妊娠相关血浆蛋白A的原核表达及蛋白纯化

2024年2月6日发(作者：疫情短语)

妊娠相关血浆蛋白A的原核表达及蛋白纯化

曾昭伟;常艳敏;王学谦

【摘 要】目的 构建原核表达PAPP-A重组蛋白,并对蛋白质进行纯化.方法 根据DNAstar软件分析获得的编码PAPP-A特异抗原表位,利用Primer Premier 5.0软件设计引物,以PAPP-A cDNA-质粒转化菌液为模板,进行PCR扩增.PAPP-A的DNA和pET42a质粒分别双酶切,经琼脂糖凝胶电泳及胶回收后进行连接反应,转化至大肠埃希菌Top10,筛选阳性克隆经测序鉴定正确后,转化至大肠埃希菌BL21,诱导产生PAPP-A重组蛋白,利用镍柱初步纯化及离子交换层析柱进一步纯化,用SDS-PAGE及DEAE层析鉴定重组抗原蛋白.结果 筛选出抗原表位集中区,在大肠埃希菌BL21中高效表达了重组的PAPP-A蛋白,经过镍柱及离子交换层析纯化后,PAPP-A浓度为0.22 g/L,DEAE层析分析证实其纯度较高.结论 成功筛选出PAPP-A的抗原表位集中区,并制备了重组抗原蛋白,为PAPP-A的后续临床研究提供依据.

【期刊名称】《临床检验杂志》

【年(卷),期】2016(034)003

【总页数】4页(P186-189)

【关键词】妊娠相关血浆蛋白A;抗原表位;原核表达

【作 者】曾昭伟;常艳敏;王学谦

【作者单位】天津市南开医院检验科,天津300100;天津市南开医院检验科,天津300100;天津市南开医院检验科,天津300100

【正文语种】中 文

【中图分类】R392-33

妊娠相关蛋白A(pregnancy-associated plasma proteinA，PAPP-A) 是一种大分子糖蛋白，分子量(Mr)约为500×103，目前证实2个相同PAPP-A亚基与2个嗜酸主要碱性蛋白前体(proMBP)通过二硫键比例形成PAPP-A/proMBP化合物[1]。 proMBP是PAPP-A的内源性抑制剂[2]，可在胎盘合体滋养层和蜕膜生成、分泌。PAPP-A也存在于非孕妇的非胎盘组织、细胞中，如成骨细胞[3]、成纤维细胞[4]等。PAPP-A在急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)患者的外周血中呈高表达，对ACS的早期诊断及预测具有重要的价值[5]。目前对其的免疫学检测主要有酶联免疫、放射免疫及发光免疫检测。其中， ELISA法检测应用较广，目前急迫的是如何提高ELISA法的敏感性、特异性，使PAPP-A检测在临床上得到更广泛的应用。本研究拟通过去除proMBP干扰，得到活性更高的PAPP-A蛋白，建立敏感性较高的克隆和重组PAPP-A蛋白的检测方法，并纯化重组蛋白制备抗体，为PAPP-A在ACS中的检测和机制研究提供实验依据。

1.1 材料 pET42a质粒、大肠埃希菌Top10菌株和BL21菌株均购自北京全式金公司；PAPP-A cDNA-质粒转化菌液购自美国Thermo公司。Trizol、2×EasyTaq PCR SuperMix、DNA Marker、Placenta cDNA、GAPDH购自北京康为世纪公司；Fastpfu、IPTG、X-gal、LB培养基各组分(胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉)、质粒小提试剂盒、镍柱、RNA酶抑制物购自北京全式金公司；HindⅢ限制性内切酶、EcoRI限制性内切酶、T4 DNA Liga购自TaKaRa公司；DNA琼脂凝胶回收试剂盒购自Solarbio公司；长片段PCR试剂盒购自Fermentas公司；MMuLV逆转录酶购自Promega公司；丙烯酰胺(Acr)、甲叉双丙烯酰胺(Bis)、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)

