生物技术产业论文——人血清白蛋白的研究与生产

2023年12月4日发(作者：怎么写对联)

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报告题目： 人血清白蛋白的研究与生产

一、人血清白蛋白国内外研究现状

1、人血清白蛋白的简要介绍

人血清白蛋白( human rum albumin，HSA) 是由585个氨基酸残基组成的单链无糖基蛋白质，具有结合、运输内源性与外源性物质和维持血浆pH、胶体渗透压稳定等生理活性。HSA主要是由18种氨基酸残基组成，N末端为天冬氨酸，C末端为亮氨酸。整个蛋白质分子共含有17个二硫键，Cys34上有唯一游离的巯基，在蛋白质修饰中有重要应用。HSA在血浆中最为丰富，是迄今为止产量最大、用量最大的蛋白质药物。在人体内,血清白蛋白具有维持血液渗透压和携带血液中多种配基(包括脂肪酸、氨基酸、类固醇、金属离子及药物)与组织进行交换等生理功能,临床用于手术输血和危重病人补液,治疗创伤休克、发烧、水肿、低白蛋白血症和红细胞过多症等,而且能增强人体抵抗能力,是重要的临床药物。由于HSA主要通过从血浆中提取而获得，具有来源有限、价格昂贵等缺点，因此，很多学者积极探讨基因工程、细胞工程等制备方法。关于HSA的非治疗作用如用作药剂辅料、诊断试剂、手性物质分离剂、培养基添加剂等的报道也越来越多。

2、HSA的生物功能

2.1运输功能

血液携带机体所需要的氧、蛋白质、糖类、脂肪、维生素、水和电解质等。血浆蛋白与多种物质结合成复合物,便于在血液中的运输。其中白蛋白与脂肪酸结合,使其成为水溶性;它也可以与一些小分子物质(如激素)呈可逆性的结合,防止它们从肾脏流失,并通过结合态和游离态之间的动态平衡,维持血液中这些物质浓度相对稳定。

2.2维持内环境相对稳定

机体细胞必须依靠血液在组织液与各内脏器官之间进行有效的水分、热量和物质交换,才能通过内脏器官的活动来维持内环境稳态。正常人血清渗透压约为5330mmHg。血清蛋白的分子质量大,所产生的渗透压小,不超过25mmHg,称为血清胶体渗透压,它可以维持血管内外的水平衡。血清胶体渗透压主要来自白蛋白。若白蛋白明显减少,血清胶体渗透压也将明显减少。血清pH值主要决定于血

清中的白蛋白和它的钠盐组成的缓冲对,所以人血清白蛋白及其它无机盐缓冲对协同缓冲了血清的酸碱变化。

2.3其它功能

最近,有报道人血清白蛋白与CD4受体的融合蛋白(HSA-CD4)可作为人免疫缺陷病毒(HIV)的感染阻断剂。该工艺利用了人血清白蛋白在人体内分布广,半衰期较长且没有酶学或免疫学活性,作为生物活性载体可以克服CD4蛋白在人体内半衰期极短的缺点。实验证明重组可溶性CD4能有效阻止HIV感染CD4+淋巴细胞,有望成为一种爱滋病毒的拮抗药物。

3、人血清白蛋白的研究与开发 当前市场上所用的 HSA 制品大多通过从人源血浆中分级过滤提取。2010 年版《中国药典》所收载的 HSA 的制备方法是通过从健康人血浆中提取，经低温乙醇法或经批准的其他分离法分离纯化并经60℃10 h加温灭活病毒后制成。成品的纯度应不低于蛋白质总量的96. 0%。此方法依据的原理主要是蛋白质在不同 pH 值和不同离子强度条件下溶解度不同。

由于血浆容易受到病毒等微生物污染及来源有限等原因，一些学者开始通过基因工程来获得重组人血清白蛋白( recombinant human

rum albumin，rHSA) 。1981年，首次报道HSA 基因在大肠杆菌中成功表达，表达出的蛋白质为白蛋白的前体，在细胞内形成包涵体，但大量生产难以实现。为此，科学家们研究了以枯草芽孢杆菌作为宿主菌表达rHSA，这一系统表达的 rHSA 难以穿过细胞壁，信号肽的切除率随表达量增加而减少，因而也难以作为大规模生产的工程菌。酵母作为真核生物，能够对蛋白质进行翻译后修饰，有利于蛋白质的正确折叠。研究者利用酿酒酵母、克鲁维氏酵母、毕赤酵母、汉逊酵母等作为宿主菌，结果发现，以毕赤酵母为表达系统可高表达rHSA。除此以外，还有利用蚕、马铃薯、猪等作为表达系统的，但是分泌的rHSA过少或同源性不好。目前，已经工业化生产rHSA的公司有日本的三菱公司、英国的 Novozymes公司美国的Genetech公司等。在国内，第一个获得 rHSA 生产方法国家发明专利的是中山海济医药生物工程有限公司，HSA表达量为3. 5 g/L左右。华北制药有限公司的“发酵生产重组人血清白蛋白的方法”在之后也获得了国家发明专利，正在进一步开发。武汉大学杨代常教授利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产rHSA，每 1

kg 种子的 rHSA 量可达3 g以上。由于HSA 是由肝细胞分泌的，还有人研究了利用肝细胞培养获得HSA，这也是继分级提取和基因工程以外的第三种获取HSA的方法，但能否在将来获得工业生产的应用还需进一步研究。

值得一提的是，由武汉大学生命科学院和武汉禾元生物科技有限公司组成的研发团队从2006年开始进行植物源替代血浆来源的医药蛋白的研究与开发，现已取得突破性进展并已跨入规模化生产的阶段，填补了国际上此项技术空白。相关论文于2011年10月31日在线发表于《美国科学院院报》（PNAS）。该研究表明由转基因水稻种子生产的重组人血清白蛋白(OsrHSA)在生理生化性质、物理结构，生物学功能、免疫原性与血浆来源的人血清白蛋白一致；并建立了大规模生产重组人血清白蛋白的生产工艺，获得了高纯度和高产量重组人血清白蛋白产品。利用大量数据证明了转基因水稻种子可取代现有基于发酵的表达技术来生产重组蛋白质是经济有效的。正如PNAS审稿人对该文章的评价：“这篇文章解决了在科学上振奋人心、在经济上都非常重要的议题－－即用转基因植物生产血浆产品或其他蛋白产品的技术平台，可代替其他基于发酵的表达技术，其重要性也不言而喻„„这篇文章近乎完美地证实了植物生产的医药蛋白和批准临床使用的血浆来源医药蛋白是完全相同的，并提供了翔实数据证明植物系统规模化容易和成本优势。” 二、研发的思路

