红莲子草耐寒无性系选育研究

2023年12月12日发(作者：文学性)

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中国园艺文摘２０１　１年第９期　红莲子草耐寒无性系选育研究　明　月　李琦王哲徐娜姜长阳　（辽宁师范大学生命科学学院，辽宁大连１　１　６０２９）　摘要：为满足人们观赏栽培的需求，以能越冬的红莲子草嫩茎为材料，进行愈伤组织诱导、低温处理、冷冻处　理、复冻处理，愈伤组织分化、试管苗生根与继代增殖培养，以及试管苗移栽和定植的研究，建立起红莲子草耐　寒无性系。结果证明：ＭＳ＋ＢＡ　０．４　ｍｇ／Ｌ＋２，４－Ｄ　１．０　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．５　ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０　ｇ／Ｌ为嫩茎愈伤组织诱导和耐　冻愈伤组织继代增殖培养的理想培养基；１／２　ＭＳ＋蔗糖５０　ｇ／Ｌ是复冻后增殖培养的愈伤组织分化的理想培养基；　Ｎ。＋ＮＡＡ　Ｏ．１　ｍｇ／Ｌ＋ＩＡＡ　０．４　ｍｇ／Ｌ＋蔗糖Ｉ　５　ｇ／Ｌ是生根培养和生根继代增殖培养的理想培养基；移植到水库岸边的　试管苗保持了红莲子草的所有生物学性状，且连续５年正常越冬。　关键词：红莲子草；组织培养；耐寒选育；无性系　红莲子草（Ａｌｔｅｍａｎｔｈｅｒａ　ｐａｒｏｎｙｃｈｉｏｉｄｅｓ）又叫紫叶草、　１．２培养条件　满天星、莲子草等，属于苋科莲子草属多年生草本植物【１］。　参见黄葳等小花鬼子针的研究　。　主要生长于高温高湿地区河岸、水边或沼泽等环境中。原　１．３试验方法　产于巴西，在华东以南地区的浅水处也有成片生长，现在　１．３．１愈伤组织的诱导与分化把无菌嫩茎切成长约０．３　ｃｍ　我国多有盆栽［２１。红莲子草可作饲料，且具有一定的药用价　的茎段后，搠榧ＩＩＭＳ＋ＢＡ　０．４　ｍｇ／Ｌ＋２，４－Ｄ　１．０　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　值。但由于红莲子草茎叶为红紫色，所以，无论是南方的　０．５　ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０　ｇ／Ｌ培养基上，进行愈伤组织的诱导培　地栽，还是我国各地的盆栽，几乎都是以观赏目的进行栽　养。愈伤组织的诱导培养进行３次重复试验，每种处理接种　培的。由于大连地区冬季较为寒冷，因此多年来只能对其　培养２００个材料。　进行盆栽。为了美化环境，有人于春末将其成片的栽培到　１．３．２愈伤组织的低温处理当上述继代培养的愈伤组织　水库边缘的浅水处，几乎都是春天成片栽培红莲子草，到　生长非常旺盛时，转移到光照２　０００　ｌｘ、温度为２＂Ｃ的培养　冬天就冻死。但在２００３年栽培的红莲子草中，发现了１株红　箱中进行愈伤组织的低温处理１０　ｄ，而后再放到正常的条　莲子草能够越冬，未被冻死。观察证明，这种莲子草虽然　件下恢复培养１０　ｄ。低温处理试验重复３次，处理的愈伤组　可在寒冷地区越冬，但却不能结出种子。用扦插的方法对　织分别为５８块、６４块和６２块。　其进行繁殖，约１５％的扦插苗仍能越冬。为满足人们对耐　１．３．３愈伤组织的冷冻处理把经过低温处理恢复培养后　寒红莲子草栽培的需求，我们对红莲子草愈伤组织进行了　成活的愈伤组织，接种到相同的培养基上进行增殖培养２代　进一步的耐寒选择。虽然目前已有栽培植物耐寒选择的报　后，再放到温度为一８℃的培养箱中进行冷冻处理１０　ｄ，而　道【３一，并有愈伤组织选择效应的报道　，但迄今未见苋科　后放到温度为２℃的培养箱中进行愈伤组织的低温处理　植物通过愈伤组织进行耐寒选择的报道。　１０　ｄ，接着再放到正常的条件下恢复培养１０　ｄ。冷冻处理　ｌ材料与方法　试验重复２次，处理的愈伤组织分别为１２６块和１１４块。　１．１材料及灭菌　１．３．４冷冻后成活愈伤组织的继代增殖培养把成活的细　６月上旬，将大连大西山水库边上人工扦插已经越冬的　胞团剥离出来，接种到ＭＳ＋ＢＡ　０．４　ｍｇ／Ｌ＋２，４－Ｄ　１．