基因枪的使用

2023年12月14日发(作者：节能降耗的措施有哪些)

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外源DNA的准备及微弹载体制备

1.称取60 mg（或3mg）的金粉（Bio-Rad）置1.5 mL eppdorf管中。

2.加入1 mL（或50ul）的无水乙醇，充分涡旋3-5min， 10000 rpm 离心10s，

使金粉沉淀，弃上清液。

3.加入1ml(或50ul) 无菌水洗，振荡1min,10000rpm离心10S；

4.弃上清，加入灭菌水1 mL(或50ul），储存于-20℃待用。

5.取50 μL制备好并已涡旋的金属颗粒混合液于1.5 mL离心管中。依次加入

5-8μL DNA(1 μg/μL)、50 μL CaCl2(2.5 mol/L)、20 μL 0.1 mol/L的亚精胺（现

配现用），每加完一样可震荡2-3s。

6.振荡3min，冰上静置10min(有的室温)，10000rpm离心10-20秒，弃上清。

7.加200ul 乙醇，振荡重悬，10000rpm，离心1min，弃上清。乙醇洗2-3次。

8.再将颗粒悬浮于30-15ul乙醇中，用枪吸打混匀。置于冰上。

9.取5-10ul悬浮均匀的钨粉置于micro carrier上（flying disks）。注意：确定颗粒悬浮充分，且弃去最后的有大团块。

洋葱表皮细胞的准备

平板（可以加一些抗生素如100mg/L Amp）

2.较新鲜、分层较好的洋葱

3.刀片、镊子、刀（70%酒精消毒或灭菌）

方法：将洋葱切成西瓜片状，选择内层较为平整的茎片，用镊子剥取内表皮细胞层，翻转，光面向下，平铺在MS平板上，预培养4h待用 (注意：一般选择洋葱中心以外3、6层，茎片不要太老，也不能太嫩，尽量不要带叶肉细胞，铺时尽量不要有气泡)，铺于平板中心直径约2cm即可( 培养皿托盘中心圆大小，中间尽量铺满，颗粒基本集中打在中间部位)。

基因枪法(particle bombardment)转化洋葱表皮

1.待micro carrier上的颗粒干后，可装载基因枪的载盘上，注意DNA面向下，以便发射于铺有洋葱表皮的MS平板上。(可裂膜1100-1300Pa）。 2.利用Biorad公司的PDS-1000基因枪将附有质粒DNA的钨粉轰击进入洋葱表皮。轰击操作：

①将钢瓶上阀门打开，调整压力表前黑色旋钮至适当压力（至少较所需压力高200psi）(一般打洋葱表皮选用1100psi，所以钢瓶压力选择1500psi左右）。

②放置仪器的超净台提前开紫外消毒。用75%的酒精擦拭chamber 四壁及其内物件。Micro carrier 、可裂膜、钢丝网提前泡在75%的酒精中消毒。用前，置于干净无菌的平皿中吹干。

③组装：将钢丝网和可裂膜依次装在chamber顶部的旋钮中，其下层的装置中放入涂有钨粉且已干燥的macro carrier, DNA 面向下。打开封盖的平皿放在下层的托盘上。关上壁门。（可调整sample 与micro carrier 之间的距离，洋葱表皮至可裂膜的距离6-9cm）。

④抽真空至所需真空度（一般为26-28），轰击。

⑤待chamber恢复压力，取出sample及所有零件。

⑥重复步骤3-5，直到所有试验材料轰击完毕。

使用完毕后，关上钢瓶阀门，抽真空，轰击至钢瓶上压力表降至零，回复chamber压力后即可关闭电源。将压力表前黑色旋钮逆时针方向旋松。

3.将plate封好(parafilm), 22℃暗培养24~48小时后,在荧光显微镜下观察,将洋葱表皮切成适当大小置于载玻片上先滴一滴水,然后将盖玻片盖好,注意不要有气泡.然后置于显微镜下观察拍照,确定外源融合蛋白在细胞内的位置拍照。

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