1、整体思路

本文用巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）构建并筛选分泌重组人血清白蛋白(rHSA)基因工程高产菌株，并对其发酵产物进行纯化。

在构建高产人血清白蛋白的基因工程菌时，采用分泌型表达质粒

pPIC9K构建成质粒pPIC9K-hsa。构建的质粒经线性化后电转化整合进入毕赤酵母GS115染色体AOX1基因中，通过MD/MM平板筛选出his+Muts型菌株。在此基础上，用G418平板筛选出高拷贝表达子。BMGY/BMMY 摇瓶培养对不同的拷贝子进行筛选，用免疫印迹检测所表达的 rHSA 是否具有免疫原性。采用工业基础盐培养基，在摇瓶中进行发酵生产。

rHSA 的纯化路线为：离心后上清液经60℃处理8h对蛋白酶灭活，冷至常温时离心除去热处理的变性蛋白；再经透析袋脱盐交换缓冲液，使得其条件为0.005mol/L，pH6.4的磷酸钠缓冲液；再将其上平衡后的DEAE Sephro FF阴离子交换柱然后以0.010mol/L，pH8.0的磷酸钠缓冲液加以0.10 mol/L，0.20mol/LNaCl浓度进行梯度洗脱。

2、研发流程：

基因重组途径：选择人血清白蛋白基因→选择合适的表达体系→构建重组表达载体→转入高效表达载体中表达→发酵→粗提→纯化→加工→成品 3、巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的一般步骤

巴斯德毕赤酵母自80年代初被开发为外源蛋白表达系统以来一直被广泛应用，一些重组蛋白已成为正式产品进入了市场。至今已有

300多种外源蛋白在该表达系统中成功表达，已报道的最高表达量分别为22g/L(胞内)和14.8g/L(分泌)。在巴斯德毕赤酵母中表达蛋白的步骤比大肠杆菌要复杂得多。一般的步骤为：

(1)目的基因的克隆 选用合适的内切酶把外源基因克隆于表达载体的多克隆位点区，如果选用的是分泌型表达载体，则外源基因的阅读框架和信号肽的阅读框架应该保持一致。

(2)重组载体线性化 重组载体只有被线性化，整合效率才能大大提高，环状质粒整合效率是很低的。

(3)转化 一般选用原生质球法或电击法。

(4)筛选 可先利用载体和营养缺陷型菌株的互补性或对抗生素的抗性来进行初筛，复筛可用多聚链式反应(PCR)。对于大量转化子的筛选，可用原位点杂交法进行。用原位点杂交不仅可以筛选大量转化子，还可以鉴定多拷贝。

(5)外源蛋白的表达 如果表达载体的启动子是组成型启动子，则表达比较简单；如果载体的启动子是醇诱导型启动子，则外源蛋白的表达分为2步，即菌体生长和蛋白诱导表达。

(6)放大 表达的条件(如通气状况，pH 值，培养基的组成等)，经优化以后就可以按比例放大，从摇瓶培养转至大规模发酵。

三、技术路线 1、巴斯德毕赤酵母表达系统的优点

巴斯德毕赤酵母表达体系是近十年发展起来的真核表达体系。作为一种成功的表达体系，有好几种因素促进了它的快速推广。主要包括如下几方面：(1)利用受甲醇诱导的醇氧化酶(alcohol oxida I，AOX1)启动子，可严格控制外源基因的表达。(2)毕赤酵母属于单细胞微生物，保留了细菌的特点，营养要求简单，生长快速，适合高密度培养，发酵后每升培养液中细胞干重可达100克以上，有利于提高目的蛋白产量；发酵技术也比较成熟，具有大规模生产基因工程产品的潜力。(3)酵母是低等真核生物，很少产生有毒物质，毒性比细菌小。(4)毕赤酵母作为一种真核细胞生物，具有真核生物的亚细胞结构，可进行很多典型的高等真核生物的蛋白翻译后加工修饰，如糖基化、脂酞化、磷酸化以及蛋白裂解、折叠、二硫键的形成等。(5)毕赤酵母分子生物学操作技术与酿酒酵母

siae非常相似，而后者的遗传背景和生理特性研究得比较透彻，是现代生物学中了解较清楚、应用很广泛的表达系统之一，因而可为前者提供很多借鉴；另外，毕赤酵母也已有20多年的研究开发历史，有多种受体菌和表达载体可供选择，可以进行胞内表达或分泌表达。（6）产物易于纯化，特别是高分泌性的外源蛋白占所有被分泌蛋白的30%以上，容易分离。

2、表达载体的整合及其优化

（1）宿主菌的表型及载体的整合

重组载体转化进入毕赤酵母受体菌一般整合在染色体上，因而整合十分稳定。常见得整合方式有两种，即单交换型和双交换型两种方式。载体整合位点包括AOX1和HIS4，也即涉及到甲醇利用表型（Mut）问题。表达菌株的甲醇利用表型与表达盒的染色体整合位点和方式通过一种或两种AOX基因的删除插入或替代。根据利用甲醇的能力，毕赤酵母宿主菌可划分为3种表型。最广泛使用

的菌株GS115(HIS4)含有野生型AOX1和AOX2基因，利用甲醇的表型为Mut+。KM71(HIS4，AOX1ΔARG4)菌株的AOX1基因大部分被删除和取代，它必须依赖表达很弱的AOX2基因，故利用甲醇表型为Muts。MC-100-3(HIS4，AOX1ΔARG4，AOX2ΔPHIS4)的两种 AOX 基因均被删除，表型为Mut-。这3种宿主菌都保留了利用来自载体的AOX1启动子诱导表达外源基因的能力。在毕赤酵母中一般通过同源重组稳定整合于染色体的AOX1区或 HIS4

