超声处理对脱脂牛乳蛋白质结构和界面性质的影响

2023年12月18日发(作者：书夹子)

超声处理对脱脂牛乳蛋白质结构和界面性质的影响

马蓉;杨富民;杨敏;杨继涛;张光地;刘东;刘倩霞

【摘 要】[目的]分析不同时间20 kHz超声处理对脱脂牛乳蛋白质结构和界面性质的影响.[方法]以脱脂牛乳为研究对象,分别讨论了不同超声时间对脱脂牛乳酪蛋白胶束平均粒径、脱脂乳浊度和荧光光谱的影响,分析了脱脂乳乳化活性和乳化稳定性、起泡性和泡沫稳定性的变化规律.[结果]随着超声时间的延长,脱脂乳中酪蛋白胶束的平均粒径减小,脱脂乳浊度显著降低,但乳体系pH基本不变;超声处理4 min时,脱脂牛乳内源荧光最大发射波长λmax达到最大值,最大荧光强度突然增大.ANS荧光λmax在超声处理2 min时迅速增大,之后基本保持不变;最大荧光强度在2

min时降至最低,之后增大.[结论]就界面性质而言,4 min超声处理的脱脂牛乳乳化活力指数和起泡性最大,分别比未处理的提高了35.14％和21.74％.试验结果可为超声技术在液态乳制品的生产加工过程中的应用提供理论基础和参考依据.

【期刊名称】《甘肃农业大学学报》

【年(卷),期】2018(053)005

【总页数】8页(P169-175,184)

【关键词】超声波处理;脱脂牛乳;粒径;荧光特性;界面性质

【作 者】马蓉;杨富民;杨敏;杨继涛;张光地;刘东;刘倩霞

【作者单位】甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃 兰州 730070;甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃 兰州 730070;甘肃农业大学理学院,甘肃 兰州 730070;甘肃农业大学理学院,甘肃 兰州 730070;甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃

兰州 730070;甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃 兰州 730070;甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃 兰州 730070

【正文语种】中 文

【中图分类】TS252.2

超声波具有波动与能量的双重属性，频率高于20 kHz，在液体介质中传播时，引起一系列的物理化学作用，形成最主要的三大效应—热效应、机械效应、空化效应[1].因此，超声波可以通过声空化等物理化学作用改变溶液性质.超声波作为一种新兴的技术，已应用于食品无损检测、乳液乳化、均质、超声辅助提取、酶的钝化、肉的嫩化等方面[2].

近年来，众多研究指出，低频率超声波(20～100 kHz)可通过空穴效应、微流束效应等物理作用改变乳蛋白质的结构、空间构象和聚集方式，从而影响其理化和功能性质[3].已有研究表明，相比高压均质和机械搅拌，低频超声处理(20 kHz)可在短时间内(2～3 min)显著增加酪蛋白粉末、脱脂乳粉及乳蛋白粉的溶解性，显著降低其粒径[4-6].酪蛋白粉末复溶后经超声处理其凝胶强度增大，脱水收缩作用降低[7].5 min低频超声处理(20 kHz)使酪蛋白粒径达到最小，且酸凝胶强度增大[8].在高于乳体系自然pH环境下，复原乳经低频超声(20 kHz)后，酪蛋白解离程度增大[5].另外，原乳经超声(20 kHz)后，其发酵性能和制作的酸奶性质与高压均质处理乳具有显著差异[9-10].综上所述，低频超声处理可显著降低酪蛋白粒径，改善其部分理化和功能性质.然而，目前的研究多集中于酪蛋白粉末复溶后的结构和原乳凝胶性能等方面，关于脱脂乳中天然酪蛋白胶束结构及脱脂乳乳化性、发泡性等界面性质随超声处理的变化规律鲜有报道.

本研究采用20 kHz超声波对脱脂牛乳进行不同时间超声处理，系统分析处理前后

的牛乳酪蛋白胶束平均粒径、脱脂牛乳浊度和乳蛋白荧光特性变化规律，并讨论了脱脂牛乳乳化活性、乳化稳定性、起泡性和泡沫稳定性随超声时间的变化规律，以期为超声波改性技术在鲜牛乳加工过程中的应用提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜牛乳(甘肃农业大学牛奶场，每日新鲜的生牛乳，奶牛的健康状态良好，无疾病)，叠氮化钠(阿拉丁化学试剂有限公司)，盐酸、氢氧化钠为分析纯(天津市化学试剂三厂)，十二烷基磺酸钠(SDS)(天津市博迪化工有限公司)，8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)(阿拉丁化学试剂有限公司)，去离子水，菜籽油购于超市.

