细胞色素C提取

更新时间:2023-12-08 02:39:44 阅读: 评论:0

2023年12月8日发(作者:虹怎么组词)

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细胞色素C提取

实验一、细胞色素C的制备和测定

摘要:细胞色素C为含铁卟啉的结合蛋白质,包括多种能够传递电子的含铁蛋白质。普遍存在于各类动植物组织和微生物中。它是呼吸链中极重要的电子传递体。细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂。在临床上能够纠正由于细胞呼吸障碍引发的一系列缺氧病症,使其物质代谢、细胞呼吸恢复正常,病情取得减缓或痊愈。在自然界中,细胞色素C存在于一切生物细胞里,其含量与组织的活动强度成正比。本实验以新鲜牛心为材料提取、制备和纯化细胞色素C,取得其粗品溶液,并进行含量测定。

关键词:细胞色素C 提取 制备 纯化 含量测定

一、原理:

细胞色素C包括多种能够传递电子的含铁蛋白质总称。普遍存在于各类动植物组织和微生物中。它是呼吸链中极重要的电子传递体,细胞色素C(cytochrome

c,CytC)只是细胞色素的一种。它在呼吸链上位于细胞色素还原酶和细胞色素氧化酶之间。线粒体中的细胞色素绝大部份与内膜紧密结合,仅有细胞色素C结合轻松,较易被分离纯化。

细胞色素C为含铁卟啉的结合蛋白质,每一个细胞色素C分子含有一个血红素和一条多肽链。分子质量约为13000,蛋白质部份由104个左右的氨基酸残基组成,其中赖氨酸含量较高,等电点,含铁量。它易溶于水,在酸性溶液中溶解度更大,故可用酸性水溶液提取。细胞色素C的传递电子作用是由于细胞色素C中的铁原子能够进行可逆的氧化和还原反映,故可分为氧化性和还原性,前者水溶液呈深红色,后者水溶液呈桃红色。细胞色素C对热,酸和碱都比较稳固,但三氯乙酸和乙酸可使之变性,引发某些失活。

细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂。在临床上能够纠正由于细胞呼吸障碍引发的一系列缺氧病症,使其物质代谢、细胞呼吸恢复正常,病情取得减缓或痊愈。在自然界中,细胞色素C存在于一切生物细胞里,其含量与组织的活动强度成正比。本实验以新鲜猪心为材料提取制备和纯化细胞色素C,取得其粗品溶液,方式简单易操作。

2 实验材料和方式 材料:

新鲜(冷冻)猪心样品。

试剂

① 1mol/L H2SO4 (L):500mL

② 1mol/L NH4OH(L):500mL

③ 12%BaCl2:250mL

④ 25%(NH4)2SO4:500mL

⑤ % NaCl:500mL

⑥ 20% 三氯乙酸(TCA):100mL

⑦ 人造沸石:白色颗粒, 40-60目

⑧ 联二亚硫酸钠

⑨ 细胞色素C标准液(3mg/ml)

仪器:

① 绞肉机

②电磁搅拌器

③离心机

④分光光度计

⑤透析袋等

实验方式:

2.4.1 材料处置

新鲜或冷冻猪心,除尽脂肪、血管和韧带,洗尽积血,切成小快,放入绞肉机中绞碎(两遍)。

2.4.2 细胞色素C粗品制备

2.4.2.1 提取:

称取猪心碎肉200克,加自来水300毫升酸化水(水预先用6~8毫升,1mol/L的硫酸酸化)。用电磁搅拌器搅拌提取,再用1mol/L的硫酸调PH=(需要不断调整),搅拌提取小时。用1mol/L的氨水调PH=,停止搅拌。四层纱布挤压过滤,搜集滤液。

2.4.2.2 中和: 用1mol/L的氨水调滤液PH=,利用等电点沉淀杂蛋白,静置20~30分钟,使沉淀沉下。虹吸上部清夜,过滤除杂质,下部浑浊液离心(3000rpm,15min)。归并取得的红色清夜,测量体积。

2.4.2.3 吸附:

每人称取人造沸石4g,加水搅拌,除去12s内不下沉的细颗粒。向柱内加去离子水至1/2体积,然后边搅拌边持续、均匀地将预处置好的人造沸石水溶液装填入柱,幸免柱内显现气泡。装柱完毕,打开柱下端夹子,使柱内沸石面上剩下一薄层水。

将中和好的澄清滤液警惕加到沸石上面,勿冲动沸石,使之流入柱内进行吸附,操纵流出液的速度不超过10ml/min。随着细胞色素C被吸附,人造沸石由白色变成红色,流出液应为淡黄色或微红色。

