猪肺炎支原体MY_99株P46基因的序列分析

2023年12月22日发(作者：成长的路上作文)

中国畜牧兽医　2010年第37卷第4期生物技术・103・猪肺炎支原体MY299株P46基因的序列分析熊丁杰,熊焰,蔺露(四川农业大学动物科技学院,雅安　625014)摘要:提取猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)MY299株DNA,利用设计的一对引物扩增编码P46蛋白的基因,将扩增产物克隆到pMD182T载体,挑取2个克隆株测序。测序结果表明,P46基因全长1134bp,编码378个氨基酸,序列的182、381和734位有3个TGA,是编码色氨酸Trp的密码子。2个克隆株的测序结果与标准株232株的P46基因序列相比,其同源性分别为99.6%和99.2%。关键词:猪肺炎支原体;P46基因;序列分析中图分类号:S858.28　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:167127236(203　　猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae,)Mhp)可引起猪支原体肺炎(MPS,又称“喘气病”。MPS是一种发病率高,死亡率低的慢性疾病,单纯的猪肺炎支原体感染主要引发猪的慢性肺炎,当该病与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型或猪流感病毒混合感染时就会发生常见的猪呼吸道疾病综合征(PRDC),对养猪业造成严重破坏(Barbara等,2006)。猪肺炎支原体有3个主要的体无交叉反应(Satoshi等,1995)。本研究旨在分析四川田间分离株MY299与标准株的同源性,为今后利用MY299株研发诊断用抗原和基因疫苗奠定基础。1　材料与方法1.1　材料1.1.1　菌株　猪肺炎支原体MY299株由四川农业抗原基因:P97、P101和P46,其中P46基因及编码的蛋白质具有很高的保守性,对Mhp的诊断具有重要意义,利用在中表达的猪肺炎支原体J株46ku的表面抗原(P46蛋白),在Mhp发病早期进行ELISA诊断,发现其与猪的其他支原收稿日期:2009210227作者简介:熊丁杰(1984-),男,四川人,硕士生,研究方向:分子病毒学。通信作者:熊焰(1955-),男。E2mail:xyan2004@基金项目:四川省畜牧食品局资助项目(2004):猪气喘病病原分子生物学特性及疫苗研究。大学动医学院微生物实验室保存(孙霞等,2001);大α购自成都博瑞克有限公司;肠杆菌DH5CompetentCellJM109、pMD182T载体购自大连宝生物公司。1.1.2　试剂　蛋白酶K溶液(20mg/mL)购自Amersco;Goldview购自赛百胜;琼脂糖Agaro购自Promega。EDTA、Tris、SDS、丙烯酰胺(Acr)、甲叉双丙烯酰胺(Bis)、过硫酸铵、巯基乙醇和EDTA等均购自生物试剂公司。1.1.3　仪器　离心机(EppendorfCentrifuge5804R);PCR仪(Eppendorf,Mastercycler);电泳仪(Bio2Rad),电泳槽(Bio2Radmini2subcellGT);紫外iationof155nucleotideallweredetectedincodingandnoncodingre2gionbycomparingJuemapigwithother14breeds,and119outofthemwereinintronregionsand28outofthemwereinexonregions,with104transversions,14commutations,23abnces,ubstitutivesitesofbasicgroup,mostwastransversionmutations;thecomparisionbetweentransversionandcommutationswas7.43∶1,centageanddivergencenumberofJuemapig’sgrowthhormonegenehomologyan2alyshowedthathomologywasnearerbycomparingJuemapigwithotherminitypepig,15kindsanaly,whichindicatedJuemapighavingfardistantgeneticrelationshipwiththeVizepig;JuemapigandRongjiangpig’ds:Juemaswine;growthhormonegene;homology;polymorphism