区。整合方式上，AOX1 区的整合包括同源双交换引起的基因置换和位点特异性单交换引起的基因插入。前者使染色体 AOX1 基因被外源基因表达盒替换，Mut+表型菌株会转变为Muts或Mut-，而 Muts和 Mut-菌株表型不变；后者即单交换引起基因插入不改变宿主原有的AOX1基因，故各种菌株的Mut表型不变。HIS4区的整合方式为位点特异性单交换。表达载体向 HIS4区或 AOX1区的整合赋予宿主菌野生型组氨醇脱氢酶基因，使其表型由 HIS-变为HIS+，可以此筛选转化子。Mut+菌株已经成功地表达了很多蛋白(如表皮生长因子、胰岛素样生长因子等)。Muts菌株虽然在诱导阶段生长缓慢，但有时外源蛋白的表达反而更高，更有利于蛋白的正确折叠。如PepT1的表达在 Muts菌株中较高。应该说，Mut+和Muts表型的菌株各有优缺点，关键由外源蛋白而定。总之，很难预见某种外源蛋白在哪种Mut表型的菌株中表达水平更高，故建议考察各种Mut表型菌株中的表达情况，经验性地选择适于特定外源蛋白表达的株型。原则上，对于胞内表达应尽量选用非Mut+菌株，使蛋白产物中AOX蛋白量较少，而目的蛋白相对较多，这样更有利于简化下游的纯化。胞外表达采用Muts菌株，但这些菌株利用甲醇能力低，生长缓慢，可添加其它碳源(如甘油、山梨醇、丙氨酸等)来加快细胞的生长和代谢，提高目的蛋白产率。

虽然AOX2和AOX1基因的序列同源性高达92%，但AOX2基因表达产物在正常细胞中仅占总酶量的5%。这样就使细胞利用甲醇的能力大大下降，从而使表达量下降且延长了细胞发酵时间(150～200h)。为了克服这一缺点，研究者通过分离选择恢复利用甲醇能力的自发突变体，从AOX1基因缺陷菌株中分离得到Mut+

的自发突变体。他们对突变体的AOX2基因上游区域经PCR扩增产物测序，确定了该突变体在-255和-259两个位置的碱基发生了改变，而这两个位置为阻遏蛋白结合区域。该区域发生点突变后阻遏蛋白便不能很好地与之结合，通过去阻遏作用使得转录效率增强，从而提高表达量和缩短发酵时间。

（2）多拷贝整合及筛选

获得多拷贝重组子的方法主要有：(a)在体外利用同尾酶向载体中多次插入首尾相连的表达盒。此法的优点是一次整合，即可有多个表达盒插入染色体。但体外基因操作较繁琐。(b)根据G418抗性水平与kanr拷贝数的正相关性，筛选到高拷贝重组子。(c)利用含细菌Sh ble基因的表达载体，根据Zeocin抗性水平与ble基因拷贝数的正相关性，筛选到高拷贝重组子。ble基因很小(375bp)，可兼作 E.

coli和P. pastoris的筛选标志，故载体很小(仅3Kb)，易操作。但

Zeocin是一种诱变剂，有引起转化子突变的可能。利用抗药性水平获得高拷贝重组子的方法简单快速。但相当大的一部分高抗性转化子不含多拷贝基因。故在（b）、（c）方法的基础上，需进一步筛选确定真正的高拷贝高表达重组子。(d)利用 DNA分析方法检测外源

DNA含量，此法更为直接快捷，但应辅以前述方法以降低工作量，提高筛选效率。(e)选择单交换整合方式以有利于形成多拷贝重组子。位点特异性单交换引起的多拷贝基因插入比在两个独立单位点发生双交换产生多拷贝基因的概率高，大约为1%～10%。(f) 使用原生质法、电激法以提高形成高拷贝转化子的频率。巴斯德毕赤酵母的转化方法有原生质法、电激法、氯化锂法等，其中以原生质法转化使细胞群中产生的多拷贝转化子频率相对较高，但若使用

G418检测拷贝数，则配合电激法转化的效果较好。

由于高拷贝并非意味着高表达，即基因拷贝数与表达水平的关系取决于特定的外源蛋白。所以在获得多拷贝重组子的基础上，要进一步筛选确定因具有合适拷贝数而显示最佳蛋白表达水平的菌株，亦即高表达菌株的筛选应以表达的蛋白量为最终标准。传统的方法是利用 SDS-PAGE 电泳直接分析蛋白表达检测高表达转化子。最近出现的方法有菌落免疫印迹和活性分析等方法检测到高表达转化子。菌落免疫印迹的过程为：首先将菌落转至醋酸纤维素膜上，再与硝酸纤维素膜叠放在酵母固体培养基上，经过一段时间培养后分泌蛋白就印在硝酸纤维素膜上，接着用此蛋白的抗体检测，即可挑出最高蛋白量对应的克隆。用这种方法，每套滤膜可筛选出

100~1000个克隆，从而快速地从大量重组子中筛选出高表达克隆。

3、培养条件

培养条件主要包括培养基、通气量、pH、甲醇含量和培养时间等。P. pastoris常见培养基的配制及使用见Invitrogen公司的P.

pastoris express kit。另外，由于表达不同的蛋白和提高表达蛋白的产量及活性，还常使用其它不同的培养基。如防止人血清白蛋白降解的 PBM 及 PFM 培养基，用于高密度培养的补料培养基FM21等。

充足的通气量对于诱导阶段外源蛋白的表达极其重要。充足的氧气是巴斯德毕赤酵母高效表达所必需的，一般要求溶氧（DO）最好处在 30%~60%之间。当DO 过低时，P. pastoris 便会产生乙醇或乙酸，抑制外源蛋白的表达。然而随着生物量的增加，转速和通气量增加到一定的限度时便需要掺入氧气甚至完全通入氧气以维持所需的DO值。另外，利用机械装置微沫发生器可以使通入的空气或氧气生成很小的微沫。从而有效的增加 DO 值和氧气对酵母细胞的传质系数。利用该装置的结果可以使搅拌转速降低约一倍左右，因而对大型发酵设备来讲有更好的应用价值。在摇瓶培养时，为了增加溶氧，发展了一种SCM摇瓶技术，这种摇瓶技术培养条件比普通摇瓶发酵更接近于发酵罐发酵，可以使外源蛋白的表达比普通摇瓶发酵提高2.6~10倍。这对于重组转化子的筛选具有较强的指导意义，因为不同的转化子在摇瓶和发酵罐发酵时可能不同。