０　ｎａｇ／　红莲子草嫩茎采回实验室后，用清水冲洗１　ｈ左右，切成长　Ｌ＋ＮＡＡ　０．５　ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０　ｇ／Ｌ的培养基上，置于常温环　约４　ｃｍ的茎段后，放到２５０　ｍｌ的磨口广口瓶中，先用　境中进行愈伤组织的增殖培养。冷冻后的愈伤组织连续进　０．０５％的安利液洗涤３次（每次约１０　ｍｉｎ），再用蒸馏水振荡　行６代增殖培养。　洗涤２次，然后将材料移到超净工作台上。在无菌条件下用　１．３．５愈伤组织的复冻处理及继代增殖培养把上述经过　７５％的乙醇灭菌１５　ｓ左右后，用０．０５％的ＨｇＣｌｚ溶液振荡灭　冷冻处理进行第６代增殖培养的愈伤组织培养￣１１４２　ｄ、当增　菌１３～１４　ｒａｉｎ，最后用无菌水振荡洗涤５次，将嫩茎表面残　殖培养的愈伤组织外观上生长很旺盛时，再将其放到温度　留的灭菌剂洗去后，即获得无菌材料［６１。　为一ｌ０℃的培养箱中复冻处理１２　ｄ，接着再在正常的条件下恢　复培养１０　ｄ后，统计成活率。接着将成活的愈伤组织接种到　ＭＳ＋ＢＡ　０．４　ｍｇ／Ｌ＋２．４－Ｄ　１．０　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．５　ｒａｇ／　第一作者简介：明月（１９８８＿），女，本科；就读于辽宁师范大　Ｌ＋蔗糖３０　ｇ／Ｌ的培养基上，进行５代增殖培养。　１．３．６复冻后愈伤组织的分化培养把经过复冻后增殖培　学生命科学学院。　养的愈伤组织分散为由６－ｌＯ￣－颗粒组成、直径为０．２－０．３　ｃｍ　通讯作者：姜长阳，教授。Ｅ－ｍａｉ１：ｃｈａｎｇｙａｎｇｊｉａｎｇ＠１２６．ｃｏｍ　的块状后，分别接种到附加蔗糖３０　ｇ／Ｌ的ＭＳ、１／２　ＭＳ、１／４　项目来源：辽宁省高等教育教学改革资助项目（２００９０３０４）；辽宁　ＭＳ、Ｂ５、Ｗｈｉｔｅ、Ｎ６，ＮＭＳ＋ＩＢＡ　０．３　ｍｇ／Ｌ、１／２　ＭＳ＋ＩＢＡ　师范大学教学改革资助项目（ＬＳＪＧ：２００９０１０８）。　０。３　ｍｇ／Ｌ、１／４　ＭＳ＋ＩＢＡ　０．３　ｍｇ／Ｌ、Ｂ５＋ＩＢＡ　０．３　ｍｇ／Ｌ、　一１　９—　ＣＨ　Ｉ　ＮＥＳＥ　ＨＯＲＴ　ｌ　ＣＵＬＴＵＲＥ　ＡＢＳＴＲＡＣＴＳ　Ｗｈｉｔｅ＋ＩＢＡ　０．３　ｍｇ／Ｌ、Ｎ６＋ＩＢＡ　０．３　ｍｇ／Ｌ　１２种培养基　上，进行愈伤组织的分化培养。愈伤组织的分化培养试验进　养和继代培养的结果说明：ＭＳ＋ＢＡ　０．４　ｍｇ／［　十２，４一Ｄ　１．０　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．５　ｒａｇ／Ｌ＋蔗糖３０　ｇ／Ｌ这一培养基为红　行２次重复，每种培养基接种培养１　００块愈伤组织。　莲子草嫩茎愈伤组织诱导和继代培养的理想培养基。　１．３．７不定芽的生根培养及试管苗的生根继代培养把在　２．２低温处理对愈伤组织的影响　低温处理恢复培养１０　ｄ后统计证明：３次重复试验的平　均成活率为２７％。观察表明，经过低温处理的愈伤组织，　在恢复培养中，大部分变成褐色，并逐渐死亡，即使成活　１／２　ＭＳ＋蔗糖３０　ｇ／Ｌ这种培养基上分化培养的高２　ａｍ左右　的不定芽从基部剪下后，分别接种到附２１ＩＡＡ　０．４　ｍｇ／Ｌ＋　蔗糖１５　ｇ／Ｌ的１／２　ＭＳ＋ＮＡＡ　０．１　ｍｇ／Ｌ、１／４　ＭＳ＋ＮＡＡ　０．１　ｍｇ／Ｌ、Ｗｈｉｔｅ＋ＮＡＡ　０．１　ｍｇ／Ｌ、Ｎ６＋ＮＡＡ　０．１　ｍｇ／Ｌ　的愈伤组织块在恢复培养中也会有约半数的细胞死亡。　４ｆＰ培养基上，进行不定芽的生根培养。每种培养基接种培　养１２０个不定芽。　２．３冷冻处理对愈伤组织的影响　冷冻处理恢复培养１０　ｄ后观察统计证明：２次重复试验　经过冷冻处理的２４０块愈伤组织。在其中３块愈伤组织中，　把生长旺盛的试管苗剪成至少具有２个叶片、长１．５　ｃｍ　的茎段后，接种到相同的培养基上，进行生根继代培养。　连续进行６代生根继代培养。　１．３．８试管苗的移栽和定植４Ｂ中旬，把上述生根继代　各自发现１个未被冻死的愈伤组织细胞团。细胞团的直径分　别为０．１　ｃｍ、０．１１　ｃｍ和０．０８　ｃｍ。成活的细胞团经过恢复　培养仍呈浅绿色、颗粒状。　培养的试管苗在温室中炼苗３　ｄ后，移栽到上层为干净河　沙、下层为肥沃园土的营养钵中。