・104・生物技术中国畜牧兽医　2010年第37卷第4期检测仪(北京六一厂,WD29403C型);PCR引物由2.2　P46基因的克隆及重组质粒的鉴定　从克隆上海生物工程有限公司合成;测序由大连宝生物工平板上挑取单个菌落,以M13247/RV2M为引物进程有限公司完成。行PCR扩增,出现了1.1kb左右的条带,挑取其中21.1.4　培养基　猪肺炎支原体培养基按ATCC猪个阳性菌落命名为CTB56023和CTB56026(图2)。肺炎支原体培养基配方配制。1.2　方法1.2.1　引物设计　利用Oligo6.0引物设计软件,根据GenBank上猪肺炎支原体国际标准株232株的P46基因和全基因,设计出一对扩增P46基因的最佳引物。并分别在上下引物之前加入BamHI和HindIII酶切位点,引物由宝生物工程公司合成。上游引物,5′2CGGGATCCACTTCAGATTCTA2AACCACAA23′;下游引物,5′2CGAAGCTTT2TAGGCATCAGGATTATCAACA23′。1.2.2　猪肺炎支原体P46基因的PCR扩增　用设计的引物对猪肺炎支原体MY299的DNA模板进行PCR扩增。扩增体系为20μL(10×buffer2μL,2.5mmol/LdNTP0.5μL,上游引物0.5μL,下游引物0.5μL,TaqDNA酶0.5μL,模板1.5μL,3.0mmol/LMgCl23μL,灭菌去离子水11.5μL)。反应条件为94℃4min;94℃30s,58℃30s,72℃1min,35个循环;72℃10min。1.2.3　猪肺炎支原体P46基因与T载体的连接　2.3　P46基因的序列测定结果及推导氨基酸序列使用TaKaRaDNAA2TailingKit在扩增PCR产分析　测序结果表明,克隆的P46基因全长1134物的两端加A,再将其与pMD2T载体在TaKaRabp,编码378个氨基酸,其中3个TGA是色氨酸的DNALigationkit的solutionI中进行连接,连接温度为16℃。连接产物热转化至感受态大肠杆菌mpetentCellJM109中,涂布平板,过夜培养。从转化平板上挑取单菌落,用pMD2T载体通用引物(M13247,5′2CGCCAGGGTTTTCCCAGT2CACGAC23′;RV2M,5′2GAGCGGATAACAATT2TCACACAGG23′)进行PCR扩增,取5μL电泳检测。挑取2个阳性克隆的菌落,增殖提取质粒后送大连宝生物工程公司进行测序。1.2.4　猪肺炎支原体P46的基因序列及推导氨基酸序列的分析　用DNASTAR6.0软件比较MY299株和国际标准株232株、J株和7446株的P46基因核苷酸及氨基酸一级序列的异同。2　结果2.1　猪肺炎支原体P46基因的PCR扩增　以猪肺炎支原体MY299株的基因组DNA为模板,用设图3　CTB56023和CTB56026与标准株计的引物扩增出了约为1.1kb的特异性条带(图1)。232株的P46蛋白氨基酸序列比较

中国畜牧兽医　2010年第37卷第4期生物技术・105・密码子;一个CGG是精氨酸的密码子,为稀有密码子。用DNASTAR6.0对2个克隆测序结果与国际标准株232株的P46基因序列进行分析发现,其核苷酸的同源性分别为99.8%和99.2%,编码的氨基酸序列同源性分别为99.7%和99.2%;与J株和7446株的核苷酸同源性分别为99.5%、99.0%和99.2%、98.8%。CTB56023与标准株232株的P46焰等,2004;Assunca等,2005),说明猪肺炎支原体易发生变异,而P46蛋白却具有很高的保守性(覃青松等,2005)。虽然CTB56023和CTB56026与国际标准株232株的P46基因存在着有2～5个碱基的差异,但其P46蛋白的氨基酸二级结构和亲水性并不受到影响,可作为诊断用膜蛋白抗原。参考文献1　孙霞,熊焰.猪喘气病病原的研究[J].中国兽医科技,2001,31(5):27～28.2　覃青松,宁宜宝,沈青春.猪肺炎支原体膜蛋白P46基因在大肠基因有2个碱基的差异,一个为同义突变,另一个引起99位的Ile突变成Val;而CTB56026有5个碱基的差异,其中有两个为同义突变,另外25位Thr、96位Asn和356位Val分别突变为Ala、Lys和Ala(图3)。3　讨论杆菌中的表达[J].中国预防兽医学报,2005,27(2):16～19.3　熊焰,孙霞,苟琳.