购自北京鼎国公司。SDS-PAGE试剂购自北京中山公司。Anke-GL-20G-H型离心机购自上海安亭科学仪器厂；紫外分光光度计购自上海仪器厂；HD-1B数显恒流泵、HD-A电脑采集器、HD-3紫外检测仪均购自上海沪西分析仪器公司；DYCZ-24EN型双垂直电泳槽购自北京市六一仪器厂；离子交换层析柱(2.6

cm×40 cm)购自瑞典Pharmacia公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的获取、扩增 根据DNAstar软件分析得到的编码PAPP-A特异抗原表位，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，在上、下游引物的5′及3′端分别加入保护碱基AT及A和粘性酶切位点。上游引物P1：5′-ATAAGCTTATGCGGCTCTGGA

GTTG-3′，下游引物P2：5′-AGAATTCGCAGCACCCA

ACTCCAG-3′ (其中下划线部分分别为HindⅢ及EcoRⅠ酶切位点)，由上海生工公司合成。以PAPP-A的cDNA-质粒转化菌液为模板(原液、1∶10稀释、1∶50稀释)进行PCR扩增，PCR循环参数：5×PCR反应缓冲液5 μL，2.5 mmol/L

dNTP 2.5 μL，0.01 mmol/L 上、下游引物各1 μL，0.5 μg cDNA-质粒模板4

μL，5×106 U/L 高保真Pfu Polymera 1 μL，2.0 mmol/L Mg2+0.5 μL，PCR

Stimulan 0.5 μL，ddH2O补足至25 μL。循环参数：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物行20 g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析系统下观察鉴定产物片段大小，并按照回收试剂盒说明书操作回收目的DNA。

1.2.2 制备重组质粒 将回收目的DNA和质粒载体pET42a分别用2个对应酶切位点的限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ切割，酶切体系包括：目的DNA片段1

μg，HindⅢ和EcoRⅠ限制性内切酶各1 μL，10×H Buffer 2 μL，ddH2O 8 μL。37 ℃温育4 h后，PAPP-A编码特异目的DNA用20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定并

按1.2.1步骤作回收凝胶中的目的DNA。质粒载体片段用同样方法经7 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，并从凝胶中回收特异酶切目的DNA。连接反应体系：0.08

μmol/L目的片段5 μL，0.04 μmol/L pET42a质粒1 μL， T4 DNA连接酶1 μL。置于16 ℃粘性连接过夜。转化至感受态大肠埃希菌Top10，在含Amp抗性的LB固体培养基平板上37 ℃培养过夜，并用1.2.1中PCR方法鉴定阳性重组子。用无菌牙签挑取阳性单克隆菌落至含Kan抗性LB培养液的菌种管，37 ℃、300

r/min振荡培养过夜，取部分菌液送上海英骏公司进行测序反应，另一部分菌液按照小量质粒制备试剂盒说明书操作提取质粒，并用内切酶进行双酶切鉴定。

1.2.3 融合蛋白的初步纯化与洗脱 取测序正确的含上述重组质粒转化大肠埃希菌BL21，在含Amp抗性的LB固体培养基平板上进行筛选阳性克隆。阳性克隆接种LB液体培养基，37 ℃振荡培养至吸光度(A600 nm)为0.6时，经0.1 mmol/L丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，37 ℃温育4 h。同时选择少量未诱导的阳性克隆作为阴性对照。4 ℃、8 000 r/min离心10 min，收集菌体，沉淀经过超声波破碎，再行8 000 r/min离心10 min，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE[6]，用包涵体洗涤液洗涤3次，每次5 min。10 000 r/min离心10 min，收集沉淀，在包涵体洗涤液中加入2 mol/L尿素重悬沉淀，16 ℃轻摇5 min，10 000 r/min离心10 min，收集沉淀。沉淀用8 mol/L尿素溶解包涵体，12 000 r/min离心10

min，收集上清得到蛋白质粗制品。粗制品过0.22 μm滤膜，再将上述蛋白质样品过镍柱层析，分别用50、250、500 mmol/L咪唑洗脱缓冲液浓度梯度洗脱目的蛋白，行初步纯化。

1.2.4 DEAE层析纯化 用DEAE A-50凝胶柱装柱，以0.01 mol/L Tris-HCl(pH

7.2)冲洗平衡后，镍柱粗提蛋白质样品上样，浓度梯度洗脱(NaCl浓度依次为0.15

mol/L、0.30 mol/L、0.45 mol/L)，收集体积为每管1 mL，收集的蛋白质组分以双抗体夹心ELISA法[7]检测活性以确定有PAPP-A活 性的洗脱峰。紫外分光光度

