谷氨酰胺转氨酶在Pichia pastoris GS115中的表达及其发酵条件响应面法优

2023年12月4日发(作者：调任通知)

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第43卷第6期2020年11月河北农业大学学报JOURNAL OF HEBEI AGRICULTURAL UNIVERSITYVol.43 No.6Nov.2020文章编号：1000-1573(2020)06-0083-07DOI：10.13320/.2020.0116谷氨酰胺转氨酶在Pichia pastoris GS115中的表达及其发酵条件响应面法优化于 凡1，刘 双1，陈海清1，王红静1，马 雯1，石 楠2，檀建新1（1. 河北农业大学 食品科技学院，河北 保定 071001；2. 河北大学 生命科学学院/河北省微生物多样性研究与应用重点实验室，河北 保定 071002）摘要：为了将筛选得到的吸水链霉菌107.3的谷氨酰胺转氨酶基因在毕赤酵母GS115中表达，并通过优化发酵条件来提高重组菌株酶的表达量，本试验构建了由吸水链霉菌前肽pro、kex2酶切位点、成熟酶mTGa 3部分组成的融合基因，电转至毕赤酵母GS115中进行表达；采用Plackett-Burman（PB）设计和响应面法（RSM）在摇瓶水平研究了重组毕赤酵母的发酵条件（接种量、诱导温度和时间、初始pH值和甲醇浓度）。结果表明：吸水链霉菌的TGa基因在毕赤酵母GS115中得获得成功表达，酶活力为0.3 U/mL；通过PB试验设计确定了影响产酶的显著性因素为诱导初始pH、甲醇浓度和接种量。进一步选择该3个显著因素进行RSM中心组合试验，确定了最优的产酶条件为：接种量OD600为6、pH 7、甲醇浓度2.0%、诱导温度23 ℃、诱导时间72 h。优化发酵条件后，重组菌株产TGa酶活力可达1.1 U/mL，是初始酶活的3.6倍。本研究构建的MTG异源表达体系为MTG生产和分子改造提供了平台。关 键 词：谷氨酰胺转氨酶；毕赤酵母；Plackett-Burman（PB）设计；响应面法；吸水链霉菌中图分类号：Q786

文献标志码：A开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Expression of transglutamina in Pichia pastoris GS115 and optimization

of its fermentation conditions using respon surface methodologyYU Fan1, LIU Shuang1, CHEN Haiqing1, WANG Hongjing1, MA Wen1,  SHI Nan2, TAN Jianxin1（1. College of Food Science and Technology, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, China；2. School of

Life Sciences/Key Laboratory of Microbial Diversity Rearch and Application of Hebei Province, Hebei University,

Baoding 071002, China）Abstract：In order to express the transglutamina (TGa) gene of Streptomyces hygroscopicus 107.3 in Pichia

pastoris GS115 and improve the expression of recombinant enzyme by optimizing fermentation conditions, a fusion

gene containing TGa propeptide (pro),

kex2 protea cutting site and mature TGa (mTGa) of S. hygroscopicus

was constructed in this experiment and transferred to P. pastoris GS115 for expression. Plackett Burman (PB) design

and respon surface methodology (RSM) were ud to study the expression conditions (inoculum size, induction

收稿日期：2020-08-21基金项目： 河北省重点研发计划项目（16275505D）；河北省食品科学与工程学科“双一流”建设资金项目（2016SPGCA18）.第一作者：于 凡(1994-)，男，河北保定人，硕士研究生，从事食品工程方向的研究.通信作者：檀建新(1968-)，男，河北唐山人，博士，教授，从事食品生物技术研究. E-mail:*******************石 楠(1977-)，女，河北保定人，博士，副教授，从事微生物学研究. E-mail:***************本刊网址：http: // hauxb. hebau. edu. cn: 8080 /CN/ volumn / home. shtml84河北农业大学学报第43卷temperature and time, initial pH value and methanol concentration) at a level of cultivation in shake flask. The

results indicated that the TGa gene of S. hygroscopicus was successfully expresd in P. pastoris GS115, and the

enzyme activity was 0.3 U/mL. Three significant factors including initial pH, methanol concentration and inoculation

amount, which affected the enzyme production, were screened out by PB design and further subjected to RSM Box-Benhnken test to determine the optimal enzyme production conditions. The results showed that the optimal conditions

for a production were as follows: inoculum OD600=6, pH=7, methanol concentration 2.0%, induction temperature 23