P. pastoris 适宜生长的pH为3.0~7.0，根据需要可以选择不同的pH

值。一般诱导表达时pH为6.0，生长期pH为5.0。有时为了在生长初期防止染菌，一般采取较低的pH进行发酵。另外，为了防止表达蛋白的降解，可以降低或者升高培养时的pH。对于培养时甲醇的含量，不同的表型甲醇的利用速率不同，一般的经验是甲醇含量不超过5g/L时不会对毕赤酵母细胞造成毒害。在诱导时，一般都要经过一个甲醇利用适应期，随后进入甲醇快速的稳定期。对甲醇流加量的控制最好是通过在线检测来实现。另外对于不同的蛋白，也可离线检测甲醇含量建立甲醇利用模型来指导甲醇流加，有时还可以根据溶氧的变化来改变甲醇的流加量，但这不能做到完全精确，容易造成甲醇过量。

巴斯德毕赤酵母的发酵周期一般长达140~200h。一般的成批培养可分为四个阶段，即初期培养阶段，增加生物量的甘油流加或与基础盐共同流加阶段，甲醇诱导阶段，甲醇和其它碳源如甘油山梨醇等的共同诱导阶段。其中，甘油流加或与基础盐混合流加可使生物量大大增加，但生物量越大，培养基中的氧和营养供给就越受限制，因而不一定有利于外源蛋白的表达，如发生蛋白质的过量水解等问题，所以是否需要高生物量有赖于所要表达的外源蛋白的性质(如溶解度、稳定性、毒性等)。另外，甲醇和甘油等碳源混合流加可使有些表达菌株代谢更活跃，合成蛋白更迅速。

4、提高产物稳定性

提高目的蛋白稳定性，使之免受蛋白酶降解的常用的 5 种策略如下：一是在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物等，增加蛋白酶的底物以减少目的蛋白降解。二是因 P. pastoris

可在较宽的 pH 范围内生存，调节培养基 PH 值抑制蛋白酶活性。三是降低甲醇诱导时的培养温度。四是发酵时控制一定的比生长速率或利用连续培养的发酵方式。五是使用蛋白酶缺陷菌株，如

SMD1163、SMD116和SMD1168。但这些菌株活性差，生长慢

且难转化，所以只有在其他方法不能奏效时才推荐使用。此外，可通过共表达蛋白酶抑制物来抑制蛋白酶活性，减少目的蛋白降解；可将目的蛋白与一种在 is 中稳定的蛋白伴侣融合表达，通过改变目的蛋白的性质来提高稳定性；也可尝试将目的蛋白连上一个过氧化物酶体靶向信号(peroxisomal targetingsignal，PTS)，使其被分拣转运入过氧化物酶体贮存起来，免受蛋白酶降解，还可减少对宿主细胞的毒害作用。

5、人血清白蛋白的分离纯化

实现医药级 rHSA 的工业化生产对重组蛋白的分离纯化技术是个极具挑战性的课题。因为：(1)产品对纯度要求极高。99.999%的纯度对于一般的重组蛋白来说已经足够，但由于白蛋白药业的剂量较大，因而任何痕量的杂蛋白均可能造成严重的免疫反应。目前日本 Green Cross 公司的产品达到 99.999999%的纯度。(2)血源HSA单位价格相对其它血蛋白较低，市场售价约40元/克。因而只有在高

表达的基础上降低rHSA的单位分离成本，才能取代传统的提取方法。因此rHSA的分离纯化是目前工业化生产中的关键问题。

5.1重组 rHSA 分离体系特点

rHSA 分离要求高，对发酵液来讲，以下几个方面又增加了 rHSA

分离纯化的难度：（1）含量少。目的产物在起始培养基中含量较低，一般在 3g/L 左右。（2）组成复杂。除目标产物外，还含有细胞代谢产物、残留培养基成分、无机盐成分，菌体细胞组分及其分泌物，如蛋白酶、杂蛋白、核酸、脂肪酸、色素、多糖及热原物质等。（3）产物稳定性差。血清白蛋白在蛋白酶作用下极易降解。

5.2 rHSA 分离方法的进展及现状

传统的从血浆中分离人血清白蛋白的主要以沉淀法为主，如 Cohn

的乙醇沉淀法仍然应用于人血清白蛋白的分离纯化中。后来又出现了色谱分离法。乙醇沉淀法的优点是过程简单，杀菌和去病毒，缺点是产生非特异性沉淀，使蛋白质产生聚集和变性。色谱法的生产的 HSA 的优点是纯度、产量、单体含量均高于冷乙醇沉淀法，生产条件温和，生产周期较短，可以进行封闭式生产并能实现流程自动化。但单纯采用色谱法难以有效地抑制或除去热原，HIV 等病毒，产品的安全性为人们所担忧。近期发展的色谱与冷乙醇沉淀相结合的方法，使二者优势互补，应用于 HSA 生产后效果显著，其中澳大利亚 CSL 公司就是成功的例子。rHSA 的分离纯化是建立在传统分离的方法的基础上的，应用新发展的分离技术及设备得到符合药用要求的产品。总的思路是先粗分离，以除去最主要的杂

质并缩小处理体积；后细分离，除去特异性的杂质，得到合格的产品。常用的方法有沉淀、超滤、吸附、热处理、层析等。表一是 rHSA

的分离方法之一。典型的纯化方法及目的如表二所示

表一、rHSA 纯化典型范例

表二、rHSA 分离纯化方法之一 还可以用STREAMLINE纯化方法：发酵液于68℃热处理灭活蛋白酶后进行阳离子扩张床吸附得到较纯的rHSA，再60℃热处理，脱色，Phenyl cellulorine疏水层析除杂蛋白，再经螯合树脂吸附、阴离子交换、超滤后即得到纯rHSA。应用STREAMLINE扩张床阳离子吸附的优点是一步分离杂质，直接获得目标产物，酵母细胞及其它杂质直接通过。该方法将固液分离、吸附、浓缩集成耦合在一起，不但大大简化了操作步骤，将生产周期从原来的7天缩短为4天；而且使收率提高约60%；另外，STREAMLINE还可与发酵罐直接相连，在封闭的情况下去除重组微生物，避免微生物的污染。

