细胞色素C2

2023年12月8日发(作者：月度总结)

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细胞色素C

摘要

1925年Keilin发现昆虫的飞翔肌中含有一种色素物质参与氧化还原反应，因这种色素物质有颜色，故命名为细胞色素。细胞色素C是一类以卟啉为辅基的电子传递蛋白 ，在呼吸链中，依靠铁的化合价的变化来传递电子。细胞色素位于线粒体内膜上，其中常见的细胞色素有五种：Cytb、Cytc、Cytc1、Cyta、Cyta3。线粒体中的细胞色素大部分和内膜紧密结合，只有Cytc结合较松，易于分离纯化，结构 较清楚。细胞色素C是一种水溶性蛋白，由核基因编码，

分子量为12～13kDa，位于线粒体内膜的外侧，呼吸链复合体Ⅲ～Ⅳ之间，对线粒体能量代谢起重要的调节作用。通常外源性细胞色素C不能进入健康细胞，但在缺氧时，细胞膜的通透性增加，细胞色素C便有可能进入细胞及线粒体内，增强细胞氧化，能提高氧的利用，具有调控细胞能量代谢。细胞色素C在细胞凋亡中的作用，只是近几年来才引起广泛关注。从线粒体中泄露出的细胞色素C有诱导细胞凋亡的作用。因此，细胞色素C与众多的疾病都有关，了解和研究细胞色素C就有助于我们临床医药上的应用有重要的意义，也与我们的息息相关，细胞色素C也是近几年来众多学者关注的问题之一。

细胞色素C的结构

细胞色素C，就像在蛋白 质数据编号3cyt中展示的那样，是一个电子载体。就像很多携带电子的蛋白那样包含着可以携带电子的辅基。细胞色素C含有一个铁原子的血红素基团，由红色展示 。由铁离子和释放电子。周边蛋白质为电子提供了良好的环境，使其紧密的结合在细胞色素C上。细胞色素C是一个非常古老的蛋白，在生命起源的早期便已产生。因为这种至关重要的蛋白在细胞 能量的产生中起着关至关重要的作用且千百万年来它几乎没有京华，所以细胞 色素C在酵母的细胞 和我们的细胞中并没有很大变化。它们中有很多含有细胞色素C，用血红素和铁离子来转运电子，但是周边蛋白的变化使得它们的作用貌似神离。而其他的载体用另外一些辅基来转运电子，比方说铁硫簇（就像铁硫蛋白那样），铜离子群（就像细菌氧化还原蛋白和质体蓝素那样）和其余的一些金属离子。而含细胞色素C的每一分子，都联接着细胞中的电流，它携带电子东奔西走。

细胞色素C(Cytochrome C，Cyt C)是一种含有血红素的电子转运蛋白，广泛存在于动物的需氧组织中，集中分布于动物心肌细胞线粒体内膜的外表面，是细胞呼吸链中一个非常重要的电子传递体[1]。高等动物的细胞色素C由104个氨基酸残基的一条肽链组成，分子量约为13000，含有19个赖氨酸残基，等电点在pH10.2~10.8，含铁量为0.456%，是一种碱性蛋白(结构如图1)。通常外源性细胞色素C不能进入健康细胞，但在缺氧时，细胞膜通透性增加，细胞色素C有可能进入细胞及线粒体内，增强细胞氧化，提高氧的利用。目前细胞色素C主要用于组织缺氧的急救和辅助用药，如一氧化碳中毒、催眠药中毒、新生儿窒息、严重休克缺氧、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难、高山缺氧、脑缺氧、心脏疾病引起的缺氧等[2]。

辅酶Q10(Coenzyme Q10)又称泛醌，是脂溶性醌类化合物,存在于哺乳动物线粒体内膜中，是生物氧化呼吸链中的一个不可缺少的分子，它兼有氢递体和电子传递体[3]的双重作用分子式为C59H90O4,分子质量为863.36(结构如图2)，溶于乙醇，不溶于水和甲醇。辅酶Q10作为生化药物用于心血管系统疾病和肿瘤治疗[4]。具有提高人体免疫力、增强抗氧化能力、延缓衰老等功能。（细胞色素C与辅酶Q10联产工艺研究）

