_慈竹C3H基因克隆及其生物信息学分析

2024年2月8日发(作者：钟离春)

32（1）：38～46植物研究2012，BulletinofBotanicalRearch慈竹C3H基因克隆及其生物信息学分析周美娟胡尚连*曹颖卢学琴任鹏吴晓宇李晓瑞（西南科技大学生命科学与工程学院，绵阳621010）摘要3-PCR技术克隆香豆酸-羟化酶（C3H）是调控植物木质素生物合成的关键酶，本文以慈竹为材料，利用RT-慈竹C3H基因，并对其进行生物信息学分析，为通过基因工程手段降低工业用竹木质素含量奠定基础。结果表明，该cDNA序列全长为1581bp，编码区为1539bp，编码512个氨基酸，蛋白分子量为58．33KD，等电点为9.09；氨基酸序即P450结构域。系统进化分析表明，该基因与毛竹和水稻的C3H基因具有列和结构分析显示C3H有一个保守区域，很高的同源性。慈竹与毛竹和水稻C3H基因编码蛋白为亲水性蛋白，这三种编码蛋白很可能定位在内质网（膜）上，其编码蛋白的二级结构及三级结构都含有丰富的α-螺旋和无规卷曲，β-转角和延伸链的含量较少，都含有2个相对保守的无序化区域。该基因已在GenBank上注册，基因序列登录号为JF693629，可能与慈竹木质素的生物合成有关。关键词慈竹；C3H基因；克隆；生物信息学分析文献标识码：A文章编号：1673－5102（2012）01－0038－09中图分类号：S718．46CloningandBioinformationAnalysisofC3HGeneinNeosinocalamusaffinisZHOUMei-JuanHUShang-Lian*CAOYingLUXue-QinRENPengWUXiao-YuLIXiao-Rui（CollegeofLifeScienceandEngineering，SouthwestUniversityofScienceandTechnology，Mianyang621010）Abstractp-Coumarate3-hydroxylaplaysanimportantroleinthebiosynthesispathwaysofplantlignin．Thefull-lengthquenceofC3HinNeosinocalamusaffinis（NaC3H）wassuccessfullyclonedbyRT-PCR，anditsbioinformationanalysiswascarriedout．Itaimstoprovidetheoreticalbasisfordecreasingthecontentoflignininbambooformaking-pulpthroughengineeringtechnique．Thequenceis1581bpinlength．ThebioinformationanalysisshowedthattheCDSregionofthenucleotidequencewas1539bp，encoding512predictedaminoacids．Theproteinmolecularweightwas58．33kDandtheoreticalpIwas9．09．Accordingtotheaminoacid-quenceandstructuralanalysis，itshowedthattheproteinencodingbyC3Hcontainedoneconrveddomain，viz．P450domain．PhylogeneticanalysisshowedthatNaC3HwasmostsimilartoC3HfromP．edulisandOryzasativa．TheproteinncodedbyC3Hgeneswerehydrophilicones．Subcellularlocalizationsofthethreepro-teinswereintheendoplasmicreticulum（membrane）．Thecondarystructuresandtertiarystructureswerea-bundantinalphahelixsandrandomcoils，betaturnsandextendedstrainswereless．