℃and induction time 72 h. After optimizing the fermentation conditions, the TGa activity of the recombinant strain

was up to 1.1 U/mL, which was 3.6 times of the initial enzyme activity. The heterologous expression system of MTG

constructed in this study provides a platform for MTG production and molecular ds: transglutamina; Pichia pastoris; Plackett-Burman (PB) design; respon surface methodology;

Streptomyces hygroscopicus谷氨酰胺转氨酶（Transglutamina，缩写为TGa，EC 2.3.13）是一种重要的食品酶［1］，具有催化酰基转移、脱酰胺和蛋白质分子间或分子内的赖氨酸与谷氨酰胺共价交联的活性［2］。后者可以改变蛋白质网络结构、增强保水能力和促进凝胶形成，提高蛋白质营养价值［3］。因此，被广泛应用于蛋白质的修饰，从而改善蛋白质的理化性质和功能［4］，在食品、医药、纺织等领域具有重要的应用价值［5］。TGa在自然界中分布广泛，包括豚鼠肝脏、植物以及微生物［6］。微生物来源的谷氨酰胺转氨酶又称为MTG（Microbial transglutamina），与动植物来源的TGa相比，MTG具有分子量小、Ca2+独立性、较高的反应速率和热稳定性以及较宽的酰基供体底物专一性等优点，更适合工业生产和应用［4］。同时，因为微生物生长快，产量大，效率高，所以达到工业规模的用于食品改性的商业化MTG都是由微生物发酵生产的［7］。然而，MTG也存在一些缺点，如天然宿主链霉菌的发酵培养基相对昂贵，发酵工艺复杂，增加了大规模生产的成本和复杂程度［8］。因此，异源重组表达则成为生产MTG的一种可行的技术手段［9］。巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统已被广泛用于外源重组蛋白质的表达，可同时生产分泌蛋白和细胞内蛋白［10］。目前，已有500多种来自哺乳动物、植物、酵母和细菌的外源蛋白在毕赤酵母中获得了成功表达［11］。毕赤酵母具有操作简单、生物量和蛋白产量高的优点，并且它是甲醇营养型酵母，具有强启动子AOX1，可严格调控和驱动高水平的蛋白表达，能够进行蛋白质水解、折叠、二硫键形成和糖基化等翻译后修饰。这些特点使毕赤酵母成为大规模生产重组酶的理想宿主［12］。许多在原核系统中以非活性形式表达的蛋白质在毕赤酵母中都实现了活性形式的表达［13］。利用毕赤酵母高效表达外源蛋白的特性，本研究将含有吸水链霉菌TGa基因的pPIC9K-pro-kex-TGa重组分泌表达载体在毕赤酵母GS115中表达，并通过Plackett-Burman（PB）设计和响应面法Respon surface methodology（RSM）评价并优化了TGa的发酵条件，以期为后续大规模发酵提供参考。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株及质粒 巴斯德毕赤酵母GS115及pPIC9K空载质粒由本实验室保存；吸水链霉菌TGa基因克隆来自本实验室保存的吸水链霉菌

（Streptomyces hygroscopicus）菌株107.3，pPIC9K-

pro-kex-TGa由本实验室前期构建保存。1.1.2 培养基及试剂 参考Invitrogen毕赤酵母表达手册，配制YPD培养基、MD培养基、生长培养基BMGY、诱导培养基BMMY。DH5α感受态、