迄今发现细胞凋亡主要经过两条死亡通路川，一条是外源性通路，即由死亡受体及配体系统激发的凋亡信号下传至启动性caspa3e一8，然后激活效应性casPa蛋白酶而引发细胞凋亡;另一通路称为内源性通路，细胞损伤后线粒体功能障碍，膜通透性改变，凋亡蛋白包括细胞色素C(cytoomeC，cytoc)，Apaf一l及smac/DIABLO等从线粒体释放到胞浆，casPa一9与之形成凋亡体(aPposome)并被激活，随之引起caspa瀑布式活化和细胞死亡。（细胞色素C尿细凋亡作用）

摘 要:细胞凋亡是动植物最基本的生命活动,是一个有一系列酶参与的,并且由基因控制的主动的、高度有序的死

亡过程。线粒体除了为细胞提供能量外,在细胞凋亡中也起着中心调控作用。研究发现,线粒体释放的细胞色素C

是细胞凋亡过程的关键因素,已是近些年研究的热点。本文就细胞色素C从线粒体释放的机制及在凋亡中的作用进

行综述。

关键词:细胞凋亡;细胞色素C;线粒体

1 细胞凋亡与线粒体

细胞凋亡(Apoptosis),又称细胞程序性死亡(Pro-grammed CellDeath,PCD),是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自己结束其生命的过程。PCD是动植物最基本的生命活动[1]。Kerr等[2]最早提出细胞凋亡(Apoptosis)一词是取义于希腊词(apo=from, ptosis=falling),用来描述植物叶片的脱落。在植物的发育途径中,PCD具有多种重要的功能:如木质部的发生,多年木材的形成,叶的脱落,自交不亲和性,对多种病原菌侵蚀及逆境的防御反应等[3]。长期以来,线粒体一直被公认为是细胞内的能量加工厂,其主要作用是为细胞的各种生命活动提供所需的能量。近些年的研究表明,线粒体在细胞凋亡中也起着中心调控作用,在某种意义上,线粒体可以决定细胞的生存或死亡[4-5]。研究发现,线粒体细胞色素C(Cyt-C)、Smac/DIABLO蛋白以及凋亡诱导因子(AIF)等可以通过激活caspas通路导致细胞凋亡,或直接作用于细胞核引起细胞凋亡。Cyt-C是哺乳动物细胞凋亡信号传导过程的关键因素,关于Cyt-C释放的研究是目前的研究热点。

2 细胞色素c的结构与功能

Cyt- C是线粒体呼吸链(mitocho ndrial respiratochain,MRC)中传递电子的载体。无活性前体分子在胞浆内合成的前Cyt-C (一种核基因编码的水溶性蛋白,相对分子质量为12~13 kDa )。电子在转运的过程中,伴随着质子从基质被泵到线粒体膜间隙,从而建立线粒体跨膜电位(Δψm)。当质子从线粒体膜间隙返流回基质中,使另一个蛋白复合分子FO Fl-ATP酶产生ATP。所有这些过程必须有序地进行。如果Cyt-C缺失或其功能障碍将会导致线粒体呼吸链出现功能异常,结果ATP缺乏,使细胞死亡。在多种细胞死亡模型中Cyt-C从线粒体释放至胞质是引发凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的Cyt-C在dATP存在下,与凋亡相关因子1 (Apaf - 1)、procaspa- 9结合成凋亡小体( apoptosome ),激活caspa - 9,活化的caspa - 9再激活其他caspas如caspa - 3,从而诱导细胞凋亡。Cyt-C能激活caspas,活性的caspas亦能促进Cyt-C从线粒体释放,提示线粒体存在caspas底物,该底物的降解又加快了Cyt-C的释放。Liu等[6]在试图纯化一种体外激活caspa所需的成分时提取出包含Cyt-C的组分。在无细胞(cell-free)模型系统中,Cyt-C可激活caspa-3,从而触发了细胞凋亡。此外,在无细胞模型系统和完整细胞中, Bcl-2或Bcl-xL的表达均可阻断Cyt-C从线粒体内释放,从而抑制caspa-3活化和细胞凋亡。铝诱导的老年兔海马中的Cyt-C从线粒体释放入胞质是凋亡的关键性步骤[7]。近来有研究表明,在植物细胞PCD初期也检测到线粒体中细胞色素c蛋白向细胞质中的释放[8],外源Cyt-C蛋白处理可诱导胡萝卜和烟草原生质体发生PCD。3 Cyt-C在线粒体中的释放和作用机制大量研究表明,在凋亡初期Cyt-C可以从线粒体内膜释放,从而启动线粒体的凋亡机制[13]。Cyt-C从线粒体释放的机理尚未完全阐明,但一般认为有以下2种途径。一是通过线粒体渗透转运孔(mitochondrial permeabili-ty transitio n pore, MPTP),这往往伴随着线粒体膜的去极化。MPTP是由内膜上的蛋白ANT ( adenine nucleotidetransporte r)、线粒体基质中的亲环素D ( cyclophilinD )及外膜的孔蛋白-电位依赖型阴离子通道( voltage depend-entanion