Tworelativeconrveddis-ordereddomainswerefoundinaminoacidquencencodedbyC3HgenesfromN．affinis，P．edulisandO．sa-tiva．Thefull-lengthquenceofNaC3HhasbeensubmittedtoGenBankwiththeaccessionnumberJF693629．KeywordsNeosinocalamusaffinis；C3Hgene；cloning；bioinformationanalysis木质素是地球上含量丰富的一类有机物质，仅次于纤维素的含量，具有丰富的生物学功能，在抵御植物病害袭击，抗击外来侵袭，维持植物正常生［1］长等方面发挥着巨大的作用。但是，在制浆造纸过程中，为脱除木质素必须使用大量化学药品，不仅加大了造纸成本，更严重的是对环境造成了污染。随着木质素生物合成途径的不断完善及其相关基因的克隆，通过基因工程技术调控植物木质素［2］的生物合成，来改进纸浆生产已经成为可能。CYP450）是一类细胞色素P450（cytochrome，“十二五”101）；四川主要丛生竹定向培育技术项目基金项目：四川省重点攻关资助项目；四川省应用基础研究基金资助项目（05JY029-资助（10zx1102）第一作者简介：周美娟（1985—），女，硕士研究生，从事植物遗传与品种改良研究。*mail：hushanglian@126．com通讯作者：E-收稿日期：2011－06－08

1期周美娟等：慈竹C3H基因克隆及其生物信息学分析39以还原态与CO结合后，在450nm处具有最高吸收峰的含血红素的单链蛋白质。在所有已知结构的P450中都存在一个保守的血红素结合域，含有x-x-Gly-x-Arg-x-Cys-x-Gly序列，是鉴定保守的Phe-P450的主要序列依据，其中半胱氨酸（Cys）是亚铁在所有的P450中完全保血红素的第5个轴配体，守。植物细胞色素P450对植物生长发育具有重要的生物学功能，参与木质素中间物、赤霉素、生油菜素类固醇激素等代谢物的生物合成。物碱、3-coumarate3-hydroxyla，香豆酸-羟化酶（p-C3H）属于细胞色素P450中的CYP98亚家族，是木质素生物合成途径中催化苯丙烷反应的关键酶决定木质素单体的碳源流向，也是苯丙烷途之一，。Schoch等［5］用功能基因组的方法首次证明从拟南芥中分离得到的CYP98A3是C3H径的限速酶基因，证实C3H属于P450蛋白，对香豆酰奎宁酸和香豆酰莽草酸表现出很高的催化活性，在木质部［6］表达。随后Franke等对突变体ref8的研究也证［5］专家学者已经从拟南芥、毛实了这一点。目前，［7］［8］［9］［10］竹、银杏、芝麻、小麦等植物中克隆出了C3H基因，而有关慈竹C3H基因克隆的研究尚未［4］［3］［3］限制性内切酶，均购自MBI（Fermentas）公司；大肠杆菌DH5α为本实验室保存。1．31．3．1方法总RNA的提取与cDNA链的合成参照植物总RNA提取试剂盒的说明书方法提电泳后经凝胶成像系统进行观察并拍取总RNA，照。选择MBI公司的RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit反转录试剂盒，以oligo（dT）18为引物，MuLV反转录酶进行cDNA合成。用RevertAidTMM-1．3．2用RT-PCR的方法获得C3H基因的编码区序列根据已登录在GenBank上的毛竹的C3H基因的核苷酸序列，使用PrimerPremier5．0软件设计克隆慈竹C3H基因的全长引物，引物序列为：上游AACCCAAAGCAAGCCACCATG-引物（P1）：5'-3'；下游引物（P2）：5'-CCAAGCAGCACAGAGTGCTCA-3'。以反转录生成的cDNA为模板，采用LA-TaqDNA聚合酶进行全长序列扩增。PCR反应条件为：95℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸2min；30个循环；72℃延伸10min；4℃保持。PCR扩增产物与pMD19-TVector（大连TaKa-Ra公司）连接，测序。1．3．3慈竹C3H基因全长序列的生物信息学分析（1）C3H基因系统发生树的构建利用Mega4软件，对慈竹的C3H基因和NCBI数据库中搜索得到的其他物种的C3H基因全长序Joining列进行系统进化树的构建。