移栽后１０　ｄ内保持无直　射光、温度２０～３０℃、湿度９０％左右的环境条件，而后进行　正常管理。移栽试验进行２次，移栽株数为４００株、６００株。　２．４冷冻后成活愈伤组织的继代增殖培养　统计证明：冷冻后第１代增殖培养仅有１个细胞团成活　生长，成活率为３３％。成活后的愈伤组织生长较缓慢，经　过４５　ｄ的培养，所培养的绿色颗粒状、半球形的愈伤组织　块平均直径为０．５　ｃｍ左右。第２～６代生长速度加快，不仅　愈伤组织的生长率近１００％，而且经过４２　ｄ的培养，就会培　养出一代表面由绿色颗粒状组成、平均直径为１．４　ｃＩｎ的半　５月下旬，把在温室中移栽成活并开始正常生长的试管苗　定植到水库边上。定植试验进行２０：，分别定植３０　口５００昧。　２结果与分析　２．１　嫩茎愈伤组织的诱导效果与不同培养基对愈伤　组织颗粒分化培养的效应　接种培养到第８天时，在有的培养嫩茎切口处形成可见　愈伤组织。随后不仅形成愈伤组织的茎段数不断增加，而且　已形成的愈伤组织也不断生长。培养ｆｌＪ４５　ｄ时统计证明：在　ＭＳ＋ＢＡ　０．４　ｍｇ／Ｌ＋２。４－Ｄ　１．０　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．５　ｍｇ／Ｌ＋　球状愈伤组织块，并且增殖培养的愈伤组织块外观上生长　旺盛，平均每ｌ代的增殖率５倍左右。　２．５愈伤组织的复冻处理及继代增殖培养　统计证明：经过复冻处理，并进行恢复培养１０　ｄ的愈　伤组织成活率为７１％。第１代增殖培养增殖２．１倍，第２～６代　的平均增殖５．１倍。增殖培养的愈伤组织呈淡绿色、表面为　颗粒状半球形，外观上生长旺盛。这样的愈伤组织为具有　分化能力的愈伤组织。　蔗糖３０　ｇ／Ｌ培养基上，培养茎段愈伤组织的诱导率为９９％，　并且都生长为表面由绿色颗粒状组成、大小为１．１～１．８ｃｍ的　愈伤组织块。把上述诱导培养的愈伤组织切割为直径约为　０．４　ｃｍ的愈伤组织块后，接种到相同的培养基上，进行愈伤　组织的继代培养。３０￣重复诱导培养试验，每次继代培养４代。　继代培养的统计结果证明：经过４２　ｄ的培养，就会培养出１代　与诱导培养４５　ｄ基本一致的愈伤组织。上述愈伤组织的诱导培　附表２．６不同培养基对复冻后愈伤组织分化培养的影响　培养１０　ｄＥ右在有的培养基上可见在愈伤组织上部分化出　绿色的芽点，接着，伴随分化芽点数量的增加，先分化的芽点　逐渐生长成为不定芽。培养ＮＳ０　ｄ统计，２次重复试验的平均　结果见附表。由附表可见：在ＭＳ＋蔗糖３０　ｇ／Ｌ、１／２　ＭＳ＋蔗　不同培养基愈伤组织对分化培养的影响　一２０—　中国园艺文摘２０１　１年第９期　糖３０　ｇ／Ｌ、１／４　ＭＳ＋蔗糖３０　ｇ／Ｌ、Ｗｈｉｔｅ＋蔗糖３０　ｇ／Ｌ　４种　培养基上复冻后的愈伤组织能分化。其中在１／２　ＭＳ＋蔗糖　３０　ｇ／Ｌ这种培养基上，分化率为９３．５％，并且分化的不定芽　数多，株高２．１　ｃｍ，平均具有４．３个叶片，外观上长势好。２次　重复试验的结果基本一致。这说明：１／２　ＭＳ＋蔗糖３０　ｇ／Ｌ这　该研究的分化培养中，在没有任何植物生长调节剂的　培养基上的愈伤组织分化的效果最理想。王琳等　在银粉背　蕨的研究中也观察到同样的现象。产生这种现象并不意味　这种愈伤组织的分化不需要植物生长调节剂，而是由于在　复冻后继代增殖培养愈伤组织的培养基中加入了较高浓度　种培养基是复冻后增殖培养的愈伤组织分化的理想培养基。　的植物生长调节剂，分化培养时，愈伤组织中仍然残留着　一２．７不定芽的生根培养及试管苗的生根继代培养　观察表明，在４种培养基上，培养的不定芽均可生根。培　养至【Ｊ２８　ｄＨ捌寸证明：￣ＡＮ６＋ＮＡＡ　０．１　ｍｇ／Ｌ＋ＩＡＡ　０．４　ｎａｇ／　定浓度的生长调节剂；同时，在培养过程中，增殖培养　生长旺盛的愈伤组织自身也能合成一些植物生长调节剂。　这２种来源的生长调节剂的浓度已经达到了能使愈伤组织分　化的水平。所以，在分化培养的培养基中就不需要再加入　植物生长调节剂。　在该研究进行冷冻筛选的２４０块愈伤组织中，出现３个　未被冻死的细胞团。虽然这３个细胞团的直径仅为０．１　ｃｍ　左右，但都是由数千个细胞组成的。