荧光探针在细胞成像领域的研究进展

2023年12月5日发(作者：记忆深处的)

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荧光探针在细胞成像领域的研究进展

杨媛;马拉毛草;马恒昌

【摘 要】荧光成像技术是生物医学领域的重要研究手段,可对目标分子进行原位实时的监测,且这种方法具有无损伤、高特异性和高灵敏度,以及能在细胞水平获得更高的分辨率等优势.近年来,荧光材料在离子分子识别、医学诊断、生物分子检测以及生物成像等领域显示出了重要的应用价值,因此受到越来越多的化学和材料工作者的重视.综述了碳纳米材料、半导体量子点、稀土金属、有机荧光小分子、聚合物荧光纳米颗粒几种常见不同类型的荧光探针材料在细胞成像领域的应用,介绍了其发射波长、荧光量子产率、生物相容性、光稳定性、细胞毒性以及遗传毒性等特性.设计并合成发射波长较长、Stokes位移大、生物相容性好、光稳定性好、廉价的荧光探针将是荧光成像技术的主要研究方向.

【期刊名称】《功能材料》

【年(卷),期】2018(049)009

【总页数】7页(P9031-9037)

【关键词】荧光材料;荧光探针;细胞成像

【作 者】杨媛;马拉毛草;马恒昌

【作者单位】西北师范大学 化学与化工学院,生态环境相关高分子材料教育部重点实验室,甘肃省高分子材料重点实验室,兰州 730070;西北师范大学 逸夫图书馆,兰州 730070;西北师范大学 化学与化工学院,生态环境相关高分子材料教育部重点实验室,甘肃省高分子材料重点实验室,兰州 730070 【正文语种】中 文

【中图分类】O63

0 引 言

荧光成像技术是生物研究和临床诊断中最广泛，最有力的可视化技术之一，具有选择性、可见性和可调性[1-2]。随着荧光探针的多样化及相关仪器的改进，荧光成像技术已广泛应用于分子、细胞及组织等不同层次的成像，即标记特殊离子，检测生物大分子，示踪活细胞的生物学行为、体内特殊器官或肿瘤的成像等[3-4]。

荧光探针现已广泛应用于化学传感[5]、光电材料[6]、分子检测[7]和生物活体成像[8]等领域。其中，对于荧光成像技术而言，荧光探针扮演了十分重要的角色，起到对观察对象进行标记和示踪的作用。因此，设计并合成/制备出发射波长范围广、荧光量子产率高、生物相容性好、细胞毒性小等的荧光探针成为化学和材料工作者研究的热点，是重要的研究课题[9]。本文综述了近几年报道的荧光材料，主要包括无机荧光材料和有机荧光材料。无机荧光材料又包括碳纳米材料、半导体量子点、稀土金属等，有机荧光材料包括小分子荧光探针和聚合物荧光探针。这些材料因其优异的性能可应用于分子/离子检测、细胞器成像以及细胞行为学研究。

1 无机材料荧光探针

1.1 碳纳米荧光探针

1.1.1 富勒烯荧光探针

1985年Smalley等[10]报道了富勒烯之后，引起了化学工作者极大的关注。2016年Tan课题组[11]制备了一种水溶性荧光富勒烯(C60-TEG-COOH)包覆的介孔二氧化硅纳米粒子(MSN)，用于pH敏感药物释放和细胞荧光成像，如图1所示。在体外研究中，所制备的材料显示出优异的生物相容性并且载有DOX的纳米载体表现出有效的抗癌能力。

1.1.2 碳量子点荧光探针

碳量子点(CDs)的发射波长横越可见光区和近红外区[12]，具有细胞毒性低、光稳定性高等优异性质。2015年Tarasankar等[13]合成了CDs，其发射波长为390

nm,荧光量子产率达5.1%。如图2所示，作者用CDs对L929活细胞进行染色，用溴化乙锭(选择性地染色死细胞)进行对比，两部分之间几乎没有重叠，说明CDs是非常好的活细胞成像的荧光探针。

1.1.3 碳纳米管荧光探针

碳纳米管按石墨烯层数可分为单壁碳纳米管(SWCNTs)和多壁碳纳米管(MWCNTs)。2015年Antaris[14]等对碳纳米管进行简单分离得到超高纯度的(6,4)SWCNTs，可用于超高灵敏度的分子成像，甚至可检测细胞表面上的某些特殊蛋白质。

