蝗均具有很强的杀虫能力，是值得工业开发的

微生物杀虫剂资源，具有较大的开发利用前景。本研究初步探讨了4种常见培养基和2个培养温度对2个菌株生长和毒力的影响，其培养条件和继代培养后的局变规律仍值得进一步研究。

[参考文献]

[1]徐伟松，李建丰，胡美英．昆虫病原真菌在害虫防治上的应用[J]．广西农业科学，2003， (6)：51～52.

[2]Prior C,Carey M,Abraham Y J,et al．Development of a bioassay method

for the lection of entomopathogenic fungi virulent to the dert locust

Schistocerca gregaria (Forskal)[J].J Appl Ent,1995,119：567～575.