转化和转染

2023年12月14日发(作者：黄发垂髫什么意思)

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转化和转染

一、转化

转化（transformation）是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。该现象首先发现于细菌。

1生物转化简介

细胞

转化（transformation）是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。这现象首先发现于细菌，也是细菌间遗传物质转移的多种形式中最早发现的一种，它不同于通过噬菌体感染传递遗传物质的转导以及通过细菌细胞的接触而转移DNA的细菌接合。

病毒

转化的研究不但在理论上有重要意义，而且在基因工程中是将质粒或病毒载体引入宿主细胞的一种重要手段（见重组DNA技术）。它也可能为育种和遗传性疾病的基因治疗提供新的途径。

球菌

转化现象1928年英国学者F．格里菲思在肺炎双球菌中发现的。他把不产荚膜的无毒的粗糙型肺炎双球菌和加热杀死后的产荚膜的有毒的光滑型肺炎双球菌混合注射小鼠，发现小鼠意外地被感染致死，而且从小鼠的血液中分离出活的产荚膜的肺炎双球菌。不久又发现产荚膜细菌的无细胞抽提物同样能在试管中使不产荚膜的细菌变为产荚膜的细菌。1944年美国细菌学家O．T．埃弗里等从元素分析、酶学分析、血清学分析以及生物活性鉴定等方面证实了无细胞抽提物中引起肺炎双球菌荚膜转化的转化因子是脱氧核糖核酸（DNA），第一次为遗传物质是DNA而不是蛋白质提供了直接的证据。到目前为止，已经在流感嗜血杆菌（Hemophilus influenzae）、链球菌（Streptococcus）、沙门氏菌（Salmonella）、奈瑟氏菌（Ne－isria）、根瘤菌（Rhizobium）、枯草杆菌（Bacillus

subti-lis）、大肠杆菌（Escherichia coli）等几十种细菌中报道了转化现象，所转化的性状包括荚膜、抗药性、糖发酵特性、营养要求特性等等。它们的转化因子都是DNA。

2细菌的转化

染色体

转化过程包括有转化能力的染色体DNA片段的吸附、吸收和整合3个阶段。外源DNA首先吸附在细菌细胞表面的一些接受位点上。肺炎双球菌和枯草杆菌等细胞的接受位点没有专一性，它们能吸附同种的DNA，也能吸附大肠杆菌的DNA。流感嗜血杆菌的接受位点则只能吸附近缘细菌的DNA。DNA在和细菌刚接触时可以被洗去，在稳定吸附以后便不能洗去，但还能被核酸酶水解。DNA被细胞吸收以后便不能被外源的核酸酶水解。能吸附的DNA主要是双链状态的，在通过细胞膜进入细胞的吸收过程中DNA分子转变为单链，并以这种形式整合到细菌染色体上。整合过程又可以分5个步骤。

外源基因整合后，通过基因表达使受体细菌的表型发生相应的变化。图中所示的转化模式至少对于肺炎双球菌和枯草杆菌来讲是正确的。

质粒 质粒DNA的转化和染色体DNA的转化有显著的不同。在一般情况下前者的转化效率远远低于后者。但如果先用一定浓度的钙离子处理大肠杆菌细胞，再用质粒DNA和染色体DNA对它做转化实验则情况恰好相反。此外，质粒DNA很容易进入去掉了细胞壁的细菌的原生质体，说明对它的吸收并不通过专门的接受位点；质粒DNA的转化过程没有整合这一环节。

影响因素

许多因素可以影响转化效率。受体细菌和供体细菌的亲缘关系愈远则转化效率愈低，这主要是受吸附位点专一性和染色体的同源程度的影响。DNA分子的联会是供体DNA整合到受体DNA上的先决条件，联会一般只发生在同源染色体之间，而亲缘关系愈远则同源性愈低，所以转化效率也愈低。但细菌间染色体的某些部位如核糖体基因部位在进化过程中很少发生变化，而有些性状如红霉素抗性和链霉素抗性等都是由于与核糖体有关的基因发生突变而使核糖体蛋白结构改变的结果，所以如果所转化的是红霉素或链霉素抗性基因或者和它们紧密连锁的其他基因，则转化效率便较少受细菌的亲缘关系的影响。