参考文献

[1] 赵颖怡，汪嵘，韦宇拓，董燕，甘凤琼；人血清白蛋白的研究进展,广西农业生物科学2002(21)2:126-128

[2] 陈冠荣，化工百科全书，北京，化学工业出版社，1999

[3] 章如安，杨晟，邱荣德，袁中一，巴斯德毕赤酵母表达体系研究及进展，微生物学通报，2000，27(5)：371－373

[4] 丁云菲，刘勇，戴长柏，巴斯德毕赤酵母研究进展，生命科学，2003，15（1）：26~30

[5]郭美锦，储炬，杭海峰，庄英萍，叶勤，张嗣良，重组人血清白蛋白表达研究进展，生物工程进展，2000，20（5）：39-42

[6]刘永东，王云山，苏志国，重组人血清白蛋白生产工艺研究进展，微生物学通报，2003，

30(5)：128-132

[7]路秀玲，苏志国，人血清白蛋白纯化技术研究进展，生物工程学报，2002，18（6）：761-765

[8] 苑隆国，重组人血清白蛋白的纯化工艺，沈阳药科大学硕士学位论文，沈阳，沈阳药

科大学，2001 年

[9] 陈光明,周长林,魏元刚,赵明龙. 发酵液中重组人血清白蛋白的纯化[J]. 药物生物技术. 2003(01)

[10] 路秀玲,苏志国. 人血清白蛋白纯化技术研究进展[J]. 生物工程学报. 2002(06)

[11] 殷艺伟,陈建华. 重组人血清白蛋白的药学应用研究进展[J]. 药学进展. 2006(02)

[12] 满初日嘎,张英霞,张云. 重组人血清白蛋白的研究进展[J]. 生物医学工程学杂志.

2009(04)

[13] 李志龙,张富春. 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展[J]. 生物技术通报. 2006(06)

[14] 龙娟,薛冲,赵洪亮,杨晓红,刘志敏. 人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达[J]. 生物技术通讯. 2008(04)

[15] 朱书峰,张莲芬,陈蕴,储敏,李英,金坚. 重组人血清白蛋白-hGCSF突变体在毕赤酵母中的表达[J]. 中国生化药物杂志. 2008(05)

[16] 邱荣德,李士云,陈俊刚,吴祥甫,袁中一. 重组人血清白蛋白在Pichia pastoris中的表达与纯化[J]. 生物化学与生物物理学报. 2000(01)

[17]欧阳立明, 张惠展, 张嗣良, 刘志敏, 巴斯德毕赤酵母的基因表达系统研究进展, 生物化学与生物物理进展，2000, 27（2）, 151-154

[18]郑敏，张飞雄，刘丽，酵母表达系统表达外源基因的研究进展，首都师范大学学报（自然科学版），1999，20（4），73-78

[19] 周立，蒋磊，郑远旗，李建吾，魔芋葡苷聚糖（KGM）凝胶作为亲和层析载体与

Sepharo的比较研究 II KGM 染料亲和层析分离人血清白蛋白，天然产物研究与开发，2000,12(2), 23-26

[20]苏志国，姜炜，冯朴荪，高昆玉，染料配基吸附层析纯化血清白蛋白，生物工程学报，1991,7(2), 161-168

[21]朱振齐,刘进,马大龙,等.人重组GM-CSF/HAS-D3嵌合蛋白(GM-HSA)在大肠杆菌中的表达及其产物稳定性的研究[J].生物化学杂志,1996,12(3):284-2881

[22]曾令娥,黄晶,白惠卿,等.重组Klenow-HSA融合蛋白的构建、纯化及其稳定性[J].北京大学学报:医学版,2002,34(6):684-6871

[23]王鸿利.血架和血楽蛋白制品的临床应用[M].上海:科学技术文献出版社,2002:52-54.

附录

试验操作及方法

1、质粒的提取及扩增

1.1质粒的提取

·将含有质粒 pPIC9K-hsa 的菌种接种在 10ml 含氨苄青霉素（AMP，浓度

100μg/ml）的 2×YT 培养基中，37℃过夜培养；

·将发酵液倒入离心管中，5000rpm×10min 离心收集菌体。倒出培养液，尽可能清除残余液体；

·将细菌沉淀重悬于 100μl 用冰预冷的溶液Ⅰ中，加入 5μl 溶菌酶溶液（4mg/ml）剧烈震荡，使细菌沉淀完全分散（溶菌酶也可省略）；溶液Ⅰ：50mM

葡萄糖，25mM Tris-HCl(PH8.0)，10mM EDTA(PH8.0)

·加入 200μl 新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，迅速颠倒离心管数次以混匀内容物，将离心管放置于冰上 10min；溶液Ⅱ：0.2 mM NaOH(临用前用 10M 储存液稀释)，1％SDS

·加入 150μl 用冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，迅速倒置后温和地振荡 10c

以混匀内容物，然后将离心管放置于冰上 3~5min；

溶液Ⅲ：向 60ml 乙酸钾溶液（5M）中加入 11.5ml 冰乙酸和 28.5ml 水

·台式离心机离心 12000rpm×5min，取出上清移至另一离心管中，弃去管底沉淀； ·向上清液中加入等体积的 Tris 饱和酚、氯仿，振荡混匀。离心 12000rpm×5min，取上清转移到另一离心管中，弃去界面及下相；

