细胞色素C的制备及测定

2023年12月8日发(作者：一个红苹果)

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细胞色素C的制备及测定

实验三吸附法制备细胞色素c粗品

一、 实验目的

1．学习细胞色素c的理化性质及其生物学功能。

2.掌握细胞色素c的制备原理。

3．掌握制备细胞色素c的操作技术。二、实验原理

细胞色素c（CYT）是呼吸链的重要组成部分。它是一种含有铁卟啉基团的蛋白质。它位于线粒体呼吸链上的细胞色素b和细胞色素aa3之间。细胞色素c在生物氧化过程中被用来转移电子。

细胞色素c分子中含赖氨酸较高，所以等电点偏碱，为ph10.8，分子量为12000～13000道尔顿。它易溶于水及酸性溶液，且较稳定，不易变性，组织破碎后，用酸性水溶液即能从细胞中浸提出来。细胞色素c分为氧化型和还原型两种，因为还原型较稳定并易于保存，一般都将细胞色素c制成还原型的，氧化型细胞色素c在408nm、530nm有最大吸收峰，还原型细胞色素c的最大吸收峰为415nm、520nm和550nm，这一特性可用于细胞色素c的含量测定。

由于细胞色素c在心肌组织和酵母中含量丰富，因此常被用作分离和制备材料。以猪心为原料，采用酸溶液萃取、人工沸石吸附、硫酸铵溶液洗脱和三氯乙酸沉淀法制备细胞色素C，并测定其含量。

三、实验材料

1.实验设备

绞肉机；电磁搅拌器；电动搅拌器；离心机；72l型分光光度计；烧杯(2000、1000、

500m1）；量筒；移液管；玻璃漏斗和纱布；玻璃棒；透析袋

2.实验试剂

（1） 1mh2s04溶液；1mnh40h溶液；固体硫酸铵

⑵25％硫酸铵溶液:100m1蒸馏水中含25克硫酸铵，约相当于25℃时40％的饱和度

⑶ 0.2%氯化钠溶液：称取0.2g氯化钠，用蒸馏水溶解，定容至100ml

⑷10%乙酸钡试剂：称10克乙酸钡,溶于100ml蒸馏水中。

（5） 20%三氯乙酸溶液 (6)人造沸石(60～80目)

一

⑺联二亚硫酸钠(na2s2o42h2o)

3.实验操作

（1）细胞色素c的制备

① 材料处理：取新鲜或冷冻猪心，去除脂肪和韧带，用水冲洗去血迹，将猪心切成小块，放入绞肉机中研磨。② 提取：

称取绞碎猪心肌肉500克，放人2000m1烧杯中，加蒸馏水1000ml，在电动搅拌器搅拌下以1mh2s04调ph至4.0(此时溶液呈暗紫色)，在室温下搅拌提取2小时，在提取过程，使抽提液的ph值保持在4.0左右。在即将提取完毕，停止搅拌之前，以1mnh4oh调ph至6.0，停止搅拌。用八层普通纱布压挤过滤，收集滤液。滤渣加入750m1蒸馏水，再按上述条件提取1小时，两次提取液合并。③中和:

用1mnh4oh 2将上述提取液调节至pH 7（此时，一些等电点接近7.2的杂蛋白溶解度较小，并从溶液中沉淀）。静置30~40分钟后，过滤，所得滤液可被人工沸石吸附。④

吸附和洗脱：

每组取大约60ml过滤液，用于人造沸石容易吸附细胞色素c，吸附后能被25％的硫酸铵洗脱下来，利用此特性将细胞色素c与其它杂蛋白分开。具体操作如下：

ⅰ. 人工沸石预处理：称取5g人工沸石，放入500m1烧杯中，加水搅拌，用浇注法除去12秒内不下沉的细颗粒。

ⅱ吸附：将样品加入至盛人造沸石有小烧杯中，人造沸石吸附物质后逐渐由白色变为红色，吸附后的溶液呈黄色或微红色；

三、洗涤：吸附后，倒出溶液，取出红色人造沸石，放入500m1烧杯中。首先使用自来水，然后轻轻搅拌并用蒸馏水清洗，直到水变清，然后使用50m10沸石，用2%NaCl溶液清洗三次，然后用蒸馏水清洗，直到水变清；

ⅳ洗脱：用25％硫酸铵溶液洗脱，轻轻搅拌，收集含有细胞色素c的红色洗脱液，经过几次洗脱后（每次洗脱以盖过沸石），洗脱液红色开始消失时，即洗脱完毕。人造沸石可再生使用。⑤盐析：

为了进一步纯化细胞色素c，向上述收集的洗脱液中添加固体硫酸铵（每100m1洗脱液添加20g固体硫酸铵，使硫酸铵溶液的饱和度达到45%），添加时搅拌，放置30分钟

2 两小时后，各种蛋白质从溶液中沉淀，而细胞色素C留在溶液中。用滤纸（或离心）去除杂蛋白，得到红色透明的细胞色素C溶液。⑥ 三氯乙酸沉淀：

向所得透亮溶液加入20％三氯醋酸(2.5m1三氯醋酸／100m1细胞色素c溶液)，搅拌，细胞色素c立即沉淀出来（沉淀出来的细胞色素c属可逆变性)，立即于3000转／分钟离心15分钟(或8000rpm,5min)，收集沉淀。加入少许蒸馏水，用玻棒搅拌，使沉淀溶解。⑦透析：

将沉淀的细胞色素C溶解于少量蒸馏水中，放入透析袋中，在500m1烧杯中透析脱盐（用电磁搅拌器搅拌），15分钟换一次水，然后换3至4次水；检查透析液SO4是否已去除。检查方法：取2M1醋酸钡溶液于试管内，加入2-3滴透析液于试管内。如果有白色沉淀，则表示S04未被去除。相反，这意味着透析已经完成。过滤透析液以获得细胞色素C产物。（2） 含量测定

所得制品是还原型细胞色素c水溶液，在波长520nm处有最大吸收值，根据这一特性，用721型分光光度计，先作出一条标准细胞色素c浓度和对应的光密度值的标准曲线(图1)，然后根据测得的待测样品溶液的光密度值就可以由标准曲线的斜率求出待测样品的含量。具体操作如下：①标准曲线的绘制：

取1ml标准品（81mg/ml），稀释至25ml，分别取0.2、0.4、0.6、0.8和1.0ml，放入五个试管中，每管加入蒸馏水至4ml，加入少量亚硫酸氢钠作为还原剂，在520nm处测量每管的光密度，以浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。② 样品测定

取1ml样品，稀释适当倍数，再加少许联二亚硫酸钠(约3－5mg,检测前加入)，在波长

在520nm处测量光密度。最后，根据标准曲线的斜率计算细胞色素C的含量。

注意事项

1.尽可能去除猪心脏的韧带、脂肪和血液堆积。

2．使用离心机之前，一定要配平。

3.透析前检查透析袋。

4．在520nm处测得各管的光密度时，要加少许联二亚硫酸钠作还原剂。

三

4.实验结果

① 请根据下列结果用计算机绘制标准曲线，以获得方程式和斜率

②测量结果 标准od5思考问题的体积浓度

样品0.81.00.20.40.60.1750.3330.5080.6730.848

1.本实验采用酸溶液萃取、人工沸石吸附、硫酸铵溶液洗脱、三氯乙酸沉淀等步骤制备细胞色素并测定其含量的原理是什么？

2.影响细胞色素c得率的因素有哪些？

四

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