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测定猪不同组织基因表达时RT-PCR内参基因的选择

更新时间:2023-12-07 15:55:55 阅读：评论：0

2023年12月7日发(作者：高一三角函数公式)

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齐波;朱荣生;王怀中;孙守礼;王建才;刘俊珍;黄保华;呼红梅

【摘要】Taking different organizations of 95 kg weight fatten pigs,the

expressions of 11 houkeeping genes

(SDHA),(HMBS),(TOP2B),(ACTB),(B2M),(PPIA),(GAPDH),(HPRT1),(RPL4),(TBP)

and (YWHAZ) were detected using real-time quantitative the

stability of internal genes was evaluated by geNorm s of

geNorm program analysis showed that TBP and RPL4 were stable

expression internal genes in muscle tissue, GAPDH and RPL4 were stable

expression internal genes in heart tissue, TBP and HPRT1 were stable

expression internal genes in liver tissue, SDHA and ACTB were stable

expression internal genes in spleen tissue, B2M and HPRT1 were stable

expression internal genes in lung it can be en that the most

stable expression internal genes in different tissues of pig are different,and

the internal genes to standardize target genes in different tissues are also

different.%以95 kg体重育肥猪的不同组织为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术,对SDHA、HMBS、TOP2B、ACTB、B2M、PPIA、GAPDH、HPRT1、RPL4、TBP和YWHAZ共11个候选内参基因表达量进行检测,应用geNorm 程序对内参基因的稳定性进行分析.结果表明,肌肉组织中稳定表达的内参基因是TBP、RPL4,心脏组织中稳定表达的内参基因是GAPDH、RPL4,肝脏组织中稳定表达的内参基因是TBP、HPRT1,脾脏组织中稳定表达的内参基因是SDHA、ACTB,肺脏组织中稳定表达的内参基因是B2M、HPRT1,肾脏组织中稳定表达的内参基因是B2M、TBP.由此可见,不同组织中最稳定表达的内参基因不同,不同组织中标准化目的基因的内参基因也不一样.

【期刊名称】《家畜生态学报》

【年(卷),期】2017(038)006

【总页数】5页(P8-12)

【关键词】猪;实时荧光定量PCR;内参基因选择;geNorm程序;基因表达

【作者】齐波;朱荣生;王怀中;孙守礼;王建才;刘俊珍;黄保华;呼红梅

【作者单位】青岛农业大学动物科技学院,山东青岛 266109;山东省农业科学院

畜牧兽医研究所,山东济南 250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,山东

济南 250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东济南 250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,山东济南 250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东济南 250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,山东济南 250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东济南 250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,山东济南 250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东济南 250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,山东济南 250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东济南 250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,山东济南

250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东济南 250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,山东济南 250100

【正文语种】中文

【中图分类】S811.5 实时荧光定量 PCR 技术(RT-PCR)是测定mRNA 表达水平的一种基准方法，与常规PCR相比，RT-PCR具有定量准确、灵敏度高、重复性好、特异性强以及能实现高通量操作等特点，因此在基因表达的定量研究中获得广泛应用[1-2]。然而，越来越多的报道表明RT-PCR数据的准确性和重现性紧密依赖于合适的标准化方法[3]。在基因表达分析中选择一种合适的内参基因对目的基因的表达量进行校正可以提高该方法的灵敏度和重复性[4]。理想的内参基因应在所研究的各种试验因素条件下均恒定表达，但是受到RNA提取中的RNA的质量和纯度、逆转率效率、PCR效率和试验条件等因素的影响[5-6]，任何一种内参基因在所有的试验条件下都不是恒定表达的，在不同类型组织的细胞、在组织细胞生长的不同阶段，内参基因的表达都存在着较大的差异[7]。为了避免不同样本之间内参基因的表达差异，并保证RT-PCR数据分析的准确性，研究者提出多种方法[8]，从候选内参基因中选择出最稳定表达的标准化RT-PCR数据的内参基因的最好方法是由Vandesompele等编写出的geNorm 程序，该方法改变了传统的采用单一内参基因对目的基因进行标准化的方法，可以通过geNorm 程序，筛选出2个以上的候选内参基因作为内参基因，以便更能准确定量PCR反应中目的基因的表达[12]。本试验针对育肥猪不同类型的组织，筛选出适合各组织的稳定表达的内参基因，并对目的基因进行校正和标准化，以期获得比较真实可信的结果。