转化效率

同一种细菌也可以由于基因型的改变而改变转化效率。细菌的限制性核酸内切酶能够分解外来的DNA，所以如果用限制酶失活的突变型菌株作为转化受体时可以提高转化效率。通过筛选也可以得到转化效率显著下降的突变型，包括吸附能力、吸收能力和整合能力下降的突变型。某些转化效率降低的突变型对于紫外线格外敏感，这一性质也是许多丧失了DNA损伤修复能力和丧失重组功能的突变型的特性，可见转化过程中的DNA的整合和DNA损伤修复以及基因重组都涉及某些相同的酶。

基因型完全相同的细菌可以由于生理状态的改变而改变转化效率。能够吸收外源DNA的生理状态称为感受态。许多细菌的感受态都在对数生长期的后期迅速出现，经过一段时间以后便消失。感受态的细菌和非感受态的细菌相比，转化效率可以高出万倍。

种族特异

从处于感受态的肺炎双球菌和链球菌中曾分离出感受态因子。感受态因子是蛋白质，它能使非感受态细菌转变为感受态，并有一定的种族特异性。

某些外界因素可以影响转化效率，例如一定浓度的钙离子能够提高大肠杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌等的转化效率。又例如流感嗜血杆菌吸收双链DNA分子的最适pH是6.8， pH下降到5.5以下便不能吸收。温度对于转化也有影响，在肺炎双球菌和嗜血流感杆菌中外源DNA的整合在一定范围内都随着温度的上升而提高。

细菌的转化多数是在人为条件下进行的。在自然条件下已经知道肺炎双球菌的转化可以在小鼠体内进行，奈瑟氏菌细胞自溶所释放的DNA可以转化周围的细胞。细菌转化的生物学意义还有待于进一步研究。在不能或不易通过细菌接合或转导作遗传学分析的细菌中，转化可以作为一种研究的手段。

蛋白质

转染是转化的一种特殊形式，是用除去蛋白质外壳的病毒（包括噬菌体）核酸感染细胞或原生质体的过程。与一般的转化过程的区别在于：①转染过程中进入细胞的是完整的病毒DNA，而通过转化进入受体细胞的则是染色体DNA的片断或质粒DNA；②转染过程中病毒DNA一般不整合到染色体上，但转化过程则往往涉及DNA的整合；③转染效果可用单位量的DNA引起的病斑或噬菌斑的多少来表示，转化效果则用一定量的DNA所带来的被转化的受体细胞菌落数目来表示。

3大肠杆菌转化

实验材料准备

1. 器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5 ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。

2. 试剂

培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal。

3. 材料处理

无菌ddH2O，1.5 ml 离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。

操作步骤

1. 事先将恒温水浴的温度调到42℃。

2. 从-70℃ 超低温冰柜中取出一管（100 μl）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10 min。

3. 加入5 μl 连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100 ng），轻轻震荡后放置冰上20 min。

4. 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2 min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5

min。

5. 在超净工作台中向上述各管中分别加入500 μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1 h。

6. 在超净工作台中取上述转化混合液100-300 μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

7. 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40 μl 2%

X-gal，8 μl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

8. 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30~60 min 直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。

9. 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。

10. 观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。[1]