·再加入等体积氯仿/异戊醇混合液（24：1），混匀后离心 12000rpm×5min，取上相；

·加入 2 倍体积冷无水乙醇，轻轻混匀，放入－20℃冰箱沉淀双链 DNA；

·10min 后离心 12000rpm×15min；

·小心吸去上清，将离心管倒置于吸水纸上，使所有液体流出，再将附于管壁的液滴除尽；

·用 1ml70％乙醇洗涤 DNA 沉淀，离心 12000rpm×15min，弃上清；

·室温下放置 10min 以使乙醇完全挥发，加入 20μl 1×TE 或无菌双蒸水溶解DNA，储存于－20℃冰箱备用。

注意事项：NaOH，Tris 饱和酚与氯仿均为强腐蚀性化学试剂，切勿沾到皮肤、

衣物上；若有沾染，立即用大量自来水冲洗。

1.2质粒的扩增

(1) 感受态 JM109 细胞的制备

·从LB平板上挑取JM109单菌落接种于5ml 2×YT液体培养基中，37℃剧烈振荡过夜培养；

·取50μl过夜培养基接种至一有2ml 2×YT培养基的试管内，37℃振荡培养；

·2小时后停止培养，对光旋转，可看到雾状线。从中取出 50μl 再次接种至另

一 2ml 2×YT 培养基中，37℃振荡培养；

·3小时左右对光旋转，可见试管内雾状线，在无菌条件下，将培养液转移到一个无菌的、用冰预冷的离心管中，在冰上放置10min，使培养液冷却至0℃；

·离心 7000rpm×5min，回收细胞，倒出培养液，将离心管倒置 1min 以使最后残留的痕量培养液流尽；

·向菌体中加入 0.6ml 预冷的 50mM CaCl2溶液，打散菌体，充分洗涤，离心7000rpm×5min，弃上清，收集菌体；

·向菌体中加入 0.2ml 预冷的 CaCl2、甘油溶液（50mM CaCl2，15％甘油），重悬菌体于溶液中，用封口膜封口后放入 4℃冰箱冷藏 12~20 小时。

(2) 转化

·将 pPIC9K-hsa 加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物，4℃冰箱放置 30min 以上；

·42℃ 热激 2min，切勿摇动离心管，快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2min；

·向管中加入 1ml 2×YT 培养基，37℃水浴培养 1 小时，使细胞复苏；

·离心 7000rpm×5min，无菌条件下弃去大部分上清，保留约 200μl 左右的培养液；

·悬浮细胞，无菌状态下将菌液转移到含有Amp（100μg/ml）的 2×YT 平板上，均匀涂板；

·在超净台上放置大约15min，待液体被吸收后倒置平皿，37℃恒温培养12~16小时。

·待平板上菌落长出后，挑取单菌落于含氨苄青霉素（AMP，浓度 100μg/ml）

的 LB 液体培养基中， 37℃过夜培养后收集菌体进行质粒提取。将提取所得纯化质粒溶于 20μl 双蒸水中，取 4μl 用 0.5％琼脂糖凝胶进行检验。 注意事项：以上各步操作均需无菌操作。

1.3 pPIC9K-hsa 的线性化

pPIC9K-hsa BglⅡ 10×H buffer ddH2O 合计

结晶约5μg 1.5μl 3μl 25.5μl 50μl

1.4 pPIC9K-hsa 质粒检验与纯度浓度的测定

质粒 pPIC9K-hsa 的大小由 0.5％琼脂糖电泳检验，溴化乙锭染色，荧光分析；

质粒的序列验证委托测序公司进行测序。质粒pPIC9K-hsa浓度及纯度测定方法为：取pPIC9K-hsa 质粒溶液10μl用蒸馏水稀释到 4ml，UV3000扫描（200~340nm），分别读取260nm与280nm 的吸收值A260与A280A260/ A280的比值可确定质粒纯度。

2、重组工程菌 GS115-HSA 的构建及筛选

2.1 GS115感受态制备及电穿孔转化

菌体的准备：

·挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的25ml三角瓶中，30℃、

250~300r/min 培养过夜；

·取100~500µl的培养物接种至含有50ml新鲜培养基的500ml三角摇瓶中，28~30℃、250~300r/min 培养过夜，至 OD600 达到 1.3~1.5；

·将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用50ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；

·1500 rpm×5min 离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；

·1500 rpm×5min 离心，用2ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；

·1500rpm×5min 离心，用0.1ml 用冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为0.2ml；提示：可将其分装为 80µl一份的包装冷冻起来，但会影响其转化效率。

电击转化：

·将1~5µg的线性化DNA溶解在 5~10µl TE 溶液中，与80µl的上述步骤6所得的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中；

·将电转化杯冰浴5min；

·根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击；

·电击完毕后，加入1ml冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体混匀，转至 1.5ml的EP管中；

·将菌体悬液涂布于MD平板上，每200~600µl涂布一块平板；

·将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现。

推荐：电压1.5kV；电容25µF；电阻400Ω。电击时间为4~10mc。

注意事项：以上各步操作均需无菌操作，所用离心管与电转杯都要提前灭菌。

2.2 筛选 his+Muts阳性克隆

·GS115菌株为 his－，在不含组氨酸的培养基上无法生长，因此能在MD平板上长出的克隆即为 his+克隆；

·用灭过菌的牙签将每个克隆同时点种于MM、MD平板的对应位置上30℃培养 3~6 天；

·两平板上菌落均会有所生长，只有 MM 平板上的菌落大小远小于 MD 平板上相应菌落的菌株才是 Muts表型；

注意事项：因筛选过程中 MD 和 MM 平板的培养时间较长，铺平板时要略厚一些，以免培养过程中出现培养基脱水缩皱现象。

2.3 G418 筛选高拷贝转化子

将获得的 His+Muts转化子分别用牙签点种于不同浓度的 G418 平板，30℃培养 3~6 天。根据各克隆耐受不同浓度 G418 的情况，可以选出含有不同拷贝数的转化子。

3 重组工程菌 GS115-HSA 的诱导表达实验

·挑选一经 MD/MM 筛选的单菌落，置于装有25ml BMGY培养基的 250ml

摇瓶中，于 28~30°C/250~300 rpm 培养至 OD600 = 2~8 (16~18 h)；

·室温下1500~3000g 离心 5min，收集菌体，用1/5原培养体积BMMY重悬菌体

· 将步骤 2 所得的菌液置于 25ml的摇瓶中，用8层纱布封口，放置于28~30℃/250~300 rpm 的摇床上继续生长；

·每24h 向培养基中添加50×M至甲醇终浓度为0.5%；

·按时间点分别取菌液样品，取样量为0.5ml，置于1.5ml EP 管中，最大转速离心2~3min，收集上清，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取：24、48、72、96 和 120h；