实际上，这３个细胞团　是由３个耐冻细胞分裂形成的，其细胞团是在愈伤组织增殖　生长培养过程中分裂形成的。这３个耐冻细胞是在进行冷冻　处理前就已经发生了耐冻变异，在进行一８℃冷冻处理时，　Ｌ＋蔗糖１５　ｇ／Ｌ这种培养基上生根效果最好，不仅生根率为　９４．　、平均每株生根数为６．３条、试管苗平均高度为３．９　ｃｍ，　而且培养５　ｄ就会生长出可见根，外观上试管苗生长旺盛。　６代的生根继代培养结果证明：每次生根继代培养的周　期为２５　ｄ，生根率为９８．６％，所培养的试管苗长势与不定　芽生根培养基本一致。每个周期的繁殖系数为２．８。按照这　个速度，采用生根继代的方法进行繁殖，每年的繁殖速度　为２．８１４－６（几千万）株试管苗，这种繁殖速度完全可满足人们　栽培和研究的需求。　其他不耐冻细胞被冻死，而这３个耐冻细胞被筛选出来。这　３个耐冻细胞的耐冻适应性属于先期适应［翻。　参考文献：　［１］包满珠．花卉学［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２００３．　［２］吴玲．湿地植物与景观［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２０１０．　［３］王琦，王豁然．桉树耐寒选育及测定［Ｊ］．桉树科技，１９９７，（１）：　１－４．　２．８试管苗的移栽和定植　移栽后观察表明，移栽后８　ｄ可见成活并生长。移栽后　３０　ｄ统计证明：２次移栽的成活率分别为９２．３％￣Ｎ９４．７％。　定植３０　ｄ统计结果证明：２次定植的平均成活率为　９９．３％。观察表明，定植成活的试管苗前４０　ｄ生长缓慢，　后期生长速度加快，并保持了红莲子草的所有生物学性状。　对定植大连大西山水库边上越冬的试管苗连续进行３年　的观察，第１年越冬率为９５．６％，第２年越冬率为９４．９％；第３　［４］李红艳，李建国，张耀芳等．辐射诱变愈伤组织选育耐寒型蕨菜　［Ｊ］．辽宁大学学报．２０１０，３７（３）：２７４—２７７．　［５］王洪庆，王关林，姜长阳等．辐射聚合草花药愈伤组织的效应　［Ｊ］．中国草地，１９８８，９（６）：３５—３７．　年越冬率９６．１％。３年的越冬结果说明，通过红莲子草耐寒植　株愈伤组织冷冻处理所获得的试管苗，是获得了耐寒性状的　红莲子草无性系，这种耐寒试管苗在大连地区能正常越冬。　３讨论　该研究是通过对愈伤组织冷冻处理而获得了抗冻无性　系。这种对愈伤组织进行筛选的方法具有筛选的数量巨大、　容易操作等其他筛选无法替代的特点，这为抗性植物的选　育探索出一条新途径。　［６］黄葳，施玉婷，杨微等．小花鬼子针组织培养及无性系建立的研　究［Ｊ］．中国园艺文摘，２０１０，（５）：９－１２．　［７］王琳，王晓麟，蔺博超等．银粉背蕨的组织培养及无性系建立的　研究［Ｊ］．黑龙江农业科学，２００８，（３）：４－６．　［８］李难．进化论教程［Ｍ］．北京：高等教育出版社，２００４．　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｃｏｌｄ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　Ｃｌｏｎａｌ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａ　ｌｔｅｒｎａｎｔｈｅｒａ　ｐａｒｏｎｙｃｈｉｏｉｄｅｓ　ＭＩＮＧ　Ｙｕｅ　ＬＩ　Ｑｉ　ＷＡＮＧ　Ｚｈｅ　ＸＵ　Ｎａ　ＪＩＡＮＧ　Ｃｈａｎｇ－ｙａｎｇ　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｍｅｅｔ　ｔｈｅ　ｐｅｏｐｌｅ’Ｓ　ｎｅｅｄ　ｏｆ　ａｐｐｒｅｃｉａｔｅｌｙ　ｗａｔｃｈ　ａｎｄ　ｒｅａｌｉｚｅ　ａｒｔｉｉｆｃｉａｌ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，ｔｅｎｄｅｒ　ｓｔｅｍｓ　ｏｆ　Ａ　ｌｔｅｒｎａｎｔｈｅｒａ　