用GAP启动子在毕赤酵母中组成型表达重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂

2023年12月4日发(作者：高中哲学)

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第5卷 第3期

2014年3月

食品安全质量检测学报

Vol. 5

No. 3

Journal of Food Safety and Quality Mar. , 2014

用GAP启动子在毕赤酵母中组成型表达重组

猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂

曹东艳, 韩诗雯, 陈董鑫, 柳 倩, 贺晓云, 许文涛, 梅晓宏*

(中国农业大学食品科学与营养工程学院, 北京 100083)

摘 要: 目的 构建组成型表达重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂(kiwi pectin methylestera inhibitor, kwPMEI)的毕赤酵母(P. pastoris)GS115工程菌株, 探索碳源(葡萄糖、甘油、甲醇)对重组菌表达kwPMEI的影响, 纯化kwPMEI并鉴定其对番茄果胶酶的抑制活性。方法 应用PCR方法从P. pastoris GS115染色体中扩增了三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP), 以其取代诱导型表达载体pPIC9K-kwPMEI上的醇氧化酶启动子(pAOX1), 构建了组成型表达载体pGAP9K-kwPMEI, 并转化至GS115中。用Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析目的蛋白表达情况, 镍柱亲和层析纯化目的蛋白, 并用凝胶扩散方法鉴定其抑制活性。结果 重组毕赤酵母工程菌株成功组成型表达了kwPMEI, 48 h即达到最大表达水平, 表达量约为66 mg/L。并且以甘油为碳源时kwPMEI表达量最高。成功分离纯化了kwPMEI, 并经凝胶扩散方法检测表明其具有抑制活性。结论 成功构建了组成型分泌表达kwPMEI的毕赤酵母菌株, 为kwPMEI在果蔬汁中的进一步应用奠定了基础。

关键词: 组成型表达; 三磷酸甘油醛脱氢酶启动子; 猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂; 碳源; 毕赤酵母

Constitutive expression of kiwi pectin methylestera inhibitor in

Pichia pastoris using the GAP promoter

CAO Dong-Yan, HAN Shi-Wen, CHEN Dong-Xin, LIU Qian, HE Xiao-Yun,

XU Wen-Tao, MEI Xiao-Hong*

(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

ABSTRACT:

Objectives To construct P. pastoris strains GS115 which can constitutively express recombi-nant kiwi pectin methylestera inhibitor (kwPMEI) and to explore the effect of carbon source (gluco, glycerol

and methanol) on the expression of kwPMEI, purify kwPMEI, and identify its inhibitory capacity to the tomato

PME. Methods The GAP gene promoter was amplified from P. pastoris GS115 using PCR, and ud to replace

the AOX1 promoter (pAOX1) on pPIC9K-kwPMEI, resulting in plasmid pGAP9K-kwPMEI, which was sub-quently transformed into P. pastoris GS115. KwPMEI was identified by Tricine-SDS-PAGE and Western blot, and

purified by nickel affinity chromatography. The inhibitory capacity of kwPMEI was verified with a gel diffusion

assay. Results The combinant P. pastoris strain constitutively expresd kwPMEI successfully, and the peak

concentration of kwPMEI (66 mg/L) was obtained only after a 48-h fermentation. In addition, glycerol was the

best carbon source for producing kwPMEI. Finally, KwPMEI was successfully purified, and it showed an inhi-bitory capacity by gel diffusion assay. Conclusion The P. pastoris strains constitutively expressing kwPMEI were

*通讯作者: 梅晓宏, 副教授, 主要研究方向为食品生物技术及转基因食品的安全性研究。E-mail: xhmei0719@

*Corresponding author: MEI Xiao-Hong, Associate Professor, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural Un-iversary, No.17, Qinghua East Road, Haidian District, Beijing 100083, China. E-mail:xhmei0719@ 第3期 曹东艳, 等: 用GAP启动子在毕赤酵母中组成型表达重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂 965

constructed successfully, which built up the foundation for the further application of kwPMEI in juice industry.

