某科研项目拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

更新时间:2023-12-04 19:53:10 阅读：评论：0

2023年12月4日发(作者：横湖小学)

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1. 技术路线

基因芯片鉴定X、Y在肠癌肝转移组织中特异性高表达Y基因RNAi慢病毒感染感染X基因RNAi慢病毒Y沉默后SW1116细胞增殖能力显著降低X基因过表达慢病毒感染X沉默后SW1116细胞增殖被抑制，迁移能力显著降低感染Y基因过表达慢病毒Y沉默后，过表达X，SW1116细胞增殖有稍许增强X沉默后，过表达Y对SW1116细胞增殖、迁移无显著影响X-Y轴可能调控大肠癌肝转移的发生裸鼠移植瘤模型基因芯片筛选X沉默后下游分子变化半乳糖基转移酶可能是X调节肠癌细胞肝转移模式的关键裸鼠肠癌肝转移模型qPCR、WB验证X对半乳糖基转移酶的调控EMSA/Co-IP实验验证X-Y的RNA/蛋白相互作用对X的序列进行分段，分别构建载体，用Co-IP的方法检测与Y结合的区域对目标序列区域进行分析，设计点突变，验证XY结合的位点500例肠癌组织和肝转移组织样本的收集免疫组化检测X、Y蛋白表达和定位根据临床的病理资料/预后和随访资料分析X、Y表达对肠癌预后的临床意义对肠癌细胞体内成瘤能力的影响in vivo验证X-Y轴in vivo验证X-Y轴对肠癌细胞肝转移能力的影响半乳糖基转移酶抑制剂验证其在X介导肠癌细胞肝转移中的作用阐明X-Y在肠癌肝转移模式中的作用及机制备注：蓝色背景填充部分为前期已完成工作。

2. 研究方法

2.1 X、Y在结肠癌发生、发展中的作用和预后相关性

1) 回顾性收集肠癌临床标本500例，取手术切除的肠癌组织、匹配的肝脏转移灶手术和穿刺标本，新鲜组织液氮保存标本200例，石蜡块300例，全部病例均通过临床、影像学、病理诊断，术前未进行辅助治疗，来自某某医院2008-2013年临床收治病例，随访资料齐全。 2) 免疫组化检测组织切片中X、Y蛋白的表达及定位，分别设立阴性对照、肿瘤对照、肝转移对照。

3) SPSS16.0统计软件对X、Y表达及定位与临床标本进行病理关联性分析和预后统计分析，了解X、Y表达情况与相关临床资料之间的关系，单因素生存分析对临床各项指标与结肠癌生存期进行相关性分析，建立Cox比例风险回归模型，综合探讨临床各因素和X、Y表达与结肠癌肝转移、转移灶形成及预后的相关性。

2.2 体外、体内水平研究X、Y基因在肠癌肝转移中的调节功能

1) 制备X-shRNA慢病毒，建立X稳定沉默的细胞株，以无义序列作为阴性对照，利用MTT实验观察X沉默后细胞的生长曲线；克隆形成实验检测X沉默后细胞的克隆形成能力；流式细胞术结合PI单染、Annexin-V双染检测细胞周期和凋亡情况；细胞划痕实验、Transwell实验观察细胞运动能力的变化。与此同时，制备过表达X的慢病毒载体。

2) 在稳定沉默X的结肠癌细胞中，导入过表达Y的慢病毒载体，利用细胞生长曲线观察X沉默且Y过表达后细胞的增殖能力变化；细胞划痕实验、Transwell实验观察细胞运动能力的变化。同样地，在稳定沉默Y的结肠癌细胞中，导入过表达X的慢病毒载体，利用细胞生长曲线观察Y沉默&X过表达后细胞的增殖能力变化；细胞划痕实验、Transwell实验观察细胞运动能力的变化。

3) 制备结肠裸鼠皮下移植瘤模型，观察肿瘤生长情况，建立生长曲线，统计分析Y和X对结肠癌细胞体内成瘤能力的影响，明确Y和X在结肠癌恶性增殖的作用。实验分组：空白对照、Y沉默组、X沉默组、X沉默组+Y过表达组、Y沉默组+X过表达组。

4) 建立结肠癌肝转移动物模型，观察肝脏中的转移灶，统计分析Y和X对结肠癌肝转移能力的影响，明确Y和X在结肠癌肝转移过程中的作用。实验分组：空白对照、Y沉默组、X沉默组、X沉默组+Y过表达组、Y沉默组+X过表达组。

5) 处死裸鼠取得的肿瘤组织，利用qRT-PCR和免疫组化方法检测Y/X以及下游半乳糖苷酶的mRNA和蛋白的表达；部分肿瘤组织制备成冰冻切片，利用FITC和TRITC双标记免疫荧光染色，使用激光共聚焦显微镜观察X与Y的共定位情况。