SolutionⅠ购自北京博迈德基因技术有限公司；SalⅠ等酶购自大连宝生物公司；PCR Mix、Super

Marker（100-10 kb）、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；引物合成及测序由通用生物系统（安徽）有限公司完成。1.1.3 仪器与设备 SPX-250B-Z型生化培养箱，上海博迅公司； H-1850R台式高速冷冻离心机，长沙湘仪公司；PCR仪德国Biometra公司；756P紫外可见分光光度计，上海光谱公司；Gene Pulr Xcell第6期 于 凡,等：谷氨酰胺转氨酶在Pichia pastoris GS115中的表达及其发酵条件响应面法优化85电穿孔仪，美国Bio-Rad公司。1.2 试验方法1.2.1 重组毕赤酵母GS115的构建 取-80 ℃保存含pPIC9K-pro-kex-TGa重组载体的大肠杆菌甘油保藏管，按1%接种量接种于5 mL含0.1%（v/v）氨苄抗性的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养过夜，收集菌体并使用质粒提取试剂盒提取质粒。用salⅠ酶切处理重组质粒pPIC9K-pro-kex-TGa使之线性化，再电转化至GS115感受态细胞内并整合到基因组中，利用菌落PCR及酶活性比色法对转化子进行筛选，获得阳性转化子。1.2.2 重组GS115/pPIC9K-pro-kex-TGa摇瓶培养基诱导表达 挑取阳性转化子GS115/pPIC9K-pro-kex-TGa，活化后按1%接种量接种于含25 mL

BMGY生长培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min培养25 h。参照毕赤酵母表达手册方法，4 ℃、5 000 r/min收集菌体并转接到BMMY诱导培养基中，23 ℃、200 r/min继续培养72 h，每24 h补加100%甲醇至终浓度0.5%。取诱导结束后的发酵液，12 000 r/min离心10 min收集上清液，即为粗酶液。1.2.3 酶活测定及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 酶活测定使用经典氧肟酸比色法［14］，取50 μL粗酶液置于1.5 mL离心管中，加入50 μL

A液（CBZ、盐酸羟胺、GSH、0.2 mol/L Tris-HAc）混和均匀，放入37 ℃水浴锅温浴10 min，加

50 μL B液（3 mol/L HCL、5% FeCl3、CCL3COOH）终止反应并显色。反应体系经12 000 r/min离心1 min

后，取100 μL转入96孔酶标板中，在525 nm波长下测定上清液的吸光值；另取50 μL粗酶液煮沸灭活，其余步骤同上，作为对照用于样品测定吸光度值时调零。dispaⅡ处理粗酶液在37 ℃水浴锅温浴20 min［15］。根据L-谷氨酸-γ-单羟肟酸标准曲线，y

=

0.031

8x+0.042 4（x为L-谷氨酸-γ-单羟肟酸浓

度mmol/L，y为OD525下的吸光值A，R2=0.999

8），

计算酶活力值。酶活单位定义为37 ℃下每分钟催化形成1 μmol的L-谷氨酸-γ-单羟肟酸所需要的酶量。使用12%分离胶对酶提取液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析［16］。1.3 数据统计分析数据统计分析旨在寻找显著变量及其与实验结果的关系，以便对变量水平进行管理以获得期望的结果输出［17］。因此根据TGa酶活力的实验结果，分析了TGa酶活力和诱导表达发酵参数的关系，通过Design-Expert V8.0.6专业实验设计软件，设计实验方案、进行分析和预测。1.3.1 Plackett-Burman（PB）设计 PB设计［18］可

以快速、有效的从本试验的多个发酵条件中筛选出主要因素。根据前期单因素预实验结果，采用PB设计对接种密度、温度、初始pH、甲醇浓度、诱导时间共5个因素对TGa生产的影响进行研究，试验次数N=12，每个因素选取高低两个水平（表1）。表1 PB设计的因素和水平Table 1 Factors and levels of PB design编码因子水平-1+1X1接种密度OD60016X2诱导温度/℃2030X3初始pH56.5X4甲醇浓度/%0.52X5诱导时间/h48721.3.2 Box-Behnken设计（BBD）和响应面方法（RSM）在PB设计结果的基础上，通过RSM进一步优化具有显著影响的因素。通过Box-Behnken设计3因素2水平的响应面试验，再以粗酶液的酶活为响应值。使用二次多项式模型来探索显著因素变量和响应变量之间的关系。最终目标是通过建模和分析影响响应值的多个独立变量来优化发酵参数［19］。数学模型如下：Y=α0+ΣαiXi+ΣαijXiXj+ΣαiiX2i （1）Y是预测响应值，α0为常数项，αi为因子影响系数，αij为因子间交互响应系数，αii为二阶影响系数因子。Xi