采取Neighbor-法构建系统进化树，对生成的系统进化树进行Bootstrap校正，生成最终的系统进化树。（2）C3H基因编码蛋白的理化性质分析利用NCBI（http：//www．ncbi．nlm．nih．gov）中finder软件找出慈竹C3H基因的开放读码的ORF-框，然后利用ExPaSy工具（http：//au．expasy．org/tools/）中提供的Prot-Param软件和ProtScale软件分别进行氨基酸残基数目、组成、蛋白质相对分子质量、理论等电点和亲/疏水性的在线分析。（3）C3H基因编码蛋白的二级结构分析利用ExPaSy工具中的SOPMA软件在线预测helix，H）、turn，T）、分析α-螺旋（α-β-转角（β-无规C）以及延伸链（extended则卷曲（randomcoil，strand，E）等，然后利用网站ExPaSy工具中的PSORT软件预测蛋白亚细胞定位。（4）C3H基因编码蛋白的三级结构分析主三级结构的预测是蛋白质结构预测的重点，见报道。慈竹（Neosinocalamusaffinis）是我国西南地区栽培最普遍的经济竹种之一，具有生长快、易繁殖的特点，是优良的造纸材料。本研究室利用RACE技术已克隆到慈竹的4CL（4-香豆酸辅酶Acoumarate：CoAliga，连接酶；4-简称为4CL）全长cDNA序列（Genbank：EU327341）［11］，并已建立梁山［12］慈竹愈伤组织培养与植株再生体系。因此，本研究以慈竹为材料，对其C3H基因进行克隆，并进行生物信息学方面的分析，以期为慈竹C3H基因在大型丛生工业用竹遗传改良中的应用提供理论依据。11．1材料与方法材料以产自四川省眉山市青神县慈竹的嫩茎为材料，将其放在液氮中保存，带回实验室，置于－80℃超低温冰柜中待用。1．2主要试剂与菌种LA-Taq聚合酶、DL2000DNAMarker、T4连接pMD19-TVector、X-Gal、IPTG，酶、均购自大连TaKaRa公司；植物总RNA提取试剂盒、普通质粒小提取试剂盒均购自TIANGEN公司；胶回收试剂tec公司；RevertAidFirstStrand盒购自OmegaBio-cDNASynthesisKit反转录试剂盒、EcoRⅠ、HindⅢ

40植物研究32卷要有以下几种方法：同源模建、折叠识别和从头预［13～14］。利用ExPaSy工具中的CPHmodels程测法序进行同源模建，并利用高级结构预测软件Ras-Mol对C3H基因编码的蛋白三维结构进行分析。（5）C3H基因编码蛋白的固有无序化特性分析利用在线程序FoldIndex（http：//bioportalweizmann．ac．il/fldbin/findex）对C3H基因的氨基［15］酸序列进行蛋白质无序特性分析。（GenBank登录号为JF693629）。利用NCBI的Blastp查找NaC3H基因保守域，经过Pfam14．0程NaC3H序分析，可获得序列的保守域。结果表明，基因有一个保守区域，其为P450结构域（图3）。22．1结果与分析慈竹C3H基因全长克隆及其编码氨基酸序列分析PCR技术克隆得到一条长度约为1利用RT-500多bp的cDNA片段（图1），经序列测定与分析表明，这条片段为慈竹C3H基因，全长为1581bp（图2）。通过ORF-finder软件分析，其ORF框为位于核苷酸序列的22－1560区域，总长为1539bp，编码512个氨基酸（图2），该基因命名为NaC3H图1Fig．1慈竹C3H基因全长扩增结果Amplifiedfull-lengthcDNAfragmentsofC3HgenefromN．affinis图2Fig．2慈竹C3H基因（NaC3H）全长序列及编码氨基酸序列Full-lengthquencesandputativeaminoacidofNaC3H（Greyboxescontainresiduesthatareidentical）

