细胞色素C的制备和测定实验原理及步骤

2023年12月8日发(作者：社区志愿服务活动内容)

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实验2 细胞色素C的制备和测定

目的要求

（1）通过细胞色素C的制备，了解制备蛋白质制品的一般原理和步骤。

（2）掌握制备细胞色素C的操作技术及含量测定方法。

原理

细胞色素是包括多种能够传递电子的含铁蛋白质总称。它广泛存在于各种动物、植物组织和微生物中。细胞色素是呼吸链中极重要的电子传递体，细胞色素C（Cytochrome C）只是细胞色素的一种。它主要存在于线粒体中，需氧最多的组织如心肌及酵母细胞中，细胞色素C含量丰富。

细胞色素C为含铁卟啉的结合蛋白质，分子量约为1300，蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成。它溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可自酸性水中提取，制品可分为氧化型和还原型两种，前者水溶液呈深红色，后者水溶液呈桃红色。细胞色素C对热、酸、碱都比较稳定，但高浓度三氯乙酸和乙酸可使之变性，引起某些失活。

本实验以新鲜猪心为材料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱和三氯乙酸沉淀等步骤制备细胞色素C，并测定其含量。

试剂和器材

一、材料

猪心。

二、试剂

2mol/L H2SO4溶液，1mol/L NH4OH（氨水）溶液，0.2%NaCl溶液，25%（NH4）2SO4溶液（100ml溶液中含25g（NH4）约为25℃时40%的饱和度），BaCl2试剂（称BaCl212g2SO4，溶于100ml蒸馏水中），20%三氯乙酸（TCA）溶液，人造沸石（Na2O·Al2O3·xSiO2·yH2O）；白色颗粒，不溶于水，溶于酸。选用60—80目，联二亚硫酸钠（dithionite，Na2S2O4·2H2O）。

三、器材

绞肉机，电磁搅拌器，电动搅拌器，离心机。72型分光光度计，玻璃柱（2.5×30cm），500ml下口瓶，烧杯（2，000ml，1，000ml，500ml，400ml，200ml各一个），量筒，移液管，玻璃漏半，玻璃搅棒，透析纸，纱布。

操作方法

一、材料处理

新鲜或冰冻猪心，除尽脂肪、血管和韧带，洗尽积血，切成小块，放入绞肉机中绞碎。

二、提取

称取心肌碎肉50g，放入100ml烧杯中，加蒸馏水100ml。用电动搅拌器搅拌，加入2mol/L H2SO4，调pH至4.0（此时溶液呈暗紫色），在室温下搅拌提取1h。用1mol/LNH4OH调pH至6.0，停止搅拌。用数层纱布压挤过滤，收集滤液，滤渣加入75ml蒸馏水，按上述条件重复提取1h，两次提取液合并（为减少学时，可只提取一次，也可改过滤为离心，离心条件为3500rpm，10min。）。

三、中和

用1mol/L NH4OH将上述提取液调pH至7.2，静置适当时间后离心（3500rpm，10min），所得红色滤液通过人造沸石柱吸附。

四、吸附

人造沸石容易吸附细胞色素C，吸附后能被25%硫酸铵溶液洗脱下来，利用此特性将细

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