选择22头92～95 kg体重长白猪×太湖猪二元猪进行屠宰，屠宰按照NY/T 825-2004进行。宰后45 min内取肌肉(最后肋骨处)、心、肝、脾、肺、肾，迅速置液氮中保存，用以提取总RNA。

利用RNAiso Plus(TaKaRa, Dalian, China)试剂进行肌肉和内脏组织总RNA的提取。提取的总RNA，经0.8%变性琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific，America)检测RNA的质量和浓度。取1 μg左右的RNA，先利用The PrimeScript RT reagent kit with gDNA Erar(Takara，Dalian，China)试剂盒中的gDNA Erar降解RNA中残留的DNA，以避免RNA中残留的DNA对目的基因表达定量结果的影响，然后再利用该试剂盒中的PrimeScript RT Enzyme Mix 1逆转录RNA为cDNA。定量PCR反应前，用双蒸水对cDNA溶液进行4倍稀释。

根据相关文献报道，选择11个不同功能的常用内参基因，包括SDHA、HMBS、TOP2B、ACTB、B2M、PPIA、GAPDH、HPRT1、RPL4、TBP和YWHAZ，作为候选内参基因进行表达稳定性分析。候选内参基因的具体信息详见表1所示，HPRT1、HMBS和YWHAZ的引物由TaKaRa公司设计，剩余基因的引物参考相关文献。

荧光定量试剂盒为LightCycler○R 480 SYBR Green I Master(Roche公司)，荧光定量仪器为Roche公司的Roche LightCycler○R 480。反应体系为20 μL，包括：Blue-SYBR-Green mix 10 μL，上、下游引物(10 pM/μL)各1 μL，cDNA 1 μL，双蒸水7 μL。反应程序为：①预变性：95 ℃ 5 min；②扩增反应：95 ℃预变性10 s，60 ℃退火和延伸20 s，45个循环；③溶解曲线形成：95 ℃ 5 s，65 ℃ 1

min，97 ℃ 10 s。反应后根据溶解曲线分析PCR产物的特异性，分别导出目的基因和内参基因的CT值。

1.4 数据分析

内参基因的分析：在Excel中设定不同样本中某一参考基因Ct值最小者为1，其他样本中参考基因的相对表达量则为2-ΔCt(ΔCt=样本Ct值-最小Ct值)，将这些数据导入geNorm V3.5，对各候选内参基因进行稳定性评价[12]。

2 结果与分析

2.1 组织表达稳定度

经 geNorm 软件评价分析，肌肉组织中 11 个内参基因稳定性平均值 M 从大到小依次为：SDHA(0.698)>ACTB(0.523)>YWHAZ(0.495)>PPIA(0.437)>HMBS(0.391)>TOP2B(0.389)>HPRT1(0.375)>B2M(0.370)>GAPDH(0.358)>TBP(0.322)>RPL4(0.321)(图1)。去掉稳定性最差的一个内参基因，重新计算剩余内参基因的 M 值的平均值，依次类推可得到最稳定的2 个内参基因的 M 均值为 0.11658，即 TBP

和 RPL4两个内参基因联合使用可以达到最高的表达稳定性；心脏组织中 11 个内参基因稳定性平均值 M 从大到小依次为：HPRT1(0.907)>SDHA(0.860)>YWHAZ(0.792)>TOP2B(0.766)>TBP(0.730)>ACTB(0.692)>B2M(0.654)>PPIA(0.561)>GAPDH(0.546)>HMBS(0.532)>RPL4(0.511)，筛选出的两个联合使用的内参基因是GAPDH和RPL4；肝脏组织中 11

个内参基因稳定性平均值 M 从大到小依次为：YWHAZ(2.694)>SDHA(1.512)>TOP2B(1.349)>PPIA(1.222)>HPRT1(1.193)>RPL4(1.152)>GAPDH(1.079)>TBP(1.072)>ACTB(1.036)>B2M(0.998)>HMBS(0.985)，筛选出的两个联合使用的内参基因是TBP和HPRT1；脾脏组织中 11 个内参基因稳定性平均值 M 从大到小依次为:

TBP(2.618)>GAPDH(2.132)>B2M(0.903)>HPRT1(0.880)>SDHA(0.865)>ACTB(0.840)>PPIA(0.826)>TOP2B(0.819)>HMBS(0.762)>YWHAZ(0.754)>RPL4(0.732),筛选出的两个联合使用的内参基因是SDHA和ACTB；肺脏组织中 11 个内参基因稳定性平均值 M 从大到小依次为：RPL4(2.378)>SDHA(1.726)>

GAPDH(1.531)>TOP2B(1.272)>PPIA(1.098)>HMBS(1.078)>TBP(1.078)>YWHAZ(1.059)>ACTB(1.008)>HPRT1(0.961)>B2M(0.936),筛选出的两个联合使用的内参基因是B2M和HPRT1；肾脏组织中 11 个内参基因稳定性平均值 M 从大到小依次为：TOP2B(1.174)>SDHA(0.970)>YWHAZ(0.924)>ACTB(0.872)>PPIA(0.860)>HPRT1(0.749)>RPL4(0.683)>TBP(0.668)>GAPDH(0.633)>HMBS(0.594)>B2M(0.588)，筛选出的两个联合使用的内参基因是B2M和TBP。

图1 不同组织候选内参基因的平均表达稳定度A.肌肉组织；B.心脏组织；C.肝脏组织；D.脾脏组织；E.肺脏组织；F.肾脏组织Fig.1 The average expression

degree of stability of the candidate internal genes in different tissuesA.

muscle tissue; B. heart tissue; C. liver tissue; D. spleen tissue; E. lung tissue;

F. kidney tissue

2.2 内参基因之间的相对表达量

GeNorm 软件以 0.15 为默认取舍值，即当 Vn/n+1< 0.15 时，说明没必要使用数量≥n+1的看家基因作为内参，由图2可以得出V2/3都小于0.15，内参基因的最适数目为2个，不需要再选择第三个候选基因作为内参就能满足试验需要。

3 讨论

对 mRNA 表达进行定量的技术，包括 RNA 印迹、基因芯片、实时荧光定量 PCR等，都需要选择内参基因来对目的基因的表达结果进行校正，并要求理想的内参基因应在所研究的组织、细胞和试验条件下均稳定表达。在众多的实时荧光定量PCR 试验中，研究者多采用单一内参基因对目的基因校正的方法。目前，大量筛选内参基因的研究都是针对某些物种的特定组织[13-14]。但是任何一种看家基因的恒定表达都只是在一定条件下特殊的恒定，在不同类型的细胞、组织，在器官发育的不同阶段以及不同试验条件下，内参基因的表达量通常会存在较大变异。选择单一看家基因作为内参基因，可能检测不出 PCR反应中基因的细微变化，甚至会导致错误的结论[15-17]。为了获得有意义的试验数据，研究者应根据各自特殊的

组织及试验条件来选择合适的内参基因。

图2 不同组织内候选内参基因的配对差异值VA.肌肉组织；B.心脏组织；C.肝脏组织；D.脾脏组织；E.肺脏组织；F.肾脏组织Fig.2 The paired difference value V

of the candidate internal genes in different tissuesA. muscle tissue; B. heart

tissue; C. liver tissue; D. spleen tissue; E. lung tissue; F. kidney tissue

本研究检测了猪的不同组织中内参基因的稳定性和表达水平。分别通过实时荧光定量PCR对11个不同功能的看家基因的mRNA表达进行检测，通过geNorm 程序计算其表达稳定度 M 值。GeNorm程序通过基因配对的形式，去除最不稳定的基因，然后将剩下基因重新排序重新配对进行筛选最终选出合适数目的内参基因[18]。在同一试验条件下，当有多个内参基因可以选择时，软件会分析其最佳配对变异值 Vn/n+1，从而为我们选择最适的内参基因数目提供参考依据。程序默认的基因配对比值为 0.15，当有n个内参基因时，比值 Vn/n+1<0.15，说明 n个内参基因已经能够准确校正目标基因的表达量，此时无需引入第(n+1)个内参基因。从GeNorm 软件分析结果(图2)可以得出，V2/3(肌肉组织) = 0.047，V2/3(心脏组织)= 0.056，V2/3(肝脏组织)=0.131，V2/3(脾脏组织)=0.115，V2/3(肺脏组织)=0.139，V2/3(肾脏组织)=0.084，均小于0.15，说明在猪不同组织样品中，都没有必要引入第3个内参基因来消除差异。并且根据 M 值以及其最适的基因配对数，肌肉组织中最佳的内参基因组合为 TBP 和 RPL4，心脏组织中最佳的内参基因组合为GAPDH和RPL4，肝脏组织中最佳的内参基因组合为TBP和HPRT1，脾脏组织中最佳的内参基因组合为SDHA和ACTB，肺脏组织中最佳的内参基因组合为B2M和HPRT1，肾脏组织中最佳的内参基因组合为B2M和TBP。