KEY WORDS:

constitutive expression; GAP promoter; kiwi pectin methylestera inhibitor; carbon source;

P. pastoris

1 引 言

天然的新鲜果蔬汁一般会呈现出均一稳定、分散良好的浑浊态。浑浊态在保持果蔬汁的颜色、风味及质地等感官品质方面有着非常重要的作用, 但是, 随着时间的延长, 果蔬汁往往会发生浑浊态消失的现象, 这主要是由于植物内源性果胶甲酯酶(PME)对果胶的脱甲酯化作用而造成的[1]。而果胶甲酯酶抑制剂(PMEI)对PME有很强的抑制活性, 可有效解决浑浊态消失问题。但是直接从植物中提取PMEI产量很低,

而利用毕赤酵母表达系统就可大量生产重组PMEI,

以满足果蔬汁加工业发展的需要。

毕赤酵母表达系统具有很多优点, 是目前应用最为广泛的外源基因表达系统之一[2]。截止到2005年, 已有500多个基因在毕赤酵母中成功表达[3]。pAOX1作为一种诱导型启动子[4], 其构成的毕赤酵母诱导型表达系统只有以甲醇作为唯一碳源时, 才能表达和分泌外源蛋白。但是甲醇是一种有毒的物质,

并且在大规模生产过程中易燃、易爆, 很不安全。除此之外, 在高密度发酵过程中, 把碳源从甘油更换到甲醇也很不方便。最近十几年来, 科学家们一直致力于寻找新的组成型启动子来替代pAOX1。1997年,

Waterham等[5]首次发现并分离了pGAP。自此以后,

揭开了用pGAP构成的组成型表达系统表达外源蛋白的新篇章。该组成型表达系统不需要把碳源从甘油更换到甲醇, 因此避免了储藏和运输甲醇的花费和危害, 更适合大规模生产外源蛋白。除此之外, 该表达系统相对于诱导型表达系统大大缩短了发酵周期,

提高了生产率。

梅晓宏等[6]利用毕赤酵母pAOX1系统首次诱导表达了猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂(kwPMEI), 但是应用毕赤酵母组成型分泌表达kwPMEI的研究, 国内外尚未见报道。本文首次构建了组成型分泌表达kwPMEI的毕赤酵母表达菌株, 在pGAP调控下, 成功组成型分泌表达了kwPMEI, 促进了其在果蔬汁加工业中的应用。

2 材料与方法

2.1 材 料

2.1.1 菌株与载体

毕赤酵母GS115及表达载体pPIC9K-kwPMEI由作者实验室保存; DH5α及克隆载体pGEM-Teasy购自天根公司。

2.1.2 酶与试剂

高保真的PfuDNA聚合酶、Ex Taq DNA聚合酶、限制性内切酶购于大连宝生物公司; T4连接酶购于Promega公司; DNA胶回收试剂盒购于康为试剂公司; 抗His6-Tag-AP单克隆抗体、山羊抗小鼠单克隆抗体购于碧云天公司; 其他试剂均为进口或国产之分析纯。

2.1.3 仪 器

PCR仪(美国Bio-Rad公司); 高速冷冻离心机和电转仪(德国Eppendorf公司); 镍柱(美国GE公司);

电泳仪(北京六一仪器厂); 凝胶成像系统(美国UVP公司); 酶标仪(美国Thermo公司); 紫外可见分光光度计(上海尤尼柯有限公司)。

2.1.4 培养基

YPD培养基: 1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%的葡萄糖; LB培养基: 1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化钠; MD培养基: 1.34%YNB、2%葡萄糖、4×10-5%生物素。固体培养基再加2%的琼脂粉。

2.2 方 法

2.2.1 重组质粒pGAP9K-kwPMEI的构建

根据发布的pGAP序列[5], 设计上游引物(5′-GCGAGCTCCCTTTTTTGTAGAAATGTC-3′; 划线的为Sac I酶切位点)和下游引物(5′-CGGGATCCTGTGTTTTGATAGTTGTTC-3′; 划线的为BamH I酶切位点), 由上海生工公司合成, 以P．pastoris GS115基因组为模板, 用PCR扩增pGAP片段, 并将其克隆到载体pGEM-Teasy上, 构建了载体pGEM-Teasy-pGAP。用Sac I和BamH I同时双酶切载体pGEM-Teasy-pGAP和pPIC9K-kwPMEI, 胶回收目的片段后, 通过T4连接酶连接, 构建了载体966 食品安全质量检测学报 第5卷

pGAP9K-kwPMEI。

2.2.2 毕赤酵母宿主菌转化及阳性转化子的筛选

用Sal I单酶切质粒pGAP9K-kwPMEI, 经胶回收后, 通过电转化的方法转化到is GS115基因组中。用含1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL G418的YPD平板筛选高拷贝转化子。毕赤酵母基因组中目的基因kwPMEI的拷贝数越多, 对抗生素G418的抗性就会越强, 表达目的蛋白kwPMEI的量也就会越高。因此,

