大黄素甲醚在设备制作靶向G-四联体抗癌药物中的应用的生产技术_

2023年12月31日发(作者：安全文章)

图片简介:本技术提供了大黄素甲醚在制备靶向G四联体抗癌药物中的应用，属于抗癌药物技术领域。大黄素甲醚在制备靶向G四联体抗癌药物中的应用。原癌基因的启动子区域可能形成G四联体结构，转录过程解链时易形成的G四联体结构，所述大黄素甲醚作为小分子配体具有强烈的G四联体结构相互作用特征，增强G四联体结构的稳定性，从而实现对原癌基因过表达的抑制作用，发挥抗癌药效。经体外实验证明，与已知的能结合并稳定G4结构的小分子配体槲皮素和山萘酚相比，大黄素甲醚比槲皮素和山萘酚的影响更加显著，尤其是呈现出比较独特的使G四联体形成核酸酶酶活性降低的作用，这表明大黄素甲醚具有较强的与G四联体结构相互作用的能力。技术要求1.一种具体如式(1)所示的大黄素甲醚在制备靶向G-四联体抗癌药物中的应用；2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述G-四联体包括原癌基因形成的分子内平行型G-四联体结构。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述原癌基因包括c-myc、bcl-2、VEGF、Ret、c-kit1和Hif1a中的一种或多种。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，原癌基因c-myc的启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，原癌基因bcl-2的启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，原癌基因VEGF的启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示。7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，原癌基因Ret的启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示。8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，原癌基因c-kit1的启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示。9.根据权利要求1～8任意一项所述的应用，其特征在于，原癌基因Hif1a的启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述大黄素甲醚在药物中的浓度为2～10μmol/L。技术说明书大黄素甲醚在制备靶向G-四联体抗癌药物中的应用技术领域

本技术属于抗癌药物技术领域，具体涉及大黄素甲醚在制备靶向G-四联体抗癌药物中的应用。背景技术富含鸟嘌呤的脱氧核酸序列(DNA)或核酸序列(RNA)能在体内外形成非经典的核酸二级结构，称为G-四联体(G4)。G-四联体结构在生理条件下具有高度的热力酶松开，但当DNA复制压力增大时，G4结构往往是基因组发生不稳定的一个常见因素。许多原癌基因的启动子区域含有可能形成该结构的基序，称为pG4 m转录过程中该富G序列的解链可能导致G4结构的形成，而这将抑制原癌基因的转录和过表达。因此能够特异稳定G4结构(包括癌基因及端粒G4)的小分子配体目前已报道的能稳定G4的配体已经不少，但普遍存在毒性过大的问题。例如应用于临床研究的四联体靶向药物CX-3543，虽然CX-3543是作为化疗药物用于晚相容性的原因没有通过II期临床实验。因此，四联体靶向药物的毒性问题是该研究领域亟待解决的重要方向。众所周知，天然药物经过人们的长期实践，在规定的剂量下副作用较小。有许多中药及其活性成分具有抗癌作用，其中已经发现一些成分具有G四联体小分子槲皮素和山萘酚等等，现有技术的报道发现它们也能够稳定特定的G-四联体结构并一定程度上影响某些原癌基因的过表达。这种抑制效应是由与G-四联体的制作用还不清楚，中药来源的活性物质作为G-四联体小分子配体不易产生毒性。然而上述G-四联体小分子配体只能对原癌基因形成的特定G-四联体结构有影癌药物有限制。技术内容有鉴于此，本技术的目的在于提供大黄素甲醚在制备靶向G-四联体抗癌药物中的应用，提供了一种新的靶向G-四联体抗癌药物，稳定体内G4结构的对癌基因为了实现上述技术目的，本技术提供以下技术方案：本技术提供了一种具体如式(1)所示的大黄素甲醚在制备靶向G-四联体抗癌药物中的应用；优选的，所述G-四联体包括原癌基因形成的分子内平行型G-四联体结构。优选的，所述原癌基因包括c-myc、bcl-2、VEGF、Ret、c-kit1和Hif1a中的一种或多种。优选的，原癌基因c-myc的启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。优选的，原癌基因bcl-2的启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。优选的，原癌基因VEGF的启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示。优选的，原癌基因Ret的启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示。优选的，原癌基因c-kit1的启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示。优选的，原癌基因Hif1a的启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示。所述大黄素甲醚在药物中的浓度为2～10μmol/L。