·分离样品的上清液加至终浓度为 1mM 的 PMSF 于-20°C 保存，备用于

SDS-PAGE、Western-Blot 活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。

4 、rHSA 的 SDS-PAGE 分析及免疫印迹检测

4.1 Tricine-SDS-PAGE 凝胶电泳

Tricine-SDS-PAGE 凝胶电泳进行 rHSA 的检测。

(1) 各种溶液的配制

阳极缓冲液：200mM Tris-HCl，PH8.9

Tris：96.8g

HCl（2M）：185ml

加水至 4 升，调节 PH 至 8.9

阴极缓冲液：100mM Tris，100mM Tricine，0.1％SDS，PH8.25

Tris： 12.1g

Tricine：17.9g

SDS： 1.0g

加水至 1 升

凝胶缓冲液：3M Tris-HCl，0.3％SDS，PH8.45

Tris： 36.3g

HCl（2M）：50ml

SDS：300mg

加水至 100ml，调节 PH 至 8.45

母液 1：30％T，3％C

Acrylamide： 28.1g Bisacrylamide：0.9g

加水至 100ml，4℃下保存

固定液：40％methanol，10％acetic acid

methanol： 400ml

acetic acid：100ml

加入 500ml 水摇匀

Coomassie blue 染色液：Coomassie blue 0.025％

Acetic acid： 100ml

Coomassie blue： 0.25g

Deionized water： 900ml

脱色液：acetic acid 10%

Acetic acid： 100ml

Deionized water 900ml

样品液：

0.5M Tris-HCl(PH6.8)： 2.0ml

Glycerol： 2.4ml

10%SDS： 1.0ml

β-mercaptoethanol： 0.2ml

0.5% Coomassie blue： 0.4ml

Deionized water： 4.0ml

(2) 制胶

·彻底清洗玻璃板（洗涤灵擦洗、自来水冲洗、蒸馏水冲洗、无水乙醇擦洗），

在两玻璃板间放置涂有少许凡士林的硅化橡胶条，两边用夹子夹住；

·在玻璃板外侧用记号笔标出灌注 parate gel 溶液所要达到的刻度；

·首先灌注 parate gel 至刻度 1 处，小心地在上面覆盖一层水，室温下凝聚；

parate gel：10％T 3％C

母液 1 凝胶缓冲液 60%甘油 TEMED 1.55％过硫酸铵

1.5ml 1.5ml 1.25ml 5μl 250μl

·凝聚后用小滤纸条吸去表面的水分，插入梳板，配制 stacking gel 溶液，摇匀后灌注在 spacer gel 上面，室温下静置 1 小时；

stacking gel：4％T 3％C

母液 1 凝胶缓冲液 TEMED 1.55％过硫酸铵 去离子水

0.4ml 0.75ml 3μl 150μl 1.70ml

·将凝聚好的胶板小心的拔出顶部梳条，并去掉底部边条，用滤纸条擦干净底部的凡士林。

备注：以上各种凝胶的配比适用于 15×10×0.15cm 垂直平板电泳体系。

(3) 电泳

·在凹面玻璃板一侧涂一些凡士林，使玻璃板紧贴于电泳槽，两边用夹子夹紧；

·向阳极槽中加入阳极缓冲液，阴极槽中加入阴极缓冲液；

·将待测样品与样品液按 1：1 体积比混匀后，用微量注射器加样至梳孔；

·接通电源，10mA（恒流）30－60min，然后改为 25－35mA（恒流），待指示剂移至凝胶下端时切断电源，停止电泳。 (4) 染色

·把垂直平板电泳槽上的玻璃轻轻扳开，将凝胶取下，放入固定液中 30min，固定时间最长不超过 45min；

·将凝胶放入染色液中，染色约 1 小时，染色时间最长不超过 1.5 小时；

·将凝胶移入脱色液中，每 15min 换一次脱色液，直至背景脱尽为止。

(5) 将凝胶进行照相并用 Gelpro3.1 进行分析表达量。

注意事项：Acrylamide 和 Bisacrylamide 具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，称量时应佩戴手套和面罩。室温高时，可减少过硫酸铵加入量，以免凝聚过快，界面不平。过硫酸铵会缓慢分解，隔周新鲜配制或冻存于-20℃冰箱。

4.2 免疫印迹

采用硝酸纤维素膜作为印迹用纸，硼酸钠-甲醇溶液为印迹缓冲液，

以半干式印迹法进行电转移。

各种溶液的配方及材料如下：

印迹缓冲液：50mM 硼酸钠，20％甲醇（PH9.0）

Na2B4O7·10H2O： 4.767g

Methanol： 200ml

加去离子水定容至 1 升，硼酸调 PH 至 9.0

封闭液：20mM Tris-HCl， 0.5M NaCl （pH8.0）

Tris ： 2.42g

NaCl： 29.25g

脱脂奶粉： 30g

加去离子水定容至 1000ml

清洗液：0.85％生理盐水，0.05％ Tween-20

NaCl： 8.5g

Tween-20：0.5g

加去离子水定容至 1000ml

·电泳结束前 30min 准备好大小相同的滤纸和硝酸纤维素膜（每一边伸出作为模板的凝胶约 2mm），将硝酸纤维素膜的预处理。过程为：将膜小心地放在水面上使其浸湿。通过毛细管作用从底部开始浸湿硝酸纤维素膜，时间约