本试验结果表明，育肥猪中不同组织中最稳定表达的内参基因有所不同。本研究推荐研究者做相关试验时可以根据各自试验的特点，选择最稳定表达的内参基因的几何平均数作为标准化相关RT-PCR数据的指标[19]。

参考文献： [1] Valak M A, Repa J J. The power of real-time PCR[J]. Advances in

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for Quantitative Real-Time PCR Experiments[M]. Springer New York, 2014,

1160(1160):5-17.

Selection of Reference Genes of Real-time Quantitative PCR in the Gene

Expression of Different Tissues in Pig

QI Bo1，ZHU Rong-sheng2,3，WANG Huai-zhong2,3，SUN Shou-li2,3，WANG Jian-cai2,3，LIU Jun-zhen2,3，HUANG Bao-hua2,3*，HU Hong-mei2,3*

(1. College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural

University，Qingdao Shandong 266109，China;2. Institute of Animal

Husbandry and Veterinary，Shandong Academy of Agricultural University，Jinan Shandong 250100，China;3. Shandong Provincial Key Laboratory of

Animal Dia Control and Breeding， Jinan Shandong 250100，China)

Abstract：Taking different organizations of 95 kg weight fatten pigs，the

expressions of 11 houkeeping genes (SDHA)，(HMBS)，(TOP2B)，(ACTB)，(B2M)，(PPIA)，(GAPDH)，(HPRT1)，(RPL4)，(TBP) and (YWHAZ)

were detected using real-time quantitative PCR. And the stability of

internal genes was evaluated by geNorm program. Results of geNorm

program analysis showed that TBP and RPL4 were stable expression

internal genes in muscle tissue, GAPDH and RPL4 were stable expression internal genes in heart tissue, TBP and HPRT1 were stable expression

internal genes in liver tissue, SDHA and ACTB were stable expression

internal genes in spleen tissue, B2M and HPRT1 were stable expression

internal genes in lung tissue. Thus it can be en that the most stable

expression internal genes in different tissues of pig are different，and the

internal genes to standardize target genes in different tissues are also

different.

Key words：pig; real-time quantitative PCR; lection of the reference

genes; GeNorm program; gene expression

* [收稿日期] 2016-12-08

修回日期：2017-03-02

[基金项目] 国家自然科学基金(31501928)；山东省科技发展计划(2015GNC111011)；山东省农业科学院青年基金(2014QNM41)；山东省自然基金(ZR2015CM007)；山东省农业科学院科技创新重点项目(2014CX202)

[作者简介] 齐波(1990-)，男，山东平邑人，硕士研究生，主要研究方向：动物营养。E-mail:******************* [通讯作者] 黄保华(1964-)，男，山东昌邑人，研究员，主要研究方向：动物营养。E-mail:**************；呼红梅(1976-)，女，山东冠县人，副研究员，硕士，主要研究方向：动物营养。E-mail:**********************[中图分类号] S811.5

[文献标识码]A

[文章编号]1005-5228(2017)06-0008-05

2.2 内参基因之间的相对表达量

3 讨论

组织及试验条件来选择合适的内参基因。

图2 不同组织内候选内参基因的配对差异值VA.肌肉组织；B.心脏组织；C.肝脏组织；D.脾脏组织；E.肺脏组织；F.肾脏组织Fig.2 The paired difference value V

of the candidate internal genes in different tissuesA. muscle tissue; B. heart tissue; C. liver tissue; D. spleen tissue; E. lung tissue; F. kidney tissue

参考文献：

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