2.3. X-Y轴调节结肠癌肝转移的分子机制研究

1) 通过基因芯片Microarray分析X过表达/沉默后基因表达谱变化情况，对原始数据进行归一化、标准化，差异表达分析，明确X消减后表达发生改变的下游调控分子，芯片结果中有显著差异的潜在作用分子，设计引物，通过qRT-PCR进行二次表达验证。

2) X基因过表达/沉默后发生显著表达差异的基因，利用Bayesian Network、Genes2Networks、Go-anaslysis软件进行signaling network 重建。解析X调控结肠癌细胞运动能力的信号通路网络，构建X为核心的信号分子网络。

3) 根据X基因沉默后影响的信号通路结果（半乳糖基转移酶及其上游调节信号通路），利用信号通路抑制剂处理X稳定过表达/沉默后结肠癌细胞和对照细胞，检测不同分子信号对X表达及功能的作用，验证阻断这些信号通路后对X在结肠癌中的功能表型的影响。

4) 采用信号通路高通量检测蛋白芯片，根据以上实验分析的通路情况，订购相应通路的Pathway Array试剂盒，按试剂盒操作，依据封闭、加入细胞裂解液、洗脱、加入抗体混合液、再次洗脱，加入辣根过氧化物酶HRP并洗脱、信号检测的步骤，检测X基因表达变化后的特定通路关键蛋白的变化。

5) 分别构建X、Y的真核表达载体，共转293T，通过免疫共沉淀（Co-IP）验证XY的相互结合作用。

6) 应用生物信息学技术模拟X与Y的结合位点。在结合位点制备不同氨基酸的突变体。采用RNAi方法敲减互作蛋白表达，接着转入互作蛋白的突变体，检测细胞功能表型变化。通过免疫共沉淀（Co-IP）验证X与Y之间的结合位点特异性。

7) EMSA实验验证X与Y之间的相互作用关系，参考蛋白相互作用实验，设计突变载体，再验证其结合特异性，由此揭示X作为Y调节蛋白其对下游RNA进行调控的精细机制。

3. 可行性分析

1) 研究目标切实可行：我们前期的工作已明确证实：Y可以调节结肠癌的恶性增殖，并且进行了大量的预实验，可支持本课题主要科学假设。本项目是对前期研究工作的进一步补充和完善，具有较好的可行性。

2) 技术平台与硬件设施完善：课题组成员长期从事结直肠癌的诊治和发生发展机制研究，在免疫组化、免疫印迹、实时荧光定量PCR、RNA 干扰、慢病毒包装、表达谱芯片研究等各个方面积累了大量的经验，本项目中所用到的实验技术以前均有所涉及，为本项目的实施提供了技术保障。本项目所需的主要仪器设备目前均已经具备。

3) 研究基础扎实：本课题组成员长期从事结直肠癌的基础和临床研究，具有良好的科研素质。在国内外杂志上发表了多篇结直肠癌基础研究和临床研究相关的论文。

4) 临床标本充足：仁济医院普外科长期从事结直肠癌的诊治，已经建立一套规范化的结直肠癌诊疗体系，拥有大量结直肠癌手术标本(每年1000余例)，能够保证课题所需大量的结直肠癌标本的要求。

5) 团队年轻优秀、成员配备合理：课题组成员大部分为中青年业务骨干，热爱科学研究，有较强的创新能力，能为实验投入大量的时间，每个人均有自己的研究专长，能保障本实验的顺利完成。

4. 本项目的特色与创新之处

1) 思路上创新：X和Y是Z家族中具有相互作用的一对分子，他们在结肠癌肝转移的过程中发挥差异性的功能。针对X-Y轴进行组合策略研究，能够解决更多维度的科学问题，对临床具有指导意义；

2) 内容上创新：X-Y轴在结肠癌癌中的功能作用和与癌变的关系还是未知领域，我们首先鉴定了Y，随后对Y和X的交互作用进行研究，能够进一步形成创新的研究成果。

5. 研究工作的进度安排

本项目预计在4年内完成，具体进展计划如下：

 2015.01－2015.12：定量PCR检测结肠癌及结肠癌肝转移新鲜组织标本中X和Y表达，分析临床病理及预后的相关性；X和Y基因过表达和shRNA慢病毒构建、包装和纯化，细胞功能检测；

 2016.01－2016.12：免疫组化检测结肠癌及结肠癌肝转移标本中Y和X表达，分析临床病理及预后的相关性；X和Y影响结肠癌肝脏转移和恶性增殖的动物实验。

 2017.01－2017.12：Pathway array分析X和Y调控结直肠癌细胞转移的信号通路网络；生物信息学分析与分子验证，通路抑制剂验证。

 2018.01－2018.12：Co-IP实验验证X与Y之间的相互作用关系。蛋白结合位点突变载体制备及其结合特异性验证。