4真核生物的转化

在酵母菌、脉孢菌和植物细胞中转化的主要障碍是细胞壁。把细胞壁用酶消化后便能有效地转化。高等动物细胞的转化大多是在离体培养细胞中发现的，例如小鼠细胞、鸡胚细胞和人的海拉细胞等，这些细胞常以胞饮方式摄取物质。使供体DNA形成磷酸钙沉淀能显著地提高转化效率。由于高等动植物细胞的转化频率远远低于细菌，因此一个转化实验能否成功在很大程度上取决于选择性培养基和选择性标记的恰当使用。例如在一个哺乳动物细胞的转化系统中，用取自疱疹病毒（HSV）的胸腺嘧啶核苷激酶（TK）基因DNA去转化相应的缺陷型细胞TK-，并用HAT培养基来筛选有TK+基因标记的转化细胞便能成功（见体细胞遗传学）。在同一转化系统中，如果把大量没有选择性标记的DNA混合少量有TK基因选择标记的DNA去转化TK-细胞，这样得到的TK+细胞中将有一小部分也为无选择性标记的DNA所转化，这种现象称为共转化。 在高等动物中虽然现在还不能进行活体的转化，但可以把转化细胞注射到活体中，使它们取代活体中未转化的细胞。例如可以用抗氨甲蝶吟的小鼠细胞株的DNA片段转化体外培养的小鼠骨髓细胞（这些细胞有特定的染色体标记，易于与受体小鼠的骨髓细胞相区别），然后把转化的骨髓细胞注入受体小鼠的骨髓。在一段时间后这些小鼠的骨髓中可以检出抗氨甲蝶呤的细胞。如果为接受注射的小鼠经常注射氨甲蝶呤，随着饲养时间的推移可以看到带有特定染色体标记的细胞的百分数逐渐增加，此种情况说明抗氨甲蝶呤的细胞经过细胞分裂增殖而部分地取代了未转化的细胞。这样的工作显然是向基因治疗这一目标跨出的第一步。在高等植物中某些体细胞能在一定的培养条件下生长成完整的植株，因此便有可能通过转化培养细胞培育成不同基因型的新种植株。

在真核生物的细胞生物学研究中，转化这一名词还有另一种意义，这就是由致癌的RNA或DNA病毒感染真核细胞引起的细胞癌变现象。进入细胞的病毒基因组DNA往往整合到被转化的细胞的染色体上。为了明确起见，这种转化有时又称为细胞转化。

二、转染

转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染（永久转染）两大类。

1简介

转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。

常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。

转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。

2分类

化学

包括：-葡聚糖法，2.磷酸钙法，3.人工脂质体法。DEAE-葡聚糖是最早应用哺乳动物细胞转染试剂之一，DEAE-葡聚糖是阳离子多聚物，它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取，用DEAE-葡聚糖转染

成功地应用于瞬时表达的研究，但用于稳定转染却不是十分可靠。磷酸钙法是磷酸钙共沉淀转染法，因为试剂易取得，价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定转染的研究，先将DNA和氯化钙混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，最后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上，通过细胞胞膜的内吞作用摄入DNA。磷酸钙似乎还通过抑制血清中和细胞内的核酸酶活性而保护外源DNA免受降解.人工脂质体法采用阳离子脂质体，具有较高的转染效率，不但可以转染其他化学方法不易转染的细胞系，而且还能转染从寡核苷酸到人工酵母染色体不同长度的DNA，以及RNA,和蛋白质.此外，脂质体体外转染同时适用于瞬时表达和稳定表达，与以往不同的是脂质体还可以介导DNA和RNA转入动物和人的体内用于基因治疗。人工合成的阳离子脂质体和带负电荷的核酸结合后形成复合物，当复合物接近细胞膜时被内吞成为内体进入细胞质，随后DNA复合物被释放进入细胞核内，至于DNA是如何穿过核膜的，其机理目前还不十分清楚.

物理

包括：①显微注射②电穿孔③基因枪等，显微注射虽然费力，但是非常有效的将核酸导入细胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物，但却不适用于需要大量转染细胞的研究。电穿孔法常用来转染如植物原生质体这样的常规方法不容易转染的细胞。电穿孔靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞内。导入的效率与脉冲的强度和持续时间有关系，基因枪依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导入细胞内，这种方法适用于培养的细胞核在体的细胞.

