牛轮状病毒研究进展

2023年12月27日发(作者：鸡蛋西红柿汤面)

试验研究 | Experimental rearch牛轮状病毒研究进展刘占悝1，刘泽余2，李智杰1，郭利1（1.中国农业科学院特产研究所，长春 130122；2.吉林农业大学，长春 130000）摘要：牛轮状病毒（Bovine Rotavirus，BRV）是引起幼龄牛腹泻的主要病原体，可通过胎盘垂直传播。多表现为精神萎靡，食欲不振、腹泻、呕吐、脱水等临床症状，且多数为隐性感染。当环境条件适宜时，可引起该病的暴发与流行，对牛养殖业造成了巨大的经济损失。该文综述了轮状病毒的流行情况、腹泻机制、检测方法、疫苗的研制和药物研究等方面。关键词：牛轮状病毒；流行情况；发病机制；检测方法；免疫预防；药物研发中图分类号：Ｓ８２３　　　　　　文献标识码：Ｂ　　　　　　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９６－３６３７．２０１９．２０．００１0 引言牛轮状病毒（Bovine Rotavirus，BRV）是危害牛养殖业的重要的病原之一，常造成隐性感染。患病牛和隐性感染牛可持续向体外排毒成为主要的感染源。该病可通过粪-口途径传播[1]，不合格的饲养条件和不规范的管理制度也是导致该病流行的主要原因之一。BRV主要引起7日龄内的犊牛发病，发病率为50%～100%，病死率则根据是否引起产肠毒素大肠杆菌的混合感染而变化较大。研究表明牛轮状病毒主要感染空肠和回肠成熟的绒毛上皮细胞。轮状病毒除感染牛外，还会感染其他哺乳动物（如猪、羊、猫、狗等）、禽类（如鸡、火鸡等）及野生动物（如鹿等）。2016年Anbalagan S[3]等从幼鹿中分离出一株A型轮状病毒14-02218-2，此株病毒与牛轮状病毒有关。鹿轮状病毒多引起2～5日龄仔鹿发病，病程2～3 d呈急性经过。[2]泛关注。后来又根据细胞的糖蛋白VP7和蛋白酶敏感蛋白

VP4 的基因型G和P区别新分离病毒的基因型，目前已经有27个G型和35个P型[9]。据报道，全球的牛轮状病毒流行优势株为G10P11，G10P5和G10P1[10]，而在国内则以G6为优势流行毒株，G10只在部分地区流行[11]。3 临床症状新生犊牛最易感BRV，多发生在晚秋、冬季和早春，天气寒冷或是天气变化较大的时间。7日龄内的犊牛最易感，此时病畜表现为精神萎靡、流涎、不愿站立。到8-14日龄时，表现为严重的水样腹泻，尾部沾染黄色的粪便。犊牛因严重的腹泻导致脱水，眼部凹陷、四肢无力。通常因机体抵抗力的减退导致继发性的细菌感染。若不及时治疗，病牛可能在腹泻后72 h内死亡。解剖病死犊牛，可观察到肠壁变薄，肠内容物呈黄色或是红色，并可能含有脱落的肠粘膜。显微镜观察，表现为肠绒毛萎缩，上皮细胞脱落。1 病原牛轮状病毒属于呼肠孤病毒科轮状病毒属的双股RNA病毒。1969年Mebus最早在犊牛中发现轮状病毒，之后澳大利亚科学家也发现了同类病毒，Thomas Henr Flewett使用电子显微镜观察该病毒后， 根据其形态特征建议将其命名为轮状病毒[5]。各种动物和人的轮状病毒的形态相同，是一种无囊膜的病毒。电镜观察，BRV为形似车轮的粒子，完整的病毒粒子呈二十面体，直径约65～75 nm[6]，有短的且外缘光滑。[4]4 致病机理轮状病毒的发病机制可以大致分为4种：①轮状病毒感染小肠上皮细胞后[12]，可以通过胃肠屏障进入血液循环，随血液循环至全身的各个器官，对其他的内脏器官造成伤害。②轮状病毒的融合素蛋白VP4在肠道胰酶的作用下水解为对病毒入侵宿主细胞早期起重要作用的VP8和VP5。③病毒侵染小肠上皮细胞后编码的非结构蛋白糖基化，细胞膜对钙离子的通透性增加，导致肠道电解质的平衡失调，进而导致腹泻的发生。④病毒感染初期，通过抑制宿主细胞的凋亡而逃避细胞免疫的发生，对病毒感染早期的增值起到重要的作。2 流行情况随着对牛轮状病毒研究的不断深入，人们逐渐认识到牛轮状病毒是引起犊牛腹泻的主要病原体之一[7]。为更清晰地了解该病毒，根据其中层蛋白VP6抗原特异性的差异，人为地将该病毒分为A-G 7个抗原型。7种抗原型中只有A-C型既能感染人又能感染动物，其中A型是引起犊牛腹泻的最主要原因之一，引起了兽医及科研工作者的广[8]5 实验室诊断牛轮状病毒的普遍存在和隐性感染，使对该病的快速准确的检测显得非常必要，对疾病的预防控制和临床诊治起到至关重要的作用。目前检测该病的诊断方法有多种，每种诊断方法都有其优点和其不足之处。需要根据实际的情况进行选择，最好的方法是根据实际需要，选择适宜的多种检测方法配合使用，以提高检测的准确性和说服力，为诊断和治疗疾病提供更好的治疗方案。在生产实践中如何提高检测的灵敏性和特异性，降低检测成本，建立适用于基层牛场的病原检测方法是疫病检测的主要目标。现对几种常用检测方法进行简单的介绍。5.1 乳胶凝集反应（LAT）乳胶凝集反应是以乳胶颗粒作为载体的一种间接凝集基金项目：吉林省科技厅产业技术创新战略联盟项目（2NY）；国家重点研发计划：畜禽重大疫病防控于高效安全养殖综合技术研发（2016YFD0500907）