猪肺炎支原体MY299株膜蛋白SDS2PAGE分本研究结果发现,P46基因对引物的敏感性并不高,基因组DNA的浓度如果低于0.5ng则不会出现特异性条带。Caron等(2000)报道,猪肺炎支原体P46基因扩增的敏感性低于P36基因。笔者认为,可利用P46基因的保守性进行猪肺炎支原体PCR的临床检测,同时对Mhp的其他保守基因序析及免疫原性研究[J].畜牧兽医学报,2004,35(1):74～78.4　AssuncaoP,DelanFeC,nandantigenicvariabilityamongMycoplasmahyopneumoniaestrainsbySDS2PAGEandimmunoblot[J].VeteriaryRearchCommunication,2005,29:563～574.5　BarbaraE,JefferyJ,SylvieD,esofSwine,9thEdi2tion[M].UnitedStates:Wiley2Blackwell,2006,785～787.6　CaronJ,sisandDifferentiationofMycoplas2mahyopneumoniaeandMycoplasmahyorhinisinfectionsinpigs列,如P36、P97等进行多重PCR扩增,以确保检测结果的准确性。测序结果表明,MY299株P46基因与国际标准株232株、J株及7446株的同源性分别达98%以上,说明猪肺炎支原体P46基因具有很强的保守性,且从分子水平上证明了孙霞等(2001)分离的MY299株是典型的猪肺炎支原体菌株。byPCRamplificationofthep36andp46Genes[J].JournalofClinicalMicrobiology,2000,38(4):1390～1396.7　EscobarJ,VanAlstineWG,BakerDH,per2formanceandwhole2bodycomositionofpigxperimentallyinfec2tedwithMycoplasmahyopneumoniae[J].JournalofAnimalSci2ence,2002,80(2):384～391.8　SatoshiF,YasuhiroS,MunenoniO,inant462Kilo2daltonsurfaceantigen(P46)ofMycoplasmahyopneumoniaeex2presdinEscherichiacolicanbeudforearlyspecificdiagnosisofMycoplasmalPneumoniaofswinebyenzyme2linkedimmu2nosorbentassay[J].JournalofClinicalMicrobilogy,1995,33(3):680～683.猪肺炎支原体膜表面的黏附蛋白变异很频繁(Escobar等,2002)。自然界的猪肺炎支原体,可以自发的使其表面的膜蛋白抗原发生大小和结构的变化,在蛋白抗原表面趋近性的形成抗原表位遮蔽物。许多关于猪肺炎支原体膜蛋白的报道均有不同(熊SequentialAnalysisofSurfaceProteinP46GeneofMycoplasmahyopneumoniaeWildStrainMY299XIONGDing2jie,XIONGYan,LINLu(CollegeofAnimalScienceandTechnology,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an625014,China)Abstract:　　Mycoplasmahyopneumoniae(Mhp)wildstrainMY299wasculturedinATCCliquidmedium,echnique,eP46ultsofquencingdemonstratedthattheclonedquenceis1134bp,uenceisincludingthreeTGAcodonscodingTrpin182,ingtheP462quenceofMycoplasmahyopneumoniae(Mhp)wildstrainMY299withthequenceofstandard232strainpublishedinGen2Bank,theidentityofthemwere99.6%and99.2%.Keywords:Mycoplasmahyopneumoniae(Mhp);P46gene;quentialanalysis