本技术提供的具体如式(1)所示的大黄素甲醚在制备靶向G-四联体抗癌药物中的应用，原癌基因的启动子区域含有可能形成G-四联体结构的基序，转录过程解为小分子配体具有强烈的G-四联体结构相互作用特征，增强G-四联体结构的稳定性，从而实现对原癌基因过表达的抑制作用，发挥抗癌药效。经体外实验证配体槲皮素和山萘酚相比，大黄素甲醚比槲皮素和山萘酚的影响更加显著，尤其是呈现出比较独特的使酶活性降低的作用，这表明大黄素甲醚具有较强的与本技术提供的大黄素甲醚在制备靶向G-四联体抗癌药物中的应用，进一步限定了所述G-四联体结构为原癌基因形成的平行型G-四联体结构，所述平行型G-四呈现反几何特点。这种结构的特点是圆二色谱结果出现典型的260nm附近的一个大的正峰及240nm附近一个较小的负峰。经圆二色谱法检测实验表明，与端粒特点为：292nm正峰，端粒G-四联体序列出现混合型特点)相比，本技术提供的大黄素甲醚仅对平行型G-四联体结构具有强烈的相互作用，稳定平行型G-四联的。附图说明图1为圆二色谱法检测G-四联体结构及部分药品对G-四联体结构的影响；图2为部分阳性结果在适宜浓度时可观察到显色程度的明显差异；图3为RT-PCR检测六种癌基因的mRNA表达水平的改变。具体实施方式本技术提供了一种具体如式(1)所示的大黄素甲醚在制备靶向G-四联体抗癌药物中的应用；在本技术中，原癌基因的启动子区域含有可能形成pG4motif结构的基序，转录过程解链时易形成的G-四联体结构，所述大黄素甲醚作为小分子配体具有强烈的稳定性，从而实现对原癌基因过表达的抑制作用，发挥抗癌药效。在本技术中，所述G-四联体优选包括原癌基因形成的分子内平行型G-四联体结构。所述原癌基因优选包括c-myc、bcl-2、VEGF、Ret、c-kit1和Hif1a中的一种选如序列表中SEQ ID No.1所示。原癌基因bcl-2的启动子的核苷酸序列优选如序列表中SEQ ID No.2所示。原癌基因VEGF的启动子的核苷酸序列优选如序列酸序列优选如序列表中SEQ ID No.4所示。原癌基因c-kit1的启动子的核苷酸序列优选如序列表中SEQ ID No.5所示。原癌基因Hif1a的启动子的核苷酸序列优选在本技术中，在体外实验中，所述大黄素甲醚和形成G-四联体结构的原癌基因核苷酸序列的质量比优选为2.5:1。所述大黄素甲醚在药物中的浓度为2～10μm制，采用本领域技术人员所熟知的大黄素甲醚的购买渠道即可。大黄素甲醚溶液的有效浓度优选为DNA浓度的2.5倍。所述大黄素甲醚溶液的溶剂优选为氯仿度优选为2～10μmol/L，更优选为4μmol/L。

在本技术中，验证大黄素甲醚作为小分子配体发挥抗癌药效优选采用体外检测方法进行。所述体外检测机理如下：G-四联体结构可以与血红素特异结合形成酶活性。在底物ABTS及H2O2存在时，该酶可催化反应液在可见光波段出现特征吸收峰(A414)。其吸光度值的变化反映了GHC过氧化氢酶的活性。由于酶活的变化反映G-四联体结构的稳定性。在本技术中，所述抗癌药物中大黄素甲醚的有效浓度优选为5～10μmol/L。1mg大黄素甲醚溶于348μl氯仿得到10mmol/L母液，在-20℃条件下保存。使用时，用本技术对所述抗癌药物的剂型没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的抗癌药物的剂型即可。本技术对所述抗癌药物的制备方法没有特殊限制，采用本下面结合实施例对本技术提供的大黄素甲醚在制备靶向G-四联体抗癌药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本技术保护范围的限定。实施例1利用光谱学方法对大黄素甲醚和其他多种中药活性成分对G-四联体结构的影响1、溶剂的配制6种原癌基因启动子区域的pG4(序列见SEQ ID No.1～6)以及端粒序列(SEQ IDNo.7)共7条DNA片段用水配成100μM母液，-20度储存。(一)有分光光度计时：6种特定原癌基因启动子区域的G-四联体序列c-myc，5’TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAGG3’；(SEQ ID No.1)bcl-2，5’GGGCGGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGG3’；(SEQ ID No.2)VEGF，5’GGGCGGGCCGGGGGCGGG3’；(SEQ ID No.3)Ret,5’GGGCGGGGCGGGGCGGG3’；(SEQ ID No.4)c-kit1，5’AGAGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGGGCT3’(SEQ ID No.5)；Hif1a，5’GGGAGGGGAGAGGGGGCGGG3’；(SEQ ID No.6)。端粒序列基因启动子区域的G-四联体序列：Telo，5’TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA3’(SEQ ID No.7)。用水将上述原癌基因启动子区域序列配成100μM母液，-20℃储存。待测小分子药品包括大黄素甲醚和28种其他药物活性物质，部分药物活性物质具体见表1。40KT缓冲液(50mM MES,100mM Tris,40mM KCl,0.05％Triton X-100,1％DMSO,pH6.2)。特殊试剂：ABTS：2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)二铵盐，Sigma货号：A1888。2、实验方法参见表1。表1为不同稀释度的大黄素甲醚对不同GHC酶的活性影响