1期周美娟等：慈竹C3H基因克隆及其生物信息学分析41图3Fig．3NaC3H基因编码蛋白的保守区结构域ConrvedfunctiondomainofaminoacidquencefromNaC3H2．2C3H基因系统发生树的构建FGAGRRVCPG；慈竹和水稻与毛竹相比，在氨基酸270位置都缺少一个甘氨酸（Gly）。2．4慈竹NaC3H基因与毛竹和水稻C3H基因编码蛋白的理化性质分析对慈竹、毛竹和水稻进行物理性质分析（表1）可知，慈竹和水稻C3H基因编码的氨基酸总数一样，但都比毛竹缺少一个氨基酸（甘氨酸）；慈竹、毛竹和水稻C3H基因编码的分子量几乎一致；慈竹NaC3H基因编码的碱性氨基酸比毛竹的多两个，比水稻的多3个；而慈竹NaC3H基因编码的酸但比水稻的多1个；慈性氨基酸比毛竹的少1个，竹NaC3H基因编码蛋白的理论等电点在三者中为最高，其等电点大于9（表1）。由此可知，编码的碱性氨基酸的总数比酸性氨基酸的总数多，则该蛋白表现为碱性蛋白，说明慈竹NaC3H基因编码蛋白与毛竹和水稻C3H基因编码的蛋白都是碱性蛋白，而且编码的碱性氨基酸的总数比酸性氨基酸的总数多得越多，其蛋白的等电点就越大。表1性质Table1PhysicalandchemicalpropertiesoftheproteincodedbyC3HgenesfromN．affinis，PhyllostachydulisandOryzasativa编码的氨基酸Codedaminoacids慈竹N．affinis毛竹P．edulis水稻O．sativa512513512分子量Molecularweight（kD）58．3358．3258．36碱性氨基酸Alkalineaminoacids706867酸性氨基酸理论等电点AcidicaminoTheoreticalacidspI6263619．098．778．96利用Mega4软件构建了C3H基因系统发生树（图4）。利用DNAMAN软件对其进行多重序列比对，结果表明，慈竹和毛竹的C3H基因的相似性最为96．88%；NaC3H基因与水稻的C3H基因也高，有较高的相似性，为91．21%。从系统发生树可见，慈竹与毛竹、水稻的C3H基因有很近的进化关系，与高粱和玉米的细胞色素P450家族在进化上也有较近的遗传距离，而与拟南芥、杂交白杨、咖啡树和烟草的遗传距离较远。因此，从系统发生树来慈竹NaC3H基因编码蛋白应属于CYP98家族看，A亚家族蛋白。慈竹、毛竹和水稻的C3H基因编码的蛋白序列理化图4Fig．4plantspecies不同种植物C3H基因的系统进化树PhylogenetictreeofC3Hgenesfromdifferent根据系统发生树的结果，以下研究只针对慈竹与毛竹和水稻的C3H基因进行的分析。2．3慈竹NaC3H基因与毛竹和水稻C3H基因编码的氨基酸序列比对利用EBI在线的ClustalW2对慈竹NaC3H、毛竹和水稻的C3H基因编码的氨基酸进行序列多重比对（图5）。根据比对结果发现，这3条氨基酸序具有典型的细胞色素P450的结构列保守性较强，特征，且都含有P450蛋白的氨基酸保守基序2．5慈竹NaC3H基因与毛竹和水稻C3H基因编码蛋白的疏/亲水性分析利用ProtScale软件的KytandDoolittle算法对慈竹NaC3H基因与毛竹和水稻C3H基因编码蛋白进行疏水性/亲水性预测，正值越大表示越疏水，负值越大表示越亲水，介于+0．5到－0．5之间的主要为两性氨基酸。结果表明，慈竹NaC3H基因

42植物研究32卷与毛竹和水稻C3H基因编码蛋白大约都是在14248区域具有很强的亲区域具有较强的疏水性，水性，其总平均亲水性分别为－0．644、－0．644、－0.800，预测这3种蛋白为亲水性蛋白，其中，水稻C3H基因编码蛋白的亲水性为最高，慈竹和毛竹的亲水性相同。图5Fig．5慈竹NaC3H基因与毛竹、水稻C3H基因的ClustalW2氨基酸序列多重比对（阴影区为氨基酸保守域；*代表保守氨基AminoacidquencealignmentofNaC3Hwithp-coumarate3-hydroxylasfromP．edulisandO．sativaby（Greyboxescontainresiduesthatareidentical；Asterisksindicatethepositionoftheconrvedaminoacidsinactivesiteregionsof酸位点）ClustalW2plantp-coumarate3-hydroxylas）2．