4min，然后将膜浸入水中 2min，再浸入缓冲液中备用。裁剪好与膜和胶相同大小的滤纸，将其浸入缓冲液中备用。

·用去离子水清洗印迹槽，石墨电极在印迹过程之前应一直保持潮湿状态；

·在电泳结束之前 5min 准备阳极侧“三明治” ：将四、五层滤纸一层一层卷着放到阳极上，用玻璃棒滚压滤纸挤出气泡；

·将膜小心地放好，不要卷曲膜片。在凝胶放上去之前，膜是不能变干的；

·电泳结束后，将凝胶直接放在膜上面。然后在凝胶上一层一层放上四、五层滤纸。每一层都经过滚压来赶走气泡；（“三明治”不应太湿，在凝胶与膜之间不应有液体）

·用吸水纸吸一下滤纸周边的液体，关闭印迹槽，在石墨电极槽上面放置 1kg。

重物使其下沉；

·印迹条件：电流强度为 0.8mA/cm2

印迹 1.5 小时，电压限制在 100V 以内。

·停止印迹，取出印迹膜并放入封闭液中，摇晃封闭 2 小时； ·取出印迹膜放并入清洗液中，清洗 5min；

·将膜浸入一抗溶液中摇动孵育过夜。将兔抗人血清白蛋白以 1：500 的体积比与封闭液混合，即为一抗溶液。

·取出印迹膜放入清洗液中，清洗三次每次 5min 以完全洗去一抗溶液；

将膜浸入二抗溶液中摇动孵育 1 小时。将山羊抗兔 IGg 以 1：500 的体积比与封闭液混合，即为二抗溶液。

·取出印迹膜，浸入清洗液中，清洗三次每次 5min 以完全洗去二抗溶液

·将膜取出并浸入染色底物 NBT/BCIP 溶液中，摇动染色 1 小时。之后取出膜，放入去离子水中中止染色反应。将膜挂起晾干或放在几层滤纸上吸干以保存。

5、基础盐培养基发酵

5.1培养基

基础盐BSM培养基 ：CaSO4·2H2O 0.93g/L ，K2SO418.2g/L ，MgSO4·7H2O

14.9g/L，柠檬酸三钠 1.47g/L，甘油 4％（w/v），（NH4）2SO410.88g/L，PTM11ml/L，Biotin 0.00004 g/L，磷酸钾缓冲液（pH6.0）0.1mol/L。高压灭菌。

基础盐PBM培养基：甘油 40g/L，H3PO4(85%) 26.7g/L，CaSO4·2H2O 0.6g/L，K2SO49.5 g/L，Mg SO4·7H2O 7.8 g/L，KOH2.6 g/L，PTM11ml/L，Biotin 0.00004

g/L，硫胺 0.00019 g/L，浓氨水调节 pH 值为所需 pH。高压灭菌。

微量元素 PTM1配方：CuSO4·5H2O6g/L，KI0.08g/L，MnSO4·H2O3.0g/L，（NH4） 4H2O 0.2g/L ， H3BO 30.02g/L ， CaSO4· 2H2O 0.5g/L ，6Mo7O24·ZnSO4

20g/L ，98％浓H2SO4

5ml/L ， FeSO4·7H2O 65g/L ， CoCl2· 6H2O ，0.5g/L，生物素 0.2g/L。先加入浓硫酸，再加入其它盐类，过滤灭菌。

5.2发酵培养

(1) 接种 GS115-rHSA－8 保存种子液 50ul 于 5ml 的 YPD 培养基中，30℃培养16~20 小时，OD600nm值约 4~8 之间，将 5ml 的一级种子液转接到

250ml 含 20ml基础盐培养基的带挡板的摇瓶中。转速 200rpm，温度 30℃培养。

(2) 培养期间每 4 小时用 28％浓氨水调节 pH 值，精密试纸（5.4~7.0）测量使之保持在所需 pH。

(3) 约 48h 时，检测甘油含量，一般此时甘油刚好耗尽。检测甘油耗尽后，开始加入甲醇进行诱导。以后每 24 小时或 12 小时补加甲醇至所需浓度。诱导后每24 小时取样 1ml，离心收集上清液保存待检测。诱导 4 天后停止发酵，收集上清液待用。

6、rHSA的分离纯化

由于发酵上清液中 rHSA 比较容易降解，所以在发酵液进行纯化处理之前必

须对其中的蛋白酶予以灭活。灭活的方法采用热处理法。即在 60℃下对发酵

液热处理 8h。然后冷却到室温，4800r×20min 以除去热处理后变性的蛋白。经处理后的发酵上清液放入－20℃冰箱备用。

6.1 浓缩方法

6.1.1 丙酮沉淀法

(1) 取处理的发酵上清液 1 体积，缓慢加入 4 倍体积-20℃预冷的丙酮，边加边搅拌，-20℃沉淀 2 小时；

(2) 轻轻倾去丙酮溶液，收集沉淀，低温下真空干燥，收集rHSA粗品。

6.1.2 硫酸铵沉淀法

不断搅拌下向发酵上清液中缓慢的加入硫酸铵粉末，使其终浓度分别达到40%，60%，80%，并用NaOH调节pH为rHSA的等电点4.9，4℃下静止沉淀24h 后高速离心并收集沉淀。

6.2 脱盐方法

(1) 透析脱盐。将发酵上清液装入 10KD 的透析袋中，放入去离子水中或者需要下一步处理的缓冲液中，更换去离子水或缓冲液直到满意为止。

(2) 凝胶G25脱盐。将发酵上清以适当体积上样于经缓冲液平衡过的G25柱中，当上样液刚好走到柱面以下时，迅速加入平衡缓冲液高于 G25 柱面约5cm高度，尽量避免液面扰动以防影响分离效果。再将缓冲液以恒定流速通过蠕动泵洗柱，流出液经过紫外监测仪（280nm）连续测量溶液中蛋白含量，测量信号输入记录仪，记录下流出液中蛋白浓度随流出时间的变化。

6.3 离子交换树脂纯化rHSA

根据阴离子交换树脂低盐吸附，高盐洗脱的性能。再结合rHSA的等电点4.9以及各种缓冲体系的缓冲范围。这里选择磷酸钠缓冲液作为缓冲体系。将经脱盐并交换缓冲液的上清液以一定的流速通过蠕动泵流过阴离子柱，流出液经过紫外监测仪（280nm）连续测量溶液中蛋白含量，测量信号输入记录仪，记录下流出液中蛋白浓度随流出时间的变化。然后用一定浓度的磷酸钠缓冲液＋NaCl溶液将蛋白洗脱下来。

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