选择不同的实验浓度：上表1中列出了三种检测浓度，取决于对照组的GHC酶活性的高低。原因是部分GHC在实验条件下显色过快，很快就超过了仪器所能检按2.5倍DNA浓度加入待测药品小分子共29种，避光室温静置1h后加入同药品浓度的hemin，避光室温静置0.5h。底物液浓度：ABTS 2mmol/L(用除氧水新鲜配后，立即计时并测定A414。数据处理结果在excel中表2记载。表2大黄素甲醚和其他中药成分对7种GHC过氧化氢酶活性结果(N≥3)

注：+”或“－”均代表阳性结果，具体平均酶活性增加>10％记“+”，>20％记“++”>50％记“+++”，减少记为“－”依次类推；空白代表酶活性阴性结果。

由表2可知，具有显著变化的12种活性成分。将定义酶活性变化幅度超过10％以上的结果为阳性。这提示它们可能与G4结构存在较强的相互作用。其中槲皮素配体。在其他的分子中，大黄素甲醚比槲皮素和山萘酚的影响更加显著，尤其是呈现出比较独特的使酶活性降低的作用。筛选的分子中大黄素甲醚具有最强7种不同GHC的过氧化氢酶活性影响皆不显著(1个“+”/“－”的阳性结果数目≤1)。这些药品包括：黄藤素、大黄素、姜黄素、木犀草素、金雀异黄酮、扁桃苷、藤皂苷元、盐酸黄连碱、冬凌草甲素、野黄芩苷、熊果酸及小檗碱。颜色反应结果具体见图2。实验发现：6种原癌基因启动子区域的pG4以及端粒序列共7条DNA片段，在体外G4折叠条件下(本方法中40mM 40KT缓冲液)与血红素复合后加入底物，均表大。这说明，不同序列形成的G4结构并不一样。定量测定了7种GHC反应前3～5min内吸光度值的变化，发现对时间呈现良好的线性关系(酶促反应速率一般即我们用拟合直线的斜率来表征过氧化氢酶活性。因为不同GCH酶活性高低不同，又将7种DNA分为三组，分别以2μM，4μM及10μM的DNA浓度开展定量筛选实施例2为了进一步确认大黄素甲醚与G4结构的相互作用，使用了四联体结构研究中的常用方法-圆二色谱法(CD)测定上述不同G4结构以及在与槲皮素、山萘酚、大(CD)是确认G-四联体结构的标准方法。所述标准方法具体包括以下步骤：检测仪器：Applied Photophysics(英国)圆二色光谱仪。检测体系：对实施例1中表1的GHC酶活性受槲皮素、山萘酚、大黄素甲醚影响超过20％以上的结果进行了CD检测。DNA浓度见图1，溶于40KT，90℃，30mDNA浓度)后避光室温静置1h。Hemin：同药品浓度，加入后避光室温静置0.5h。检测条件：温度20℃，径宽2mm，HV(CDDC channel):239.822v，Time-per-poSize:1nm。数据处理：excel、SciDAVis。G4结构具有不同的构型，主要以连续G形成该结构的四边走向来区分。相邻的连续G链空间走向出现一致的情况称为平行型G4结构。平行G4结构在CD结果中实验条件40KT缓冲液中，6种癌基因的pG4序列均呈现出典型的平行型G4结构，而端粒G4则呈现出混合型结构的特点(图1-A)。仅Ret-GHC的结构受大黄素甲醚影响发生了一定程度的改变(图1-D)。其他结构在药品作用前后，CD几乎没有任何显著变化。Hoostgen氢键形成的四个G组成它的空间结构参数可能主要取决于序列本身包含的信息(如连续G之间的碱基类型和数量)以及缓冲液条件等。在一定条件下，小分子或者蛋白质的结合并不会出大黄素甲醚与其具有相当强烈的作用。实施例3大黄素甲醚具有稳定细胞内G-四联体结构的检测用Phen-DC3处理Mgs1功能缺失的细胞株，会引起细胞生长显著变慢。这是因为Phen-DC3增加了pG4处的复制压力。在该体系中测试了大黄素甲醚的作用，具1、Mgs1Δ酵母株的构建实验细胞株为野生型W303 RAD5+酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，ein)及其背景上构建的突变株。构建Mgs1基因翻译开放阅读框缺失的方法见文27.)，破坏片段的制备：质粒pRS304，引物5’-aatagcttat tagcagaaga acgctagcgg taagatctga aacaggatcgcacagtctca CGTTTCGGTGATGAC 3’(SEQ ID No.8)，5’-aaca1300bp。2、酵母倍增时间的测定ccttga TTCCTGATGCGGTATTTTCTCCT 3’(SEQ IDNo.9)，PCR条件：25μl体系，扩增程序为94℃4min一个循环，94℃，1min，52℃，45s，72℃，2min，35酿酒酵母细胞YEPD过夜培养后，重新接种至浓度OD6000.15，样品组中加入大黄素甲醚(10μM)。在第一个90min后每60min记录OD600值至达到1.5。通过以下μ＝(logOD2-logOD1)/loge(t2-t1)t倍增时间＝ln2/μ。表3大黄素甲醚对野生型及Mgs1Δ酵母株生长倍增时间的影响