从G418浓度最高的平板上挑取转化子进行组成型表达kwPMEI。

2.2.3 组成型表达kwPMEI

将用4.0 mg/mL G418筛选的高拷贝重组毕赤酵母菌株在新鲜YPD平板上划线, 于30 ℃, 倒置培养2天。挑取单菌落接种于5 mL YPD培养基中, 过夜培养, 按1%接种量取2 mL菌液接种于20 mL YPD培养基中, 用250 mL三角瓶进行培养, 培养条件为:

28 ℃、摇床转速为200 r/min。每隔24 h补加甘油至终浓度1%, 培养72 h。每隔12 h取样, 用于测定菌体密度OD600, 蛋白浓度和进行Western blot分析。蛋白总浓度用Bradford法[7]测定, 而kwPMEI的浓度用BandScan软件结合蛋白总浓度进行计算。

2.2.4 补加碳源的优化

按1%接种量将菌液接种于20 mL YPD培养基后,

每隔24 h分别补加不同的碳源(葡萄糖、甘油、甲醇)至其终浓度为1%, 在最佳发酵时间收集发酵上清液,

并测定kwPMEI的浓度。

2.2.5 kwPMEI的纯化及抑制活性鉴定

发酵上清液经离心后, 用5 mL镍柱进行亲和层析纯化。结合液为: 50 mmol/L NaH2PO4, 300 mmol/L

NaCl, 10 mmol/L咪唑, pH 8.0; 洗脱液为: 50 mmol/L

NaH2PO4, 300 mmol/L NaCl, 250 mmol/L咪唑, pH

8.0。纯化的kwPMEI用Tricine-SDS-PAGE进行分析。kwPMEI对于番茄果胶甲酯酶的抑制活性用凝胶扩散方法[8]进行检测, 其中用硫酸铵沉淀法[9]提取番茄果胶甲酯酶。

3 结果与分析

3.1 重组质粒pGAP9K-kwPMEI的构建

根据发布的pGAP序列设计引物, 以P．pastoris

GS115基因组为模板, 用PCR方法扩增出了约500

bp左右的pGAP片段(图1A), 与预期结果一致。测序结果证实, 克隆到载体pGEM-Teasy-pGAP上的pGAP片段正确。通过酶切连接的方法构建了重组质粒pGAP9K-kwPMEI, 其具体构建过程如图1B所示。重组质粒pGAP9K-kwPMEI经Sac I和BamH I双酶切鉴定, 可见两条电泳条带9000 bp和500 bp(图1C),

其大小正确。测序证实pGAP9K-kwPMEI构建成功。

3.2 组成型表达kwPMEI

不同时间kwPMEI的表达水平及重组菌的生长状况分析结果(图2)表明: 在pGAP的调控下,

kwPMEI很快就开始表达, 并且随着时间的延长kwPMEI表达量逐渐增加, 在48 h时产量达到最高值,

之后随着时间的延长kwPMEI的表达量下降, 这可能是因为蛋白酶的降解[10]。由此, 确定了最佳发酵时间为48 h。kwPMEI的C段融合了His6标签, 能与抗His6-Tag-AP单克隆抗体结合, 如图2B所示, Western

blot分析显示在20 kDa左右处有一蛋白条带, 其大小稍大于其原本大小(17 kDa)[11], 可能是由于毕赤酵母中翻译后的糖基化修饰。

3.3 碳源对组成型表达kwPMEI的影响

发酵48 h后离心收集上清液, 并测定蛋白浓度。如图3所示, 当补加甘油时, kwPMEI的表达量最高。而补加甲醇时kwPMEI的表达量最低。研究表明, 有的蛋白在补加甘油时表达量高于葡萄糖[12], 而有的蛋白在补加甘油时表达量却低于葡萄糖[5], 这主要由表达的蛋白种类而定。

3.4 kwPMEI的纯化及抑制活性检测

蛋白电泳Tricine-SDS-PAGE分析结果显示(图4A), 通过镍柱亲和层析后, 能够得到单一的kwPMEI条带, 表明该方法能够成功分离纯化kwPMEI。经过凝胶扩散分析(图4B), 组成型表达的kwPMEI能够有效抑制番茄PME的活性, 表明纯化后的kwPMEI仍然具有活性, 同时也说明镍柱亲和层析能够有效地保持蛋白的活力, 不会使蛋白失活。