1.2 仪器与设备

GT10-1型高速台式离心机(北京时代北利离心机有限公司)，JY92-ⅡDN型超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，PHS-3C实验室pH计(上海三信仪表厂)，精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)，分光光度计(722S)(上海精密科学仪器有限公司)，UV-2100双光束紫外-可见分光光度计(北京北分瑞利分析仪器有限责任公司)，荧光分光光度计(F-380)(天津港东科技发展股份有限公司)，Bettersize2000激光粒度仪(丹东百特仪器有限公司)，均质机，微量注射器.

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理 新鲜牛乳经纱布过滤除杂后，在25 ℃、转速4 000 r/min条件下离心20 min，除去上层脂肪，即得脱脂乳.为了防止微生物生长，加入0.02%(w/v)叠氮化钠并在4 ℃下保存.

1.3.2 超声处理样品 将上述脱脂乳置于工作频率为20 kHz的超声波细胞粉碎机中，调整超声波的输出功率为400 W，参考孙颜君等[11]的方法，依据预试验结果，设置超声波处理时间为2、4、6、8、10、15、20 min，超声时间3 s，间隔时间3 s，超声过程在循环水浴中进行，以确保样品温度维持在室温；以未经超声波处

理的脱脂乳为对照.

1.3.3 粒径测定 采用Bettersize2000激光粒度仪测定样品中酪蛋白胶束粒径，泵速1 800 r/min，颗粒折射率1.46，分散剂折射率1.33，吸收参数0.001.

1.3.4 浊度的测定 参照Claudia等[12]的方法，将处理后的样品摇匀后准确移取200 μL，用去离子水稀释至10.00 mL，室温下，用紫外-可见分光光度计在860

nm处测定样品溶液的吸光度，参比溶液为去离子水，平行测定3次，取平均值.

1.3.5 荧光特性测定

1.3.5.1 内源荧光 参照Yazdi等[13]的方法，25 ℃下采用荧光分光光度计测定其荧光发射光谱.用微量移液器移取超声处理后的样品100 μL，加入20.0 mL去离子水并混匀.荧光光谱激发波长为290 nm(狭缝2.5 nm)，发射光谱采集范围为290～450 nm(狭缝2.5 nm)，扫描速率1 200 nm/min.

1.3.5.2 外源荧光 参照Philippe等[14]的方法，25 ℃下采用荧光分光光度计测定其荧光发射光谱.分别用微量移液器移取超声处理后的样品300 μL，加入20.0 mL去离子水，再加入100 μL浓度为8.0×10-3 mol/L的ANS荧光试剂，振荡，静置3 min.激发波长为390 nm(狭缝2.5 nm)，发射光谱采集范围为400～650

nm(狭缝2.5 nm)，扫描速率1 200 nm/min.

1.3.6 乳化活性及乳化稳定性的测定 参照Jiang等[15]的方法，取3 mL菜籽油与9 mL待测样品溶液，在高速分散均质机上均质1 min，用微量注射器迅速从乳状液的底部取100 μL，稀释10 mL 0.1%的SDS溶液，500 nm波长下测定吸光度值，记为A0.将乳状液静置10 min再以同样的方法稀释并测定，得到吸光值A10，乳化活力指数(EAI)与乳状液稳定性(ES)分别按公式(1)、(2)计算.

乳化活力指数

(1)

式中，EAI表示每克蛋白质的乳化面积(m2/g)；C为溶液中样品蛋白的浓度(1

g/mL)；L为比色杯直径(1 cm)；Φ为油相所占的分数；N为稀释倍数.

乳化稳定性

(2)

式中，A0为零时刻的吸光值；A10为10 min时的吸光值.

1.3.7 起泡性和起泡稳定性的测定 参照Jiang等[15]的方法，取25 mL溶液置于50 mL的烧杯中，在20 000 r/min下高速搅打1 min；快速将泡沫完全转移至量筒中，测定最初的泡沫体积V0和量筒静置30 min时保留的泡沫体积V30.起泡性和起泡稳定性分别按公式(3)、(4)计算.

起泡性

(3)

起泡稳定性

(4)

1.4 数据分析

所有数据均重复试验3次，结果用表示.采用Orign 8.0软件作图，用SPSS 17.0软件对数据进行显著性分析.

2 结果与分析

2.1 超声处理对脱脂牛乳pH值的影响

由表1可以看出，超声时间对脱脂乳的pH值无显著影响(P>0.05)，可见超声处理并不影响乳中矿物质形态和其平衡，换言之，超声处理并没有促使胶束中矿物质大幅度解离，这与Jambrak等[16]的研究结果一致.

