基因枪瞬时转化洋葱表皮

2023年12月14日发(作者：帮助的名言)

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基因枪瞬时转化洋葱表皮

1. 基因枪DNA微弹的制备

（1）称取直径为0.6 μm的钨粉于干净 1.5 mL的离心管中，用1

mL 70％乙醇振荡5 min进行清洗，室温静置10 min，短暂离心后弃上清液；

（2）重复操作步骤（1）；

（3）向离心管中加入1 mL去离子水，充分振荡，静置2 min，短暂离心后弃上清液，重复冲洗2次；

（4）加入500 μL灭菌的50％的甘油，充分振荡混匀，每管50 μL进行分装制备成60 mg/mL的微载体；

（5）将5 μL（约1ug/μL）pUC18-35S-PtERFs-GFP质粒和对照pUC18-35S-GFP分别加入到微载体管中，然后加入50 μL CaCl（2.5 M）和20 μL亚精胺（0.1 M）；

（6）振荡3 min，室温静置2 min，短暂离心后弃上清液；

（7）加入150 μL 70％乙醇，轻轻混匀，短暂离心后弃上清液，重复两次；

（8）加入150 μL 70％乙醇，轻轻重悬，即为基因枪所需DNA微弹。

2. 洋葱表皮受体的制备

将购买的洋葱放在水中过夜复苏培养，用镊子小心取洋葱的第4-7层鳞茎内表皮，并切割成2 cm × 3 cm的小块平铺于1/2 MS固体培养基平板中央，于室温暗培养24 h备用。

3. 基因枪瞬时转化洋葱细胞

（1）将载体膜安装在载体膜支架上，取5 μL DNA微弹均匀的涂抹在载体膜上，水平室温放置2-3 min待乙醇完全挥发；

（2）将可裂膜于75%乙醇中冲洗后安装在固定冒中，然后安装到基因枪主体装置上；

（3）在DNA微弹组件中安装上终止屏，并将其固定在基因枪主体装置上； （4）将含有洋葱表皮的培养基平板置于合适的射击距离处进行轰击；

（5）将轰击后的培养基平板密封，室温暗培养36 h，于激光共聚焦显微镜下观察分析。

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