作者简介：刘占悝（1996-），男，汉族，河南洛阳人，硕士研究生，研究方向：兽医。通信作者：郭利。2019.20·Copyright©博看网 . All Rights Rerved.1

Experimental rearch | 试验研究试验。其原理是用载体吸附可溶性抗原于其表面，特异性抗体与之结合后，产生的凝集反应。检测的优点是很容易在短时间内完成，不需要昂贵的设备或熟练的人员，并且试剂具有长保质期。这些因素使得LAT适合作为牛轮状病毒的快速筛选试验在临床实验室中高效使用，对临床的大批量检测起到重要的作用。灵敏度和特异性分别为87.85%和73.3%。与ELISA相比，乳胶凝集显示出100%的敏感性和96.3%的特异性[13]。但是样品的复杂性会影响检测结果的准确性。5.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫吸附试验是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。该方法同样无需高昂的仪器设备，操作简单，灵敏度较乳胶凝集反应特异性更高，更加快速灵敏。可以直接检测样品中病毒的大致含量，反应牛的感染情况及程度，利于该病毒的动态监测以及批量检测。李云富[14]等建立了BRV抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法，该方法线性好，特异性强，灵敏度高，准确性好，可用于BRV疫苗生产中间品及终产品的抗原定量检测。5.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝胶电泳是根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带的方法，该方法特异性强，还可以鉴别牛轮状病毒的种群。该方法不需要特殊的设备及操作简单，可同时用于大量样品的检测。其缺点是轮状病毒RNA样品易被降解，导致检测的结果不准确。Choudhary P[15]（BCV）和牛逆转录病毒（BToV），其中B型检测量为106 copies/mL。王梓[18]等用牛轮状病毒NCDV株VP6基因保守区设计引物，建立了SYBR Green荧光定量的检测方法。该方法检测的最低量为15.39 copies/L，且特异性强，灵敏度高，可实现牛轮状病毒早期的快速检测。李凡[19]等建立了基于恒温隔绝PCR （insulated isothermal PCR， iiPCR）