1.1.4 氧化石墨烯荧光探针

氧化石墨烯是石墨烯的重要衍生物，被广泛运用于生物成像中。2017年课题组制备了一种三苯胺衍生物改性的氧化石墨烯[15]。其表现出优异的光学性能，在细胞成像当中具有广阔的应用前景。它能够对HepG2细胞进行清晰地显影，如图3所示。

图1 HeLa细胞荧光成像[11]Fig 1 Fluorescence microscopy images of HeLa

cell [11]

图2 L929细胞荧光成像图片[13]Fig 2 Fluorescence imaging of L929 cell [13]

图3 染色30 min后，在不同的放大倍数下，HepG2细胞的荧光成像[15]

Fig 3 Fluorescence images of HepG2 cell stained with GO-KH550-DNDT for

30 min under different magnification[15]

1.1.5 纳米金刚石荧光探针

纳米金刚石是金刚石的纳米颗粒。2018年Chen等[16]通过RAFT聚合得到了一种基于FND的复合材料，将其应用于细胞成像。这种聚合方法可控，反应时间短，环境友好，能耗低，在表面改性中提供了一种有应用前景的聚合方法。

1.2 半导体量子点荧光探针

半导体量子点的发射波长可通过晶粒尺寸与组成进行调控。2015年Yang等[17]制备了水溶性的锗掺杂的硫化镉量子点。锗的掺杂使其荧光增强，同时提升其光稳定性。在其表面修饰叶酸之后被用作荧光探针来标记MCF-7细胞，叶酸与叶酸受体的靶向快速结合可以帮助该量子点很好地实现细胞成像。

1.3 稀土金属荧光探针

2015年Chen等[18]设计合成了一种铱配合物Ir-MitoNO作为双光子磷光探针用于线粒体中NO的成像。其具有线粒体靶向和双光子成像属性，可将其应用于实时监测和追踪活细胞线粒体中的NO。

2 有机材料荧光探针

2.1 有机小分子荧光探针

2.1.1 罗丹明类荧光探针

罗丹明类分子发射波长长，荧光量子产率高[19]，是荧光探针常用的发光基团。2015年Wang等[20]合成了一类近红外发射的罗丹明分子，光稳定性好，Stokes位移大。其中AFR1、AFR1E和AFR2表现出线粒体靶向性，AFR3有溶酶体靶向性，如图4所示。其在细胞成像方面具有潜在的应用价值。

2.1.2 氟硼荧类荧光探针

氟硼荧类分子摩尔吸光系数大[21]，近年来对它的研究主要是倾向于设计合成长波长的分子。2014年Jiao等[22]合成了一系列近红外吸收的氟硼荧分子。选择溶解性好的A3分子和A4分子用于细胞成像。两个分子都能快速的进入细胞中，发射红色荧光，表现出良好的细胞成像能力，为近红外荧光成像探针提供了一种设计思路。 图4 罗丹明类分子结构和罗丹明类分子分别对A549细胞的共聚焦成像[20]

Fig 4 The molecular structures of AFR dyes and confocal fluorescence

microscopy images of A549 cell incubated with compound AFR1, AFR1E,

AFR2 and AFR3[20]

2.1.3 荧光素类荧光探针

荧光素结构中苯环上的氢或者羟基氢被别的基团取代后生成多种荧光素的衍生物，是重要的荧光探针材料。2015年，Chen等[23]报道了一个荧光素衍生物分子，其在水溶液中对Au3+的选择性好，灵敏度高，将其成功用于细胞中Au3+的荧光成像。

2.1.4 菁类荧光探针

菁类分子的发射波长位于近红外区(650～900 nm)，在生物成像中能有效避免生物体及细胞自吸收和自身荧光背景因素的干扰[24]，有利于生物活体深层组织成像研究。2018年Gao等[25]合成了一个新型自组装纳米胶囊CF-DiR NCs。其不仅可以将双抗癌药物直接递送到肿瘤，达到最大的化学疗法功效和最小的副作用，也可以在荧光成像指导下进行精准的光热疗法减少对周围健康组织的伤害。