2.4.2.4 洗脱

吸附完毕,可在柱内洗涤:依次用30ml自来水、去离子水、%氯化钠溶液、去离子水洗柱。然后用25%硫酸铵溶液洗脱(流速小于2ml/min),搜集红色洗脱液(洗脱液一旦变白,当即停止搜集),测量体积(操纵在15ml左右)。洗脱完毕,人造沸石回收,可再生利用。

2.4.2.5 盐析

为了进一步提纯细胞色素C,向洗脱液中缓慢加入固体硫酸铵,边加边搅拌,使硫酸铵溶液浓度为45%(约相当于67%的饱和度,即100ml洗脱液加17g硫酸铵),放置留宿,杂蛋白沉淀析出,过滤,搜集红色透亮的细胞色素C滤液,测量体积。

2.4.2.6 TCA 沉淀

按8%体积滴加20%TCA,边加边搅拌。现在细胞色素带正电荷,与其结合生成可逆沉淀析出,当即离心(3000rpm,15min),搜集沉淀(假设上清液仍为红色,倒出后再补加5%体积的TCA,再次离心,搜集沉淀)。沉淀用少量去离子水溶解(体积不超过10mL)。

2.4.2.7透析

溶解液装入透析袋对自来水(30min)、去离子水(10~20min)透析(用磁力搅拌器搅拌),用BaCL2 检测袋周围水的SO4(用试管搜集流下来的2透析液约1ml,滴加1-2滴BaCL2试剂至试管中。摇匀假设无白色沉淀,表示透析完全)。过滤除去不溶物质,取得细胞色素C的粗品液,量体积,测定其含量。

3 结果与分析

以细胞色素C的浓度(mg/ml)为横坐标,以吸光度A520nm为纵坐标制作标准曲线,按表1绘制细胞色素C含量的标准曲线(图1),从标准曲线上按公式:

计算出样品液中细胞色素C的质量(mg)。

试管编号

标准溶液(ml)

蒸馏水(ml)

还原粉(联二亚硫酸钠)

A520nm

1

0

4

2

3

4

5

6

7(样品液)

(ml)

8

0

少许(约3mg)

图1 细胞色素C标准曲线

标准曲线0.7000.6000.5000.4000.3000.2000.1000.0000.000.10y = 0.8284x + 0.0035R = 0.99792吸光度0.200.300.40浓度0.500.600.700.80C

C色素= =(mg/ml)

注意事项:

(1) 酸水提取时,由于组织液的释出使pH上升,因此需不断调整pH直至稳固在。 (2) 为使细胞色素C充分被沸石柱吸附,吸附时流速应该慢些。洗脱时一样操纵流速慢些,使细胞色素C在比较少体积内被充分洗脱出来。

(3) 盐析时需加入粉末状硫酸铵,而且边加边搅拌,切忌一下子到进去,造成局部浓度过大使细胞色素C被盐析。

(4) 三氯乙酸是一种蛋白变性剂,可使蛋白质变性沉淀。要通过操纵三氯乙酸的浓度和作历时刻,使其产生的是可逆沉淀,达到进一步纯化作用。因此必需要逐滴加入三氯乙酸,搅匀后尽快离心,幸免局部酸浓度过大和接触时刻太长,产生细胞色素C不可逆变性沉淀造成损失。

(5) 透析脱盐是利用细胞色素C分子较大,不能通过必然截留值的半透膜,而其中的盐分由于分子较小,浓度很高,容易透过半透膜从高浓度向低浓度的水相移动,达到去除成效。而且在透析前必然要检查透析袋有无渗漏。

(6) 为尽可能减少损失,在每一个操作进程都要细心,例如过滤用的纱布、滤纸事前必然要用少量水润湿。

(7) 加入过量还原粉(联二亚硫酸钠)会使测定溶液迅速变混浊而无法比色,因此加入量应严格操纵,并迅速比色。

4 试探题

1、试以细胞色素C的制备为例,总结出蛋白质制备(分离纯化)的要紧方式,并简述其原理。

答:(1)透析和超滤:利用大分子不能透过半透膜,而小分子能够穿过半透膜,从而达到分离纯化的目的;(2)等电点沉淀:利用蛋白质在其等电点的溶解度最小,且不同蛋白质的等电点不相同,从而达到分离纯化的目的;(3)盐析:利用蛋白质在盐溶液中可产生可逆沉淀而达到分离纯化的目的;(4)有机溶剂沉淀(5)电泳(6)亲和色谱

2、本实验应用了哪些大体的生化分离纯化的方式?

答:(1)透析;(2)等电点沉淀;(3)盐析;(4)层析

3、有哪些方式能够进行蛋白质脱盐处置?

答:(1)透析;(2)凝胶过滤

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标签:细胞   色素   沉淀   沸石   提取   蛋白质
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