channe ,l VDAC )构成[ 9 ]。正常的细胞中,这3种蛋白质与抗凋亡家族成员Bcl-2与Bcl-xl协同作用,维持线粒体正常的生理功能[10]。在病理条件下,如氧自由基、pH值的改变都能引起开放的孔径明显增大,引起外膜破坏并最终导致Cyt-C从线粒体释放[11]。

二是其他的电压依从性离子通道( vol tage-depend-entanion channel,VDAC)的关闭也可引起线粒体的超极化。在一些凋亡刺激因素的作用下,VDAC的关闭使得ATP/ADP交换障碍,导致FoF1-ATP酶活性抑制,ATP生成减少和质子跨膜转运功能降低,并最终阻碍了H+重新进入线粒体基质,基质内负电荷大大增加,于是线粒体内膜发生超极化,Δψm的增加,引起线粒体渗透性扩张,最后使得Cyt-C释放。Azoulay zohar等[12]指出HK-I直

接与VDAC结合,诱导了这种转运质子、核苷酸和其他物质通道的关闭,因而阻止了Cyt-C的释放和细胞的凋亡。还有证据表明,VDAC的过度关闭会导致线粒体流动和细胞凋亡[13]。Kmi等证实了Hxk1(编码一种线粒体的己糖激酶)通过保持线粒体膜的完整性而阻止了Cyt-C的释放,抑制了细胞凋亡[14]。

细胞凋亡的调控是一种复杂的多水平的调控,多因素相互作用促进或抑制凋亡的发生。Cyt-C透过线粒体膜的机制尚未得到普遍承认,到底是MPTP引起Cyt-C的释放,还是Cyt-C的释放导致线粒体渗透转运,还有待进一步的证实。Cyt-C的释放与细胞凋亡因子分子水平的相互作用机制还不清楚。随着对线粒体Cyt-C的结构、功能及其基因学研究和PCD分子生物学研究的不断深入,这些问题会逐步变得更清楚。

（细胞凋亡与细胞色素C）

研究表明细胞色素C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤[1]。线粒体是所有真核细胞内腺苷三磷酸(ATP)的产生中心，对维持细胞能量代谢和正常功能活动起重要作用。研究发现，线粒体内包含一些与细胞凋亡有密切关系的物质，如细胞色素C(CytC)、凋亡诱导因子(apoptosis inducingfactor，A IF)、Ca2+和活性氧自由基(reactive oxygn spe-cies，ROS)等。在凋亡信号的刺激下，线粒体膜通透性增加，由此引发线粒体产生一系列关键性变化，包括线粒体透性转换孔(mitochondrial permeability tran-sition pore，MPTP)的开放、CytC的释放、线粒体跨膜电位(mitochondrial transmembrane potential，用△ψm表示)的下降、A IF等凋亡因子的释放、Bcl基因家族成员的介入等。不同信号的传导最终集中到线粒体上激活或抑制这些事件的发生，再经相应的信号传导通路调控细胞凋亡[2]。

3线粒体中凋亡因子的调控

3.1细胞色素C

细胞色素C是线粒体呼吸链的重要组成部分，它是由两个无活性的前体分子合成的：前细胞色素C（该蛋白质由细胞核基因编码，然后被转运至线粒体）和亚铁血红素（由线粒体合成）[14]。由于细胞色素C具有亚铁血红素基团，它可以在呼吸链复合酶Ⅲ(细胞色素还原酶)和IV(细胞色素氧化酶)之间传递电子。细胞色素C缺乏时，电子传递链被阻断，将导致两方面的后果：ATP合成减少及不完全氧化造成的超氧阴离子(ROS)过度生成，而ROS是诱导凋亡的重要因素。