表1 超声时间对脱脂乳pH值的影响Table 1 Effect of ultrasound time on pH

of skim milk超声时间/minUltrasound

timepH06.67±0.0026.66±0.0146.66±0.0166.67±0.0186.67±0.00106.67±0.01156.67±0.02206.67±0.01

2.2 超声处理对脱脂牛乳中酪蛋白胶束粒径的影响

由图1可知，随着超声时间的延长，脱脂牛乳中酪蛋白胶束平均粒径减小.当超声时间为2 min时，酪蛋白胶束粒径变化不显著.2 min后，随超声时间的延长胶束粒径显著减小.20 min时，胶束平均粒径由最初的283 nm降至180

apala等[17]和Shanmmugam等[18]在研究中也观察到超声处理后的酪蛋白平均粒径降低.这是由于超声波的空穴效应产生机械剪切力使蛋白颗粒被粉碎，甚至表面分子发生解离，从而降低了胶束粒径.

小写字母不同表示差异显著(P<0.05).Different letters indicate the significant

differences(P<0.05).图1 超声时间对脱脂牛乳酪蛋白胶束平均粒径的影响Figure

1 Effect of ultrasonic time on average particle size of cain micelles in

skim milk

2.3 超声处理对脱脂牛乳浊度的影响

浊度不仅能定性说明酪蛋白胶束间相互作用的改变，而且还与微粒粒径有关[19].由图2可以看出，15 min之内，脱脂乳浊度随超声时间的延长而显著降低，之后变化不显著.脱脂乳浊度变化趋势与胶束粒径变化趋势基本一致，也有文献报道了相似结论[18].

图2 超声时间对脱脂牛乳蛋白浊度的影响Figure 2 Effect of ultrasonic time on

turbidity of skim milk

2.4 超声处理对脱脂牛乳荧光特性的影响

不同超声时间对脱脂牛乳内源荧光光谱的影响见图3.

A：超声时间对脱脂牛乳内源荧光特性的影响；B：超声时间对脱脂牛乳内源荧光最大荧光强度和最大发射波长的影响.A:Effects of ultrasonic time on

endogenous fluorescence characteristics of skim milk;B:Effects of ultrasonic

time on the maximum fluorescence intensity and maximum emission

wavelength of endogenous fluorescence of skim milk.图3 脱脂牛乳内源荧光特性Figure 3 Fluorescence emission spectra of Skim Milk

荧光光谱能有效反应蛋白质三级结构的构象变化.最大发射波长(λmax)是反映色氨酸残基所处微环境的重要指标，说明蛋白质构象的变化和结构的伸展[20].由图3可见，超声处理2 min和4 min后，脱脂牛乳最大发射波长λmax发生红移，说明在超声波作用下乳蛋白构象发生改变，色氨酸侧链转移到蛋白分子表面，造成蛋白微环境极性的增加，这与Mirianim等[21]的研究结果一致.虽然λmax随超声时间呈现出波动变化，但每个时间点下的λmax与未处理相比发生了红移，证明超声波使乳蛋白微观结构发生了改变.就最大荧光强度而言，虽然4 min和15 min出现拐点，但超声处理使其降低，说明蛋白质结构打开，使发色基团暴露到溶剂中，造成荧光强度的降低[22-23].因此，通过荧光光谱分析可以看出，超声波处理改变了脱脂牛乳蛋白的分子结构，胶束亲水性增强.

常用的评价蛋白质表面疏水性的方法有ANS荧光探针法，ANS与蛋白结合的荧光强度与蛋白的表面疏水性呈正相关性[24].维持蛋白质三级结构的主要作用力是疏水作用，它在维持蛋白结构稳定和功能性质方面起着重要作用[25].由图4可知，与未经超声处理的脱脂乳相比，当超声时间为2 min时，脱脂乳疏水性降低，意味着乳清蛋白和酪蛋白胶束相互作用改变，或者胶束内部结构变得致密，使ANS与乳蛋白的结合能力降低[26].2 min后，随着超声时间的延长，脱脂牛乳蛋白的表面疏水性逐渐增大，说明空化作用使蛋白质分子的结构变得疏松，更易于与ANS结合[27].ANS荧光光谱λmax在超声时间为2 min时迅速增大，之后随着超声时间的延长呈现小幅度波动.

A：超声时间对脱脂牛乳外源荧光特性的影响；B：超声时间对脱脂牛乳外源荧光最大荧光强度和最大发射波长的影响.A:Effects of ultrasonic time on

exogenous fluorescence characteristics of skim milk;B:Effects of ultrasonic

time on the maximum fluorescence intensity and maximum emission

wavelength of exogenous fluorescence of skim milk.图4 脱脂牛乳蛋白ANS荧光发射光谱Figure 4 Fluorescence emission spectra of ANS in skim milk

由此可见，内源荧光和ANS荧光光谱变化均表明超声处理使脱脂牛乳中蛋白质结构发生了改变.然而，由于脱脂乳中成分复杂，荧光特性不仅取决于酪蛋白胶束，还涉及乳清蛋白，以及乳清蛋白和酪蛋白胶束间的相互作用，因此荧光光谱并没有呈现出规律性变化.