6慈竹NaC3H基因与毛竹和水稻C3H基因编码蛋白的二级结构分析及亚细胞定位利用SOPMA软件预测慈竹、毛竹和水稻的C3H基因编码蛋白二级结构（表2）。慈竹NaC3H基因与毛竹和水稻的C3H基因编码蛋白的二级结构中含有丰富的α-螺旋和无规卷曲，β-转角和延伸链的含量较少；其中慈竹NaC3H基因编码蛋白的α-螺旋比毛竹和水稻C3H基因编码蛋白的α-螺旋多，β-转角的个数相同，但延伸链和无规卷曲个数最少。利用PSORT软件对慈竹NaC3H基因与毛竹和水稻的C3H基因编码蛋白进行的亚细胞定位预测（表3），由表3可以得出，这3种植物的C3H基因编码的蛋白质定位于内质网（膜）、线粒体内膜、细胞膜、内质网（腔内）、叶绿体类囊体膜、胞外的几率不同，但都以定位于内质网（膜）上的几率为

1期周美娟等：慈竹C3H基因克隆及其生物信息学分析表343最高，慈竹的为60．0%，毛竹和水稻的都为82.0%，从而推断，这3种植物的C3H基因编码的蛋白质定位于内质网（膜）上的可能性最大。表2分析Table2SecondarystructureanalysisofproteinC3HfromN．affinis，P．edulisandO．sativa慈竹N．affinisα-螺旋Alphahelix（Hh）β-转角Betaturn（Tt）延伸链Extendedstrand（Ee）无规卷曲Randomcoil（Cc）263（51．37%）28（5．47%）48（9．38%）173（33．79%）毛竹Phyllostachydulis257（50．10%）28（5．46%）53（10．33%）175（34．11%）水稻Oryzasativa240（46．88%）28（5．47%）54（10．55%）190（37．11%）慈竹、毛竹和水稻的C3H基因编码蛋白的亚细胞定Subcellularlocalizationpredictionofprotein位分析Table3C3HfromN．affinis，P．edulisandO．sativa慈竹、毛竹和水稻的C3H基因编码蛋白的二级结构内质网（膜）Endoplasmicreticulum（membrane）叶绿体类囊体膜Chloroplastthylakoidmembrane线粒体内膜Mitochondrialinnermembrane细胞膜Plasmamembrane内质网（腔内）Endoplasmicreticulum（lumen）胞外Outside慈竹N．affinis60．0%37．0%10．0%10．0%毛竹P．edulis82．0%水稻O．sativa82．0%10．0%19．0%10．0%10．0%10．0%51．4%10．0%10．0%图6Fig．63种植物C3H基因编码蛋白的三级结构ModeloftertiarystructureofproteincodedbyC3Hgenesfromthreeplantspiecies2．7慈竹NaC3H基因与毛竹和水稻C3H基因编码蛋白的三级结构预测利用CPHmodels建模服务器对慈竹、毛竹和水稻进行C3H基因编码蛋白进行三维建模（图6），以及其保守区结构域的三级结构（图7）。从图6可以看到慈竹、毛竹和水稻的C3H基因编码蛋白三级结构相似，均含有丰富的α-螺旋和无规卷曲，还有少量的β-转角、延伸链，由此可看到其蛋白折叠空间结构构象的变化；从图7可以看到，这三种植物的C3H基因编码蛋白共有的保守区结构域三级结构，由10个氨基酸组成：苯丙氨酸（Phe1）、甘氨酸（Gly2）、丙氨酸（Ala3）、甘氨酸（Gly4）、精氨酸（Arg5）、精氨酸（Arg6）、缬氨酸（Val7）、半胱氨酸（Cys8）、脯氨酸（Pro9）、甘氨酸（Gly10）。图7Fig．7C3H基因编码蛋白的保守区结构域三级结构ModelofconverddomainoftertiarystructureofproteincodedbyC3Hgene

44植物研究32卷