技术，该技术主要利用热对流原理，通过加热容器底部的液体，产生上下液体之间的温差，形成液体的循环，并持续加热和维持循环，形成稳定的温度梯度。此时，通过容器的设计巧妙地控制对流时间和散热速率，可以形成适合PCR的反应环境。反应只需要42 min，结果直接显示在屏幕上，检测限度达96.6 copies/uL。与传统PCR仪相比，该技术缩短了反应时间，仪器轻便易操作，实现了现场程序化病原体检测，适合基层快速诊断。6 牛轮状病毒疫苗疫苗的免疫接种是预防BRV的主要手段，常见的疫苗有灭活疫苗和减毒活疫苗。灭活疫苗稳定性好，易于保存运输，生产过程简单，可避免其他外原因子的污染。近年，随着技术的不断进步和发展，基因工程疫苗也得到快速的发展，如嵌合疫苗、转基因疫苗和亚单位疫苗等。最初源于新德里一名治愈儿童的体内分离的一株减毒的RV[20]。是印度自主研制的RV疫苗，即单价人-牛重配疫苗[21]。第一代轮状病毒疫苗是恒河猴人类重组轮状病毒四价疫苗，但由于接种疫苗后很容易在短时间内发生肠套叠，因此禁止接种。出于这个原因，科学家已经开发出单价和重组减毒疫苗、转基因植物口服疫苗和亚单位疫苗。世界范围内唯一的商品化BRV减毒疫苗（NCDV-lincoln株）已经获得USDA的批文[22]。目前印度血-清研究所与国家过敏研究所合作开发了含有轮状病毒人牛（UK）重组血清型G1、G2、G3、G4和G9的轮状病毒五价疫苗（BRV-PV）。疫苗接受了动物研究以及成人，幼儿和婴儿的I期和II期研究。研究证实该疫苗安全性好，且具有良好的免疫原性[23]。Anil K[24]等在成人中对该疫苗的安全性和耐受性进行了测试，结果显示该疫苗在成人中安全并且耐受性良好。接下来在婴幼儿人群中进一步测试疫苗以进一步评估。此外疫苗的研究还面临巨大的挑战。首先，疫苗的安全性是最为关键的问题。不仅仅是对被免疫动物起到保护，不发生肠套叠等安全问题。而且还要防止被免疫动物对外排毒所造成的一系列问题。其次，疫苗的保护效果也是一项艰巨的任务。流行毒株的不同、季节的变化、区域的差异以及被免疫动物的年龄、体重、的不同，都会导致疫苗保护效果产生巨大的差异。等进行的乳胶凝集试验显示25只新生羊羔和4只儿童粪便样本呈轮状病毒阳性。然而，RNA-PAGE显示只有9只羊羔粪便样本呈阳性。PAGE检出率低于LAT可能原因是RNA大量降解造成的。5.4 RT-LAMP反转录-环介导等温扩增技术操作简单、结果不需要借助特殊的设备而清晰可见，检测范围广泛。其特异性与灵敏度与PCR相当，成本远低于荧光定量PCR。此方法有望成为新的临床检测的手段。Xie Z[16]等建立了逆转录环介导的等温扩增（RT-LAMP）测定并优化BRV的快速检测。以BRV的新生小牛腹泻病毒（NCDV）毒株VP6基因的序列设计特异性引物组。RT-LAMP测定在63 ℃的水浴中进行60

min，并且扩增产物直接或在紫外光下可见。该BRV的RT-LAMP测定方法可特异性地检测到3.32 copies的A型BRV，与其他牛病原体没有交叉反应。但是该方法易产生假阳性的结果，导致检测准确性的降低。5.5 PCR用于BRV检测的是RT-PCR技术，此外，还有实时荧光定量PCR技术、多重PCR技术。实时PCR作为诊断工具的应用已被广泛接受，因为它提供了快速、定量和可靠的测量，检测灵敏度可达2.5 copies/reaction[1]。多重PCR可用于多种病原的同时检测，提高效率，节省检测的时间。Fukuda M[17]等建立了检测牛轮状病毒A-C型、牛冠状病毒7 药物研发牛轮状病毒在全球的广泛流行及其居高不下的患病率，使治疗牛轮状病毒药物的研发势在必行。根据该病的发病原因和造成的症状来研制治疗该病的药物。例如在调节电解质平衡、抑制病毒的复制、调节微生物的平衡、提高感染动物免疫力、保护肠道黏膜以及中医的调理等方面进行药物的研发。一方面，通过阻断该病发生过程中的各2

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试验研究 | Experimental rearch个阶段来阻止该病的发生，另一个方面，通过提高动物自身抵抗病毒的能力达到对该病的预防。如病毒需要通过内吞途径进入细胞，该途径将病毒颗粒递送至称为早期内体（EEs）的囊泡细胞器。一些病毒从EEs到达细胞质，其他病毒进入细胞更深处。Díaz-Salinas MA等证明大多数BRV株必须流向LE，该机制显示由甘露糖-6-磷酸受体介导的从高尔基复合体到LE的内溶酶体蛋白酶的运输对于病毒退出囊泡隔室是必需的，并且可有效地启动病毒复制，这种病毒的入侵机制与病毒蛋白VP4有关[25]。[11] 陈军，杨彪，谢金鑫．牛轮状病毒的流行情况及预防措施[J]．养殖技术顾问，2011（2）： 195．[12] Dhama K，R S Chauhan，M Mahendran，et al．Rotavirus

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