2.1.5 四苯乙烯(TPE)类荧光探针

四苯乙烯分子结构简单，是一种理想的荧光探针基底材料。TPE作为一个典型的聚集致诱导发射(AIE)分子[26]，克服了传统有机荧光分子进入细胞后浓度增大导致荧光猝灭的缺点。2018年Tang等[27]通过引入特定烷基链来大大提高基于四苯乙烯(TPE) AIEgens的荧光量子产率，而保持其发光颜色不变。这种智能的AIEgens不仅具有压力、温度、粘度和光响应性，而且被成功应用于动态监测和控制聚合物共混物中的相分离形态。

2.1.6 三苯胺(TPA)类荧光探针

2017年，课题组[28]合成了一系列以TPA为核的D-A体系化合物，如图5所示。通过研究发现它们对ATP具有高灵敏度、特异性地识别。其中TPA-PPA-3检测限高达0.3×10-6。

图5 化合物TPA-PPA-1、TPA-PPA-2、TPAPPA-3和TPA-PP的分子式以及TPA-PPA-1、TPA-PPA-2、TPAPPA-3和TPA-PP的细胞荧光共聚焦成像[28]

Fig 5 Chemical structures of TPA-PP, TPA-PPA-1, TPA-PPA-2 and TPA-PPA-3 and co-staining of HepG2 cell with TPA-PP, TPA-PPA-1, TPA-PPA-2 and

TPA-PPA-3[28]

2.2 聚合物荧光纳米颗粒荧光探针

聚膦腈化学交联的纳米体系可通过化学交联的方法有效避免荧光分子之间的堆积和相互作用，进而避免ACQ问题，来实现较好的荧光发射性能，同时聚膦腈纳米体系优异的生物相容性及可降解性也为其生物成像奠定了基础。2014年，Lu等[29]制备出聚膦腈TPP-PZS颗粒。其表现出优异的光漂白抗性，并且对Hg2+具有高灵敏度和选择性，被用于快速检测/监测Hg2+。2015年，他们[30]通过一锅缩聚制备得到PCTPDBF纳米颗粒。其形态和大小可以通过改变溶剂和反应物浓度来调整。荧光单元被分离并“固定”在交联结构中，这可以很好地抑制荧光探针的ACQ效应。因其具有良好的生物相容性、抗光漂白和抗蛋白质干扰性，可以用作细胞成像的理想荧光剂。

2016年，课题组[31]将TPE与NIPAM共聚得到了具有多重功能的AIE荧光探针材料P6。将其应用于HeLa细胞成像，通过传代实验发现，对第10代细胞仍然能够清晰的显影。课题组[32]又以TPA为核设计合成了化合物TPPA-DBO，考察了TPPA-DBO对于细胞核成像的普适性，其在细胞核靶向染色领域具有普遍的适用。如图6所示，染料在细胞核区域荧光强度高，完全覆盖细胞核区域。

图6 化合物TPPA-DBO化学结构式，TPPA-DBO对A549, HeLa, H4, HCM细胞系的细胞核染色[32]

Fig 6 The molecule structure of TPPA-DBO and nuclear staining of TPPA-DBO (10 μg/mL) toward living A549, HeLa, H4 and HCM cell [32]

3 结 语

在荧光成像的多种探针中，碳纳米材料的种类丰富、细胞毒性最小，适用于活体成像，但是多数碳纳米材料荧光量子产率低，对细胞背景抗干扰能力差。半导体量子点光漂白抗性差，所含金属元素细胞毒性大。稀土金属材料在细胞成像过程中表现出其独特的荧光寿命优势，但是所含金属元素细胞毒性也比较大。有机小分子荧光探针，荧光量子产率高，发光波长横跨可见光和近红外光区，能实现深层组织的成像，却仍然受限于大部分有机小分子细胞毒性大、生物相容性差，不能实现更高分辨的细胞成像。聚合物分子合成方法复杂，溶解性差，不利于拓展应用。相较于普通有机荧光材料，D-π-A体系的荧光探针，因其较好的分子内电荷转移现象，所以具有良好的光稳定性、抗光漂白性等优点。因此，通过简单的方法如设计合成D-π-A体系的化合物、与NIPAM等生物相容性好的化合物聚合、引入吡啶等杂环化合物，来得到发射波长较长、Stokes位移大、生物相容性好、光稳定性好且廉价的荧光探针，并使其实现高分辨率的细胞成像，具有很大的研究价值与意义。

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