3实验

细胞转染实验

目的

学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法—脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白），为染色准备实验材料。

原理

外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。

利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。

本次实验采用的脂质体是promega公司的TransFast脂质体试剂，它是一种阳离子脂质体和中性脂质体的混合物，是对于本次实验中采用的293T细胞优化的转染试剂。"

材料器材

（1）材料

293T细胞、MyoD表达质粒和EGFP表达质粒、DMEM培养基、链霉素/青霉素（双抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸盐缓冲溶液）、胰酶/EDTA消化液、转染试剂（TransFast）

（2）器材

20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip头酒精灯、废液缸、血球计数板、涡旋振荡器、恒温水浴箱、台式离心机、35mm培养皿、转染管、15ml离心管、观察用倒置显微镜荧光显微镜和CCD

步骤

细胞传代

(1)试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。

(2)弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 (3)用Tip头加入1mlTrypsin液，消化1分钟（37C，5%CO2)。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。

(4)加入1ml的含血清培养基终止反应。

(5)用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。

(6)将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。

(7)用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。

(8)将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。

(9)将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。

细胞转染

1）转染试剂的准备

A.将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。

B.震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡，。

2）选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。

5）将混合液在室温放置10—15分钟。

6)吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。

7）加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。

8）到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。

第二次细胞传代

1） 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。

2） 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新放入培养皿中。

3） 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

。4筛选

转染细胞筛选

1．确定抗生素作用的最佳浓度：

不同的细胞株对各种抗生素有不同的敏感性，因此在筛选前要做预试验，确定抗生素对所选择细胞的最低作用浓度。

1) 提前24 小时在96 孔板或24 孔板中接种细胞8 孔，接种量以第二天长成25%单层为宜，置CO2 孵箱中37℃培养过夜。

2) 将培养液换成含抗生素的培养基，抗生素浓度按梯度递增（0, 50, 100, 200,400,

600, 800 和1000μg/ml）。

3) 培养10-14 天以绝大部分细胞死亡浓度为准,一般为400-800μg/ml,筛选稳定表达克隆时可比该浓度适当提高一个级别维持时使用筛选浓度的一半.

2．转染按前面的步骤进行。

3．转染72 小时后按1:10 的比例将转染细胞在6 孔板中传代，换为含预试验中确定的抗生素浓度的选择培养基。在6 孔板内可见单个细胞，继续培养可见单个细胞分裂繁殖形成单个抗性集落，此时可用两种方法挑选单克隆。

1) 滤纸片法：用消毒的5x5mm 滤纸片浸过胰酶,将滤纸片贴在单细胞集落上10-15

秒，取出粘附有细胞的滤纸片放于24 孔板中继续加压培养。细胞在24 孔板中长满后转入25cm 培养瓶中,长满后再转入75cm 培养瓶中培养。 2) 有限稀释法：将细胞消化下来后做连续的10 倍稀释（10-2—10-10），将每一稀释度的细胞滴加到96 孔板中培养，7-10 天后，选择单个克隆生长的孔再一次进行克隆。

4. ELISA 或Western blot 检测单克隆细胞中外源蛋白的表达情况由于不同克隆的表达水平存在差异因此可同时挑选多个克隆选择表达量最高的克隆传代并保种。[1]

5研究进展

转染技术

国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效

率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(protonsponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。目前在设计更复杂的基因载体时，PEI经常做为核心组成成分。

转染效率

线型PEI（LinePEI,LPEI）与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI（BranchedPEI,BPEI）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，因此与BPEI相比应该转染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性低，但转染效率却较高。

GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性，因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米颗粒，从而提高转染效率，当所形成复合物进入细胞以后，其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解，使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI，这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性，其可降解性对体内应用也具有重要的意义。

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