基因重组酵母工程菌优化表达人源胶原蛋白_刘斌

2023年12月4日发(作者：郑州大学远程教育学院官网)

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第35卷第4期2011年8月南京理工大学学报JournalofNanjingUniversityofScienceandTechnologyVol．35No．4Aug．2011基因重组酵母工程菌优化表达人源胶原蛋白刘斌，郭红丽，钮小松，张小霞，杨树林（南京理工大学环境与生物工程学院，江苏南京210094）要：通过响应曲面法（RSM）优化巴氏毕赤酵母基因工程菌GS115/pPIC9KG6表达高亲水性重组人源胶原蛋白的摇瓶培养条件。采用Box－Behnken设计（BBD）考察初始诱导pH值、温度摘利用DX7Trial软件设计和甲醇添加量三个主要影响因子对重组人源胶原蛋白表达量的影响，实验方案，根据该方案设置不同培养条件进行实验并测定相关参数。响应面分析确定的最优因素水平组合为：初始诱导pH值为5．0，诱导温度为28℃，甲醇添加量为2．2%/24h。通过响应面法优化发酵的内在因素水平，找出最佳条件，为利用其指导在发酵罐中进行高密度发酵生产人源胶原蛋白奠定基础。Behnken设计关键词：巴氏毕赤酵母；重组人源胶原蛋白；响应曲面法；Box-中图分类号：Q815文章编号：1005－9830（2011）04－0558－05OptimizationofFermentationConditionsofGeneticallyEngineeredPichiapastorisExpressingRecombinantHuman-sourceCollagenLIUBin，GUOHong-li，NIUXiao-song，ZHANGXiao-xia，YANGShu-lin（SchoolofEnvironmentalandBiologicalEngineering，NUST，Nanjing210094，China）Abstract：Responsurfacemethodology（RSM）isudtooptimizethefermentationconditionsofge-neticallyengineeredPichiapastoris（GS115/pPIC9KG6）expressinghighlyhydrophilicrecombinanthuman-sourcecollagen．Box-Behnkendesign（BBD）isintroducedtoestimatetheimpactofinitialin-ducementpH，temperatureandadditionamountofmethanol．Anexperimentisdonebyttingdiffer-entcultureconditionsaccordingtotheschemedesignedthroughtheDX7Trialsoftware，andthecor-relationalparametersaredetermined．TheRSManalysisresultshowsthattheoptimalscaleoffactorsis：initialinducementpH5．0，temperature28℃，additionamountofmethanol2．2%/24h．Theex-perimentofferspreciconditionsforhighdensityfermentationperformedinfermenter．Keywords：Pichiapastoris；recombinanthuman-sourcecollagen；responsurfacemethodology；Box-Behnkendesign收稿日期：2010－09－20修回日期：2011－06－10“863”基金项目：国家计划资助项目（2008AA12A218）；教育部博士点基金（23）E-mail：goldendays2002@126．com；通作者简介：刘斌（1971－），男，博士生，主要研究方向：基因工程技术的应用，E-mail：讯作者：杨树林（1953－），男，教授，博士生导师，主要研究方向：微生物代谢调控与基因工程，yshulin@mail．njust．edu．cn。总第179期刘斌郭红丽钮小松张小霞杨树林基因重组酵母工程菌优化表达人源胶原蛋白559胶原蛋白具有独特的组织结构和生物学特对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和性，损伤修复有重要作用，同时胶原蛋白具有低免可生物降解、良好的生物相容性和机械疫原性、作为生物医用材料广泛应用于医性能等特点，［1，2］。胶原蛋白传药、组织工程和化妆品等领域统的也是目前最主要的生产方法是利用酸碱法或酶法处理猪或牛等动物的结缔组织中提［3，4］，取但从此类动物组织中提取的胶原蛋白为水不溶性蛋白，可加工性很弱，并且提取过程中会或多或少丧失其部分生物活性，同时其提取物含有动物疾病病毒隐患，应用于人体时易产生排异反应，从而很大程度限制了胶原蛋白的生产应用［1，2］1．21．2．1培养方法种子培养从新鲜MD平板上挑取单菌落接种到50mL30℃和250r/min振荡培养过BMG培养基中，然后接入200mLBMG培养基中继续培养至夜，OD600达5．0～6．0。1．2．2摇瓶发酵6000r/min离心10min收集菌体，以100mL的BMM培养基重新悬浮菌体，使菌浓OD600250为2．0。调至所需pH值后，在选定的温度下，r/min培养培养72h，每24h补加甲醇至一定浓度。1．3分析方法重组人源胶原蛋白浓度：发酵液经10000PAGE凝r/min离心10min得上清液，进行SDS-电泳胶经凝胶成像扫描后采用Quantity胶电泳，One4．5．2软件分析计算蛋白