研究表明细胞色素C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤。释放到细胞质中的细胞色素C在dATP存在的条件下能与凋亡蛋白酶活化因子1(apoptosis protea activating factor 1，Apaf-1)结合，使其形成多聚体，并促使半胱天冬蛋白酶与其结合形成凋亡小体(apoptosome)，现已能确定半胱天冬蛋白酶即Caspa在凋亡过程中是起着必不可少的作用。细胞凋亡的过程实际上是Caspa不可逆有限水解底物的级联放大反应过程，目前，至少有10多种Caspa被发现，Caspa分子间的同源性很高，结构相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶，根据功能可把Caspa基本分为2类：一类参与细胞的加工；另一类参与细胞凋亡。Caspa家族一般以酶原的形式存在，并具有半胱氨酸激活位点和底物裂解位点。细胞色素C在dATP存在的条件下与凋亡蛋白酶活化因子1(apop tosis p rotea activatingfactor 1，Apaf-1)结合形成的多聚体主要与caspa-9结合形成凋亡小体。其结果是caspa-9被激活，激活的caspa9能够激活其他的caspa，如caspa-3等，从而诱导凋亡[15]。

（线粒体调控细胞凋亡的研究进展）

1、COX的分子生物学研究

COX即呼吸链复合体酶Ⅳ,是线粒体氧化呼吸的限速酶,相对分子量为166 kD。COX直接参与线粒体氧的利用和能量产生,主要功能是将电子从细胞色素C传递给O2分子,每传递一对电子,要从线粒体基质中摄取4个质子,其中两个质子用于水的形成,另两个质子被跨膜转运到膜间隙。COX的损伤将直接影响线粒体功能,导致能量产生受阻、呼吸链大量产生自由基。由于COX在能量产生和调节中的重要地位,自它发现以来一直是生物研究领域中重要的研究课题,也是相关疾病研究的理想靶标。COX是细胞核DNA与线粒体DNA分别编码的亚基共同组成的复杂复合物。真核细胞中COX是存在于线粒体内膜上的一种跨膜整合蛋白。哺乳动物COX每个单体由13个亚基组成,其中最大3个亚基(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)由线粒体DNA编码,构成级联反应的核心,序列高度保守〔1~3〕。COXⅠ亚基基因约1 544 bp,与血红素a、血红素a3、铜离子(CuB)结合。COXⅡ亚基基因约683 bp,含双合铜离子(CuA)构成的双核中心,携带有细胞色素C的结合位点,位于线粒体胞质面与细胞色素C进行反应。COXⅢ亚基基因约783 bp,可能参与氧化还原连接的质子易位过程。其余10个亚基(Ⅳ、Va、Vb、Ⅵa、Ⅵb、Ⅵc、Ⅶa、Ⅶb、Ⅶc和Ⅷ)由核DNA编码,基因分别定位于9条不同的染色体上,在胞浆中翻译后转运至线粒体参与装配,具有明显的器官和种族特异性。COXⅣ亚基在COX酶复合体组装过程中起着重要作用。核DNA编码亚基功能尚未完全明确,可能主要起调节和稳定作用。COX亚基的表达还需要某些辅助因子如活化因子等参与,表达调控可以在转录前、转录、翻译等多种水平进行。多种因素会影响COX亚基的表达和组装,例如分子伴侣、激素水平以及O2、NO、铁、心磷脂、腺苷酸浓度等〔3~6〕。COX作用的详细机制尚未完全明了。Sampson等〔7〕利用计算机模拟酶和底物的相互作用,并确定参与反应的基团,结果显示盐键和氢键对酶-底物复合物的形成和稳定有

（细胞色素C氧化酶与神经疾病研究现状）

细胞色素是定位于线粒体内膜外侧的一个血红素蛋白它存在于所有含线粒体呼吸链的生物体内,即从细菌、海藻、酵母、昆虫、无脊椎动物、脊椎动物到哺乳动物等原核生物和真核生物中都有[1]。Cytc是呼吸链中一个重要的电子载体,通过血红素辅基(heme)中心铁离子价态的变化在细胞色素c还原酶(cytochromecreducta)和细胞色素c氧化酶(cytochromecoxida)之间传递电子[2]除了行使电子传递功能外,近十几年来的研究还发现Cytc在细胞凋亡(apoptosis)[3, 4]和抗氧化[5]方面也起着重要作用。从结构上看,Cytc分子形状近似于球形,直经约为3·4 nm,是一个高度离子化的分子。Cytc蛋白分子的氨基酸序列和三维空间结构都已经得到阐明,是了解得最透彻的一个细胞色素蛋