Xj自变量的水平。2 结果与分析2.1 重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-pro-kex-TGa 诱导表达及SDS-PAGE分析将构建并筛选出的阳性转化子菌株进行诱导表达后收集粗酶液进行酶活检测，粗酶液可直接检测86河北农业大学学报第43卷出较低的酶活性，说明粗酶液中含有正确折叠且有活性的成熟酶TGa（mTGa），推测可能是由于GS115菌株自身的kex2酶识别Lys-Arg位点并对酶原pro-kex-TGa酶切形成了mTGa所致。粗酶液经dispaⅡ处理后酶活力达到（0.314±0.002）U/mL，

而GS115空白菌株、GS115/pPIC9K空载菌株在相同条件下发酵上清液中没有检测到MTG酶活，说明两者不表达TGa，而含有酶原pro-kex-TGa基因的阳性转化子菌株能够很好地表达酶原且具有TGa活性。对收集的粗酶液进行SDS-PAGE电泳分析，结果见（图1）。泳道1、2分别是GS115、GS115/pPIC9K发酵上清液，未见蛋白条带，说明GS115、GS115/pPIC9K本身不表达TGa酶蛋白；泳道3为GS115/pPIC9K-pro-kex-TGa发酵上清液，在约45 kD处出现明显蛋白条带，这与S. hygroscopicus谷氨酰胺转氨酶酶原的蛋白分子理论大小基本一致，说明TGa获得了很好地表达且不存在糖基化修饰。然而，在胞外粗酶液中直接检测到了TGa酶活力，说明该表达系统也直接生成了分泌到胞外的折叠正确的mTGa，理论上其分子大小约为38 kD，但在SDS-PAGE图中只有1条45 kD的TGa酶原条带（图1），说明可能只有很少的酶原经过kex2酶活化成mTGa，故在SDS-PAGE胶图中未出现相应条带。M 1 2 375 kD55 kD45 kD40 kD注：M：PageRuler预染色标准蛋白；1：GS115发酵上清液；

2：GS115/pPIC9K发酵上清液；3：GS115/pPIC9K-pro-kex-TGa发酵上清液。图1 TGa粗酶液的SDS-PAGE电泳分析Fig. 1 SDS-PAGE electrophoresis analysis of TGa crude

enzyme solution2.2 用PB设计筛选TGa表达的主要因素所有试验除研究因素外其它条件均保持一致，PB实验设计与结果见表2。表2 PB实验设计与结果Table 2 PB experimental design and results序号因素 FactorNo.X1X2X3X4X5Y/ (U·mL-1)111-1-1-10.1902-1111-10.448311-1110.3444-1-1-11-10.26951-1-1-110.3196-1-1-1-1-10.2317-11-1110.25681-11110.8109111-1-10.40110-1-11-110.426111-111-10.58012-111-110.306确定显著性因素并进行方差分析（见表3）。“Prob

＞

F”（P值）值表明模型和因子的显著性水平。“Prob＞F”值小于0.050

0表示显著，大于0.100

0表示不重要。PB结果分析5个因素对TGa的生产影响，按重要性排序为：X3＞X4＞X1＞X2＞X5。其中X3、X4对TGa酶活力有显著影响（P＜0.01），选择X3、X4和X1（诱导pH、甲醇浓度、接种密度）进一步优化。表3 PB设计结果分析Table 3 Analysis of PB design resultsFactor因素FF value值Prob ＞

F（P value）Importance重要性X110.110.019 13X29.600.021 24X337.410.000 91X414.030.009 62X52.360.175 552.3 用RSM优化显著因子2.3.1 RSM试验设计 使用响应面中的BBD法对显著因子编码，诱导起始pH（A）、甲醇浓度（B）和诱导起始接种密度（C）进行优化试验，研究3个因子的相互作用和最佳水平。获得多元二次方程如下所示：Y=0.82+0.13*A-0.053*B+0.032*C+0.015*AB+