2.5 超声处理对脱脂牛乳乳化性的影响

不同超声时间对脱脂牛乳乳化性的影响见图5.在油水混合液中，酪蛋白分子的亲水、亲油基团使蛋白分子具有扩散到油水界面的趋势，疏水部分朝向脂质，亲水部分朝向水相，油水界面张力降低并成膜，因而具有乳化性能[28].用乳化活力(EAI)和乳化稳定性(ES)表征蛋白的乳化性，是蛋白质功能性质最有力的指标之一[29].由图5可知，超声处理4 min内，脱脂乳乳化活性显著增加，在4 min时达到最大(1.353 m2/g)，之后缓慢降低.乳化稳定性随超声时间的增加而增大，在8 min时达到最大(109.15%)，8 min后迅速降低，之后基本保持不变.总体而言，超声处理10 min内，脱脂乳的乳化性得到显著提高.

超声处理过程中发生机械性震荡，分子的空间结构被破坏，蛋白质分子部分展开，油水界面聚集了很多分子降低了表面张力，从而提高了乳化性[30].由荧光光谱看出，4 min超声处理时脱脂乳的荧光特性发生了显著改变，而乳蛋白结构及疏水性的变化直接导致了乳化性的变化.之后由于超声时间进一步延长，机械振荡的高能量和溶液温度的上升，改变了原来分散的蛋白空间结构，蛋白变性程度增大，乳化活力指数和乳化稳定性都呈现下降的趋势[11].综上所述，超声处理4 min可显著改善脱脂牛乳的乳化性.

图5 超声时间对脱脂牛乳蛋白乳化性的影响Figure 5 Effects of ultrasonic time

on emulsification of skim milk

2.6 超声处理对脱脂牛乳起泡性的影响

蛋白质在超声波作用下，大量气泡进入溶液形成一定的气-液界面，溶液中的蛋白分子吸附在这些界面上使界面张力降低并成膜称为蛋白的起泡性.维持泡沫稳定存在的能力称为蛋白质的起泡稳定性.由图6所示，随着超声时间的增加，脱脂牛乳起泡性呈先增后减的趋势；与未经超声处理相比，在4 min时起泡性由最初的128.8%增加到156.8%.虽然脱脂乳的起泡性在超声4 min后随着超声时间的延长而降低，但其值依然高于未处理样品.在超声时间为2 min时，泡沫稳定性略微降低，之后呈增大趋势.有研究指出，蛋白经超声处理解聚成小分子亚基，增加了气水界面的蛋白分子数目，起泡能力提高[31].另外，在上述荧光光谱图中，4 min超声处理时脱脂牛乳内源荧光最大发射波长λmax达到最大值，改变了牛乳蛋白质的表面疏水性，促进水-气界面形成，同时使蛋白分子展开，展开的蛋白分子通过相互作用形成更为稳定的网络结构和界面膜.而且，超声处理后酪蛋白胶束粒径减小，从而增加了其起泡性能力和泡沫稳定性[32].由此可见，4 min超声处理可显著改善脱脂乳的起泡性，这与荧光光谱和乳化性研究结论一致.

图6 超声时间对脱脂牛乳蛋白起泡性的影响Figure 6 Effects of ultrasonic time

on foaming of skim milk

3 结论

与传统方法相比，超声波技术不损失营养物质，无毒、无害，操作简单，运行成本低廉，无食品安全问题，符合绿色食品工业的发展要求，探索并扩大其应用范围是目前的研究热点，是一种较为安全可靠的蛋白质改性方式.20 kHz超声波处理20

min内对脱脂牛乳pH值不会产生显著影响，但其浊度和粒径随超声时间的延长显著降低.荧光特性分析显示，超声处理4 min时，脱脂牛乳内源荧光最大发射波长

λmax达到最大值，最大荧光强度由最初的降低突然增大.ANS荧光λmax在超声处理2 min时迅速增大，之后基本保持不变；ANS最大荧光强度在2 min时降至最低，之后增大.由此可见，超声处理改变了脱脂乳中蛋白质的微结构和疏水性，4

min时改变程度最大.

乳蛋白的微观结构和疏水性变化必然引起其界面性质改变.当超声时间为4 min时，脱脂牛乳乳化活力指数和起泡性达到最大，分别比未处理的提高了35.14%和21.74%.总体而言，超声处理改善了脱脂乳的界面性质.

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