白[6]。以马心细胞色素c(hor heart cytochromec)为例,它的全蛋白是由一条含有104个氨基酸残基的肽链和一个与之共价相连的血红素辅基(heme)组成,其晶体结构如图1所示(蛋白质数据库PDB编码为1HRC[7])。辅基heme位于Cytc的中心,外围一条肽链, heme被肽链紧紧地包裹着,仅有一裂缝使血红素的部分边缘与溶液相接触,该裂缝的面积仅占整个分子面积的0·06%,此区域被认为是分子反应活性区域。Cytc分子的二级结构主要有5个α-螺旋(N-端和C-端的两个螺旋和中间的3个螺旋),分别对应于Val3-Lys13 (H1)、Asp50-Asn54 (H2)、Glu61-Glu69 (H3)、Pro71-Tyr74 (H4)和Lys88

Thr102 (H5)。在Cytc中, heme与肽链的结合除了氢键、疏水相互作用以及heme与其轴向配体组氨酸(His18)和甲硫氨酸(Met80)的配位作用外, heme的2-、4-位上的两个乙烯基还通过与蛋白肽链上第14和1位的两个半光氨酸(Cys14 and Cys17)形成两个硫醚键而和肽链共价相连(Cytc蛋白肽链氨基酸序列的编码以马心细胞色素c为参考),如图2所示。正因为如此, Cytc是一个很稳定的蛋白分子,在中度变性条件下His18仍然与heme配位[8]。

由于Cytc蛋白可溶于水,易于纯化,性质稳定,且三维结构已知,因此对Cytc蛋白进行氨基酸残基突变的研究很多。具有代表性的突变位点包括辅基heme的轴向配体His18及Met80、heme疏水腔内的Tyr67、表面氨基酸残基Phe82以及与heme共价相连的Cys14及Cys17等。研究方法包括用基因定点突变(site-directedmutagenesis)方法进行的天然氨基酸突变以及用半合成(misynthesis)方法进行的非天然氨基酸置换等。

（细胞色素c突变研究进展）

细胞色素c(Cytc)是一种含有血红素的金属蛋白,广泛存在于含线粒体呼吸链的生物体内[1]。Cytc是呼吸链中一个重要的电子载体,它的主要功能是通过血红素辅基(heme)中心铁离子价态的变化在细胞色素c还原酶(cytochrome c reducta)和细胞色素c氧化酶(cytochrome c

oxida)之间传递电子[2-4]。此外,近十几年来的研究还发现Cytc在诱导细胞凋亡(apoptosis)[5-8]和抗氧化[9]中也起着重要的作用。在Cytc中,血红素辅基heme与轴向配体甲硫氨酸和组氨酸形成配位键外,还通过2-,4-位的乙烯基和蛋白肽链上的两个半光氨酸形成两个硫醚键和肽链共价相连,因而Cytc的性质很稳定。作为血红素类蛋白的典型代表,Cytc还具有分子量小(约1. 3 kDa)、水溶性好、结构稳定、蛋白易于纯化及三维结构已知等优点。因此,Cytc一直是血红素类蛋白结构-性质-功能关系研究及结构-功能转换研究的良好分子模型。

马心细胞色素c(Hor heartCytc)是Cytc家族中的一员,是最早确定出氨基酸序列的Cytc蛋白[10, 11],它的全蛋白是由一条含有104个氨基酸残基的肽链和一个与之共价相连的血红素辅基组成。Cytc分子的二级结构主要有5个α螺旋(以H1-H5表示),包括N-端和C-端的两个螺旋和中间的3个螺旋,其三维结构如图1所示(蛋白质数据库PDB编码为1HRC[12])。

来源于不同物种的Cyt c有着相似的空间结构和生物功能,它们之间性质的差别(包括氧化还原电位及化学稳定性等)主要取决于一些特定部位的、尤其是一些高度保守的氨基酸之间的不同。这些特定部位的氨基酸残基是如何影响和调控蛋白的结构、性质和功能,长期以来一直是化学生物学和蛋白质化学的重点研究领域[13-17]。

（细胞色素c蛋白序列分析与结构比较）

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