0.012*AC-(7.000E-003)*BC-0.062*A2-0.24*B2-0.059*C2 （2）Y为预测TGa酶活力，A、B和C分别为3个显著因子的编码值。每个因子有3个编码水平（1，0，-1），共进行了17次运行。响应面试验设计见表4。第6期 于 凡,等：谷氨酰胺转氨酶在Pichia pastoris GS115中的表达及其发酵条件响应面法优化表4 响应面试验设计Table 4 Experimental design of respon surface编号No.17A pH6.506.507.006.006.506.006.006.507.006.506.507.006.006.506.506.507.00B甲醇浓度/%Methanol

concentration2.002.002.002.502.501.502.002.001.502.501.502.502.002.002.001.502.00C接种密度/AVaccination

density6.006.008.006.008.006.004.006.006.004.004.006.008.006.006.008.004.00粗酶活/（U·mL-1）Crude enzyme activity0.8060.8140.8790.3300.5100.4820.5390.8520.6750.4430.5170.5830.5620.7890.8220.6120.806872.3.2 回归分析 对该方程2.3.1（2）进行回归系数显著性检测和方差分析。表5结果表明，模型F值为61.69意味着该模型具有显著性，只有0.01%的可能性，因为噪音而产生较大的“F值”。“P值”即小于0.050

0表示模型项是有效的，在这种情况下，A、B、C、A2、B2、C2是重要的因子项。大于0.100

0的值表示因子项不重要，AB、AC、BC不重要。失拟项为2.16.意味着缺乏拟合相对于纯误差不显著，有23.55%的可能性出现这样大的失拟值是由于噪声。对可信度进行分析，模型R2=0.987