4 讨 论

虽然is的pAOXl系统广泛地应用于生产重组蛋白[13-15], 但由于该系统需用危险性高的甲醇作为碳源, 发酵时间长, 并且生产过程中需要进行碳源转换等缺点, 制约了其在外源蛋白大规模生产中的应用。自从Waterham等[5]首次发现并分离pGAP以后, 陆续有报道称用pGAP构成的组成型表达系统 第3期 曹东艳, 等: 用GAP启动子在毕赤酵母中组成型表达重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂 967

图1 重组质粒pGAP9K-kwPMEI的构建

Fig. 1 Construction of recombinant vector pGAP9K-kwPMEI

注: A: 以酵母基因组为模板扩增pGAP, 1: 阴性对照, 2: 扩增的pGAP; B: pGAP9K-kwPMEI的具体构建过程;

C: Sac I和BamHI双酶切鉴定pGAP9K-kwPMEI, 1: 双酶切结果, 2: 质粒pGAP9K-kwPMEI。

成功表达了外源蛋白[16-19]。另外, GAP启动子衍生的巴斯德毕赤酵母组成型表达系统可以采用连续发酵的模式, 避免了pAOX1诱导型表达系统分批发酵的不便。Goodrick等[20]利用高密度发酵组成型表达了人几丁质酶, 发现采用分批发酵策略表达人几丁质酶时容易降解, 而用连续发酵策略表达时没有观察到酶的降解, 表明pGAP表达系统更适合大规模生产外源蛋白。

毕赤酵母表达系统中的大部分启动子在表达外源蛋白时都受到碳源的控制, 优化碳源是提高毕赤酵母组成型表达外源蛋白产量的重要策略之一[21]。Dring等[22]利用pGAP系统表达兔肾肽转运蛋白时,

发现以葡萄糖为碳源时其表达量是甘油的2倍。而Menendez等[23]的研究结果及本文结果表明以甘油为碳源能获得更多的产物。不同碳源对不同蛋白表达的影响各不相同, 只能通过具体的实验来确定最佳碳源。

毕赤酵母表达中常遇到的另一个问题是由于宿主蛋白的存在, 经常使产物不稳定, 影响表达量。为避免表达产物被蛋白酶降解, 所以要优化表达时间或加入蛋白酶抑制剂, 或选择蛋白水解酶缺陷型菌株。此外, 源于pGAP的毕赤酵母组成型表达系统对 968 食品安全质量检测学报 第5卷

图2 不同时间kwPMEI的表达水平及重组菌的生长状况分析

Fig. 2 Analysis of the expression level of kwPMEI and the

cell growth status

注: A图中n=3, B为Western blot分析

图3 碳源对表达kwPMEI的影响(n=3)

Fig. 3 Effect of carbon source on kwPMEI expression

于某些蛋白的分泌并不能达到理想的效果, 而且只能表达对细胞没有毒害的外源蛋白, 这都在一定程度上限制了毕赤酵母组成型表达系统的应用。但是,

随着发酵工艺的不断完善和对毕赤酵母组成型表达

图4 kwPMEI的纯化及抑制活性检测

Fig. 4 PurificationkwPMEI and detection its inhibitory

activity

注: A: Tricine-SDS-PAGE分析, 1: 表达上清, 2: 镍柱纯化kwPMEI结果; B: 1: 番茄PME, 2: 番茄PME+纯化的kwPMEI; 其中凝胶中含有0.1%的果胶。

系统的深入研究, 此组成型表达系统将会拥有更美好的未来。

本研究用pGAP表达系统成功表达并分离纯化了有活性的kwPMEI, 为kwPMEI的进一步优化表达和发酵罐发酵奠定了基础; 构建的适合工业化生产kwPMEI的酵母工程菌株具有良好的产业化应用前景, 为kwPMEI在果蔬汁中的进一步应用打下了铺垫。

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(责任编辑: 张宏梁)

作者简介

曹东艳, 硕士研究生, 主要研究方向为食品生物技术。

E-mail: caody2012@

梅晓宏, 副教授, 主要研究方向为食品生物技术及转基因食品的安全性研究。

E-mail: xhmei0719@

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