1期周美娟等：慈竹C3H基因克隆及其生物信息学分析452．8慈竹NaC3H基因与其他单子叶植物C3H基位于叶绿体的类囊体膜。已有研究表明，毛竹C3H基因编码蛋白很可能定位在内质网（膜）上［6］因编码氨基酸的固有无序化分析利用在线程序FoldIndex（http：//bioportal．weizmann．ac．il/fldbin/findex）对慈竹NaC3H基因与系统发生树中其他单子叶植物C3H基因编码氨在基酸的固有无序化特性分析（图8）。结果表明，这七种单子叶植物中含有两个无序化相对保守区域，分别为NRSTQRFSRNGQDLIWADYGPHYIKV和KIIDEHAKALKESG。在系统发生树中，亲缘关系最近的慈竹、毛竹和水稻的C3H基因编码的整个氨基酸序列中，其无序化区域个数、长度和所占比例不同。慈竹NaC3H基因编码的整个氨基酸序列中无序化区域有4个，最长的无序化区域长度为35个氨基酸，总的无序化氨基酸数目为82个，无序化的比例达到16．0%；毛竹C3H基因的整个氨基酸序列中无序化区域有2个，最长的无序化区域长度为35个氨基酸，总的无序化氨基酸数目为60个，无序化的比例达到11．7%；水稻C3H基因的整最长的无序化个氨基酸序列中无序化区域有2个，区域长度为26个氨基酸，总的无序化氨基酸数目为52个，无序化的比例达到10．2%。由此可知，慈竹NaC3H基因编码的整个氨基酸序列的无序化程度最高，其次是毛竹，最低的是水稻。此外，慈竹NaC3H基因的整个氨基酸序列中无序化区域比毛竹、水稻C3H基因的整个氨基酸序列中无序化区其分别为LSVAEYTWY和NRVMSET域多2个，（图8）。。由于慈竹NaC3H基因与毛竹C3H基因有很高的相似性。因此，可以认为慈竹NaC3H基因编码蛋白很可能也定位在内质网（膜）上。蛋白质固有无序化特性（intrinsicallydisorder-edprotein）是蛋白质功能的一个重要指标［18］。固有无序化蛋白质/区域是指体外模拟的生理条件下缺乏刚性的三维结构的蛋白质/区域，是多种动态互变结构的集合［18］。这些固有无序化蛋白质/区［14］域可能执行重要的生物学功能，而它们结构上的可塑性则可能对其行使功能具有重要意义。本研究发现，单子叶植物C3H基因编码氨基酸序列中包含两个无序化比较保守区域。已有研究表明，蛋而且蛋白质白质无序化区域在进化上具有保守性，无序化与有机体的复杂性密切相关染色体2n=48散生竹，［21］［19］。慈竹是大［20］型丛生竹，染色体数目为2n=72；毛竹是大型。慈竹和毛竹C3H基因编码氨基酸序列中除都含有二个较长的无序化区域外，慈竹NaC3H基因编码氨基酸序列中无序化区域比毛竹的多2个，由此看来，蛋白质无序化可能与有机体的复杂性密切相关。关于蛋白质无序尚需进一步深入化区域的多少对其功能有何影响，系统研究。PCR技术，本研究利用RT-克隆获得了慈竹C3H基因全长序列（命名为NaC3H）。该序列长1581bp，编码512个氨基酸。NaC3H基因编码的即P450结构域。氨基酸序列中有一个保守区域，该基因已在GenBank上注册，基因序列登录号为JF693629。在系统发生树中，慈竹NaC3H全长基因序列与毛竹、水稻、玉米和高粱聚为一大枝，可以看出NaC3H应属于CYP98家族A亚家族蛋白。在NaC3H基因编码蛋白的结构预测中，可见，NaC3H基因编码的蛋白亲水性较强；其编码蛋白很可能定位在内质网（膜）上；其二级结构含有丰富的α-螺旋和无规卷曲，β-转角和延伸链的含量可以更加直观地看到α-螺较少；其三级结构预测，旋、β-转角、无规卷曲和延伸链，以及其蛋白质折叠空间结构构象的变化；其编码蛋白含有无序化区域。因此，利用生物信息学的方法对已知序列进行分析，可以了解其蛋白质结构和功能，为以后的试验方案的制定提供理论依据。3讨论木质素的生物合成是在一系列酶的催化下使苯丙氨酸或酪氨酸逐步转化为木质素单体，最终聚其中C3H被认为是调控植物合成木质素的过程，体内木质素代谢过程中H单体向G/S单体转化的，催化木质素生物合成过程中的对—香coumaroylshikimate/qui-豆酰莽草酸/奎宁酸（p-关键酶nate）C3位置的羟基化反应［4］。已有研究表明，杂交杨树C3H基因的RNA干扰，抑制C3H基因表达，既能降低木质素含量又能改变木质素单体组［17］PCR技术从慈竹中克隆成。本研究室利用RT-出了C3H基因，为今后利用该基因调控大型丛生工业用竹木质素的生物合成奠定了基础，并且对于未来提高造纸的产率也有重要的现实意义。蛋白质亚细胞定位表明，慈竹NaC3H基因编也有一部分定码蛋白大部分定位于内质网（膜），［16］

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