5，变异系数（C.V. %）为4.3，说明模型的拟合程度和可信度较高。“Adeq

Precision”测量信噪比，比率大于4是所期望的。该模型25.987的比率表明信号充足。说明此模型可用于模拟TGa酶活力的理论预测。表5 响应面二次模型的方差分析Table 5 ANOVA of the quadratic model of respon surface方差来源Source模型A-pHB-甲醇浓度C-接种密度ABACBCA2B2C2残差失拟项纯误差总和平方和Sum of square0.450.130.0228.321E-0039.000E-0046.250E-0041.960E-0040.0160.240.0145.666E-0033.503E-0032.163E-0030.46自由度Degree of freedom9416均方Mean square0.0500.130.0228.321E-0039.000E-0046.250E-0041.960E-0040.0160.240.0148.095E-0041.168E-0035.408E-0042.160.235 5not significantF 值F value61.69163.8327.2410.281.110.770.2419.71293.5317.83P 值P value＜ 0.000 1＜ 0.000 10.001 20.014 90.326 70.408 70.637 70.003 0＜ 0.000 10.003 9显著性Significancesignificant注：R=0.993 7，R2=0.987 5，R2（adjust）=0.971 5，coefficient of variation（CV）=4.3%，Adeq Precision=25.142。2.3.3 响应面各因子相互作用的关系 为了更好地理解各因子对TGa生产的影响，使用Design-Expert.V8.0.6获得了各因子的2D等高线图和3D响应曲面（见图2～4）。通过响应曲面和等高线图直观地观察到AB，AC和BC之间相互作用。等高线图呈椭圆时，表示两因子间具有显著的交互作用，其它则不显著。图2（b）图4（b）的曲面较陡，说明pH和甲醇浓度、甲醇浓度和接种密度的交互作用对酶活性影响较显著。图3（b）曲面较平缓，说明pH和接种密度的交互作用对酶活性影响不显著。图2（a）图4（a）的等高线趋向椭圆形，说明pH和甲醇浓度、甲醇浓度和接种密度的交互作用明显。通过沿轮廓的长轴和短轴移动来获得变量的统计最优值。在等高线图中最小的椭圆中得到最高的预测值。预测最佳发酵条件：诱导初始pH 7，甲醇浓度2.07%，接种密度OD600 6.27，预测响应值为1 U/mL。88河北农业大学学报第43卷ab图2 诱导pH值和甲醇浓度影响酶活力的等高线a和响应面曲图bFig. 2 The contour a and respon surface plot b of induced pH and methanol concentration affecting enzyme activityab图3 诱导pH值和接种密度影响酶活力的等高线a和响应曲面bFig. 3 The contour a and respon surface b of induced pH density affecting enzyme activityab图4 甲醇浓度和接种密度影响酶活力的等高线a和响应曲面bFig. 4 Contour a and respon surface b of methanol concentration and inoculation density affecting enzyme activity2.3.4 发酵条件的优化验证 经响应面优化，结合实际情况调整最佳诱导条件为诱导接种密度OD600为6，pH为7，甲醇浓度为2.0%，温度23 ℃，诱导时间72 h，进行3组平行发酵试验，在此条件下获得的粗酶液经dispaⅡ处理，检测到TGa酶活力为（1.03±0.075 ）U/mL；与响应面优化设计所得预测值相近，证明该模型较好的预测了试验结果。3 讨论与结论到目前为止，人们尝试了不同来源的TGa在P. 第6期 于 凡,等：谷氨酰胺转氨酶在Pichia pastoris GS115中的表达及其发酵条件响应面法优化89pastoris中的表达，但酶活力普遍不高，例如2019年，Yang等［20］试验表明，表达弗氏链霉菌TGa酶活力达到0.7 U/mL，且证明TGa活性能够引起于猪肉、鸡肉和大豆蛋白的交联重构。2019年Li等［13］研究表明，表达玉米TGa获得可溶性TGa酶活力达到0.889 U/mg。而来源于S. hygroscopicus 的TGa的在酵母中异源表达研究较少，万丹研究报道的重组吸水链霉菌TGa在解脂耶氏酵母中表达酶活力为1.06 U/mL［15］。P. pastoris作为应用最广泛的真核表达系统，对MTG的大量表达还有巨大的发展潜力。本研究构建的重组吸水链霉菌TGa的P. pastoris表达系统，既可以产生大量酶原蛋白，又可以直接产生具有酶活性的mTGa，其原因可能是GS115菌株自身的kex2蛋白酶识别KR位点并酶切了表达的TGa酶原形成了有活性的mTGa，这在一定程度上实现了本研究的设计目标。Bader et

al［21］研究发现，毕赤酵母可产生kex2蛋白酶，该酶的存在为mTGa形成提供了可能性。但在发酵条件优化前后，SDS-PAGE电泳中均未出现明显的mTGa蛋白条带，说明优化前后被kex2酶活化的TGa酶原仍然只是一小部分，还有很大的改造潜力。目前关于提高毕赤酵母TGa表达量的方法，报道较多是启动子改造、信号肽替换、高拷贝菌株筛选等［22］，该重组表达系统未来可以通过共表达kex2酶、使用专一性切割TGa酶原区的TAMEP蛋白酶、发酵培养基优化等方法来获得更高的酶活力，有助于其工业化应用。本研究经过Plackett-Burman（PB）和Box-Behnken（RSM）试验设计优化发酵条件，结果表明优化后获得的TGa酶活力比未优化发酵条件前提高了近3.6倍，说明将PB设计和RSM试验方法相结合，用于筛选显著影响因子并揭示因子间的相互关系的优化方法可行，Yu et al［19］曾使用该方法优化生产胞外溶菌酶的发酵条件，使该酶得到了高效表达。本研究构建了表达吸水链霉菌TGa的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-pro-kex-TGa，在接种密度OD600为6，pH为7，甲醇诱导浓度为2.0%，温度23 ℃，诱导时间72 h的优化条件下，TGa最大酶活力达到1.1 U/mL，并实现了有活性mTGa的胞外分泌表达，为MTG生产和分子改造提供了新思路。参考文献：［1］ Duarte L S，Bar L Q，Dalberto P F，et al. Cloning

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