湿筛倾析法

2023年12月21日发(作者：一什么雪)

真菌分离方法

11112 培养基

PDA综合培养基:马铃薯200g,葡萄糖20g,琼

脂20g, KH2

PO4

3 g,MgSO4

1. 5g,蒸馏水1000ml, pH

自然。

促孢培养基:蔗糖1g,琼脂5g,酵母浸膏011g,

KH2

PO4

011g,蒸馏水1000ml, pH自然。

112 试验方法

11211 土壤含水量测定

用分析天平称取各土样10g,用干燥铁盒装好,放入干燥烘干箱烘干,调至105℃烘干8h,然后置于干燥器中,待冷却后取出用分析天平称量,计算土壤含水量。

土壤含水量= [ (10g - 烘干后质量) /10g ] ×100%。

11212 土样中真菌的分离

采用稀释平板法进行真菌分离[ 2 ]

,称取10g新鲜土样,加入盛有90ml无菌水的三角瓶中,放在摇床上(120～200 r /min)振荡10min～20min,使土样均匀分散在稀释液中成为土壤悬浮液。再用移液器移取10mL的土壤悬浮液,加入盛有90ml无菌水的三角瓶中充分震荡,至此土壤已被稀释至10- 2倍。移取1mL土壤悬液滴于9cm直径的灭菌培养皿中,然后倒入15ml即将凝固的PDA

培养基( 40℃左右) ,并与土壤悬液混合均匀,待凝固后置于25℃恒温箱中培养,每种土样处理5个重复。

11213 菌种纯化

在培养过程中,当组织材料周围生出明显菌丝时,采用尖端挑取法挑取形态不同的菌落, 转入

PDA斜面培养基上, 25℃恒温条件下纯化培养。

11214 真菌的鉴定

对于已产生孢子的菌落直接挑取进行鉴定,通过水载片,观察孢子梗、孢子的形态、大小,结合培养特性、子囊壳及菌丝的特征,参考相关资料进行鉴定[ 3～5 ]

。未长出孢子的真菌接入促孢培养基,待孢子形成后鉴定。

湿筛倾析法

① 将采集的土壤样品分别混匀，称取100g放入容器中，用清水浸泡20~30min。

② 过筛：用孔径800um~55um洁净的土壤筛分层重叠放置，小孔径在最底层，并使筛面适当倾斜。

③ 用玻璃棒搅拌土壤浸泡液，停放后待大的石砾或杂物沉积在容器底部，将上层的土壤悬浮液慢慢地倒入最上一层的土壤筛内，最好集中在一小范围内倾倒，以保证筛出的孢子尽量集中，减少损失。

④ 用清水继续冲洗各筛面的筛出物，直至没有土壤微粒为止。

⑤ 用清洁的洗瓶分别将各筛面上滞留的筛出物轻轻地洗入洁净的培养皿内。培养皿内的筛出物除了有相应孔径的沙粒和杂物外，就是不同直径的VA菌根菌的孢子。

⑥ 将含有筛出物的培养皿放在双目解剖镜下观察。用吸管分别将相同形态的孢子，逐个移入小玻璃瓶内，或放在滤纸上。

密度梯度离心法

在离心管中配制由蔗糖、甘油等不同密度媒质溶液组成的不同浓度的梯度柱，随着离心力的作用，使不同比重的VA菌根菌的孢子分别析离在不同的梯度浓度的界面上，从而达到分离出不同孢子的目的。

①~③步骤完全与湿筛倾析法相同；

④ 将用清水冲洗的筛出物，装入离心管内，加水至1/2处离心。⑤ 除去水面杂物及上清液，有时上清液中含有较轻的孢子，应先检查后再弃。保留下部沉淀物，加2mol的蔗糖溶液至离心管的1/2，再离心1~2min。

⑥ 离心后VA菌的孢子多浮于液体表面。因此，可分别将上清液倒入放有滤纸的最小孔径的筛网上，用清水仔细冲洗糖液，即可获得不同直径的孢子。