-肠激酶酶活及纯度检测-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

2023年12月12日发(作者：举世闻名是什么意思)

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GB/TXXXXX—XXXXAA附录A（规范性附录）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳A.1原量SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的分离原理，是依据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的净电荷，消除了蛋白分子的电荷效应，使蛋白按分子大小分离。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法主要用于蛋白质分子量的测定、蛋白质混合组分的分离和蛋白质亚基组分的分析等方面。A.2A.2.1A.2.2A.3仪器设备电泳装置，符合YY/T凝胶薄层扫描仪。试剂除非另有规定，本方法使所用的试剂均为分析纯，水为GB/TA.3.1A液6882规定的三级水。0087的要求。1.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加适量水溶解，用盐酸调pH值至8.8，加水稀释至100mL。A.3.2B液N，N´-亚甲基双丙烯酰胺溶液（避光保存）。30%丙烯酰胺溶液-0.8%A.3.3C液1%十二烷基硫酸钠溶液。A.3.4D液10%N，N，N´，N´-四甲基乙二胺。A.3.5E液10%过硫酸铵溶液，临用前配制。A.3.6F液0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。称取三羟甲基氨基甲烷6.05g，加适量水使溶解，用盐4GB/TXXXXX—XXXX酸调pH值至6.8，加水稀释至100mL。A.3.7电极缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷3g、甘氨酸14.4g、十二烷基硫酸钠lg，加适量水溶解，用盐酸调pH值至8.3，加水稀释至1000mL。A.3.8供试品缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷0.303g、溴酚蓝2mg、十二烷基硫酸钠0.8g，量取盐酸0.189mL、甘油4mL，加水溶解并稀释至10mL。该缓冲液用于非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。如用于还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，则再加β-巯基乙醇2mL。A.3.9固定液称取三氯醋酸5g，加水200mL溶解后，加甲200mL，再加水至500mL。A.3.10考马斯亮蓝染色液lg，加入甲醇200mL、冰醋酸50mL、水250mL，混匀。称取考马斯亮蓝R250A.3.11考马斯亮蓝脱色液取甲醇400mL、冰醋酸100mL与水500mL，混匀。A.3.12保存液取冰醋酸75mL，加水至1000mL，摇匀。A.3.13供试品溶液的制备将供试品与供试品缓冲液按3：1的比例混匀，或照各品种项下的规定制备，除另有规定外，置水浴中100℃加热3〜5分钟；对照品/标准品溶液同法操作。A.4A.4.1分析步骤制备分离胶溶液根据不同分子量的需要，按表D.1制成分离胶溶液，灌入模具内至一定髙加水封顶，室温下聚合（室温不同，聚合时间不同）。表A.1凝胶种类凝胶浓度A液B液5%42.77.5%44分离胶和浓缩胶配制比例分离胶浓度10%45.412.5%46.715%4817.5%49.41.35浓缩胶浓度4.5%5GB/TXXXXX—XXXX试液/mLC液D液E液F液H2O7.364.883.32.280.881.60.10.11.60.10.11.60.10.11.60.10.11.60.10.11.60.10.10.90.070.072.254.33A.4.2制备浓缩胶溶液待分离胶溶液聚合后，用滤纸吸去上面的水层，再灌入浓缩胶溶液（配方见表1），插入样品梳，注意避免气泡出现。A.4.3加样待浓缩胶溶液聚合后小心拔出样品梳，将电极缓冲液注满电泳槽前后槽，在加样孔中加入供试品溶液与对照品/标准品溶液不超过20µg。A.4.4电泳垂直板电泳：恒压电泳，初始电压为80V，进入分离胶时调至150V〜200V，当溴酚蓝迁移胶底处，停止电泳。或恒流电泳，以恒流10mA条件下开始电泳，至供试品溶液进入分离胶后将电流调至20mA，直至电泳结束。A.4.5固定与染色考马斯亮蓝法电泳完毕，取出胶片（条），置固定液中30min，取出胶片（条），置染色液中1〜2h，用脱色液脱色至凝胶背景透明后保存在保存液中。_________________________________6

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