计检测其吸光度(A260 nm、A280 nm值)，按照公式：蛋白质浓度(g/L)=1.45×A280 nm-0.74×A260 nm鉴定的蛋白质浓度。将收集目的蛋白浓缩至2 mL，4 ℃保存。

2.1 PAPP-A cDNA质粒PCR结果 PAPP-A cDNA连接的质粒菌液测序后并未发生突变，PCR分析发现，在约309 bp处有特异条带，表明此条带是编码抗原表位的最强决定簇所在位置，cDNA原液及cDNA 1∶10稀释的条带明显。见图1。

2.2 pET42a质粒双酶切结果 质粒载体pET42a经HindⅢ、EcoRⅠ内切酶酶切后，琼脂糖凝胶电泳结果显示，条带清晰单一，证明pET42a质粒纯度以及浓度均达到要求。见图2。

2.3 诱导表达PAPP-A重组蛋白 通过PCR、酶切以及测序鉴定连接正确的重组质粒诱导表达PAPP-A重组蛋白，同时以未诱导的作为对照行SDS-PAGE分析。结果见图3。

2.4 目的蛋白经DEAE离子层析纯化 上述初步纯化处理的重组PAPP-A高活性蛋白混合浓缩液经DEAE A-50离子交换层析后分离效果。结果见图4。

2.5 目的蛋白质浓度 PAPP-A重组蛋白纯化后检测A260 nm=0.14、A280

nm=0.54，经计算PAPP-A蛋白浓度为0.22 g/L。

本实验室前期研究PAPP-A在孕妇产前筛查中的临床应用时，利用ELISA试剂盒检测孕妇血清中PAPP-A蛋白，取得了较为理想的结果。但结合部分文献及前期实验，认为检测孕妇血清中PAPP-A的ELISA检测体系并不适用于检测ACS患者血清PAPP-A检测。原因：(1)ACS患者血清PAPP-A含量极低，故ELISA试剂盒难以检测；(2)孕妇血清中PAPP-A与proMBP以2∶2比例结合，在ACS患者血清PAPP-A不与proMBP结合，所以两者检测的目的蛋白可能有差异。有研究把PAPP-A/proMBP作为复合物进行检测[8]，结果显示复合物浓度与ACS斑块发展

有良好相关性，然而，Qin等[9]认为迄今为止临床研究中多利用PAPP-A/proMBP作为复合物检测ACS，但是这并非最优方法。所以，排除proMBP的干扰，建立检测PAPP-A蛋白的方法值得研究。据此本研究设计、筛选出PAPP-A特异表位，以PAPP-A的cDNA-质粒转化菌液为模板，PCR结果表明，目的蛋白位置在309 bp处。且作为载体的pET42a质粒纯度以及浓度均达到要求，表明本实验成功转化制备PAPP-A重组蛋白，电泳结果显示诱导菌液有目的条带，未诱导菌液则条带呈阴性。

本研究针对抗原决定簇集中的位置，克隆重组制备出PAPP-A重组抗原蛋白，以此为抗原制备的抗体，在后续超敏检测体系的建立中有效排除非proMBP及特异表位的干扰。但制备的重组PAPP-A抗原经过镍柱初步纯化并经SDS-PAGE鉴定，发现仍有大量杂质杂质。PAPP-A等电点(pI)为4.4～4.6，在缓冲液pH 7.2时带负电，与阴离子交换介质具有较强的亲和作用，因此将PAPP-A经离子柱层析纯化后，第一峰1～3组分为杂质蛋白，第二峰4～6组分为目的重组蛋白，有效去除杂质蛋白，表明离子交换层析是一种重要的纯化蛋白方式[10]。

本研究通过DNAstar分析找出感兴趣的特异编码抗原表位的区域克隆扩增，克隆片段的长度易于PCR，筛选出PAPP-A特异表位并以此制备重组PAPP-A在临床检验中检测中排除proMBP及非特异表位的干扰增强了特异性，下一步再研究提高PAPP-A检测敏感性使PAPP-A临床检测应用得到进一步的发展。

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