ｐａｒｏｎｙｃｈｉｏｉｄｅｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ｔｏ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｃａｌｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ｌｏｗ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｆｒｅｅｚｉｎｇ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｒｅｆｒｅｅｚｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，　ｃａｌｌｕｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｒｏｏｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｆｉｅｌｄ　ｐｌａｎｔｉｎｇ　ｏｆ　ｔｅｓｔ－ｔｕｂｅ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ，ｆｉｎａｌｌｙ　ｔｈｅ　ｃｌｏｎｅ　ｏｆ　ｃｏｌｄ　ｒｅｓｉｓ—　ｔａｎｃｅ　ｏｆ　Ａ　Ｉｔｅｒｎａｎｔｈｅｒａ　ｐａｒｏｎｙｃｈｉｏｌｄｅｓ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＭＳ＋ＢＡ　０．４　ｍｇ／Ｌ＋２，４－Ｄ　１．０　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．５　ｍｓ／Ｌ＋　ｓｕｃｒｏｓｅ３０　ｓ／Ｌ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｃａｌｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｒｅｅｚｉｎｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｃａｌｌｕｓ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ；１１２　ＭＳ＋ｓｕｃｒｏｓｅ　３０　ｓ／Ｌ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｒｅｆｒｅｅｚｉｎｇ　ｃａｌｌｕｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｒｏｏｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ　ｗａｓ　Ｎ６＋ＮＡＡ　Ｏ．１　ｍｇ／Ｌ＋ＩＡＡ　０．４　ｍｇ／Ｌ＋ｓｕｃｒｏｓｅｌ５　ｇ／Ｌ．Ｔｈｅ　ｔｅｓｔ—ｔｕｂｅ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｗｈｉｃｈ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｔｏ　ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ　ｓｈｏｒｅ　ｃｏｕｌｄ　ｋｅｅｐ　ａｌｌ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｔｒａｉｔｓ　ａｎｄ　ｗｉｎｔｅｒ　ｎｏ卜　ｍａｌｌｙ　ｆｏｒ　ｔｈｒｅｅ　ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ　ｙｅａｒｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｌｔｅｒｍｍｔｈｅｒａ　ｐａｒｏｎｙｃｈｉｏｉｄｅｓ；ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ；ｃｏｌｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ；ｃｌｏｎｅ　一２１—　

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