基因型野生型无药品Phen-DC3大黄素甲醚93.5±1.790.8±1.194.6±2.7Mgs1P值93.0±2.6104.5±3.299.0±1.70.1850.01860.0228近期发现酿酒酵母中的一种蛋白质Mgs1(The yeast maintenance of genomestability 1)具有细胞内处理G4结构的能力。Phen-DC3是以前报道的一种能在体内高度特Heddi，F .-.2014，53(4):999-1002.)。用Phen-DC3处理Mgs1功能缺失的细胞株，会引起细胞生长显著变慢。这是因为Phen-DC3由表3所示，在Mgs1Δ酵母株中，大黄素甲醚也能同样引起细胞生长明显变缓，结果说明，大黄素甲醚是一种潜在的体内G-四联体稳定剂。实施例4细胞水平检测若干癌基因的表达水平受大黄素甲醚的影响素甲醚的作用(表3列出了对比的数据)。结果显示在Mgs1Δ酵母株中，大黄素甲醚也能同样引起细胞生长明显变缓，虽然效果不及Phen-DC3影响大，但该结果大黄素甲醚、槲皮素和山萘酚分别处理乳腺癌细胞MDA-MB-231，每个处理组设置3个平行，大黄素甲醚、槲皮素和山萘酚的处理浓度分别为5μmol/L。处理实时定量PCR的方法具体如下：Trizol法提取乳腺癌细胞MDA-MB-231的总RNA，分光光度法定量及检测总RNA质量。SYBR Green法(Premix Ex TaqTMII，TaKaRa，中国序如下：98℃预变性5min；95℃变性20c，55℃退火30c，72℃延伸1min，共运行40个循环；然后运行标准溶解曲线。目标基因的相对表达量用2-ΔΔCt表4扩增6个癌基因及内参基因的引物信息

结果见图3。图3为RT-PCR检测六种癌基因的mRNA表达水平的改变。槲皮素和山萘酚是已有报道的，具有抗癌效果的天然药物活性成份，而大黄素甲醚目前实验结果显示，大黄素甲醚对c-myc，bcl2，Ret，Hif1a等癌基因的表达具有明显的抑制效果。而且相比槲皮素和山萘酚，大黄素甲醚在本实验中表现出最高以上所述仅是本技术的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些序列表<110>

南京医科大学<120>

大黄素甲醚在制备靶向G-四联体抗癌药物中的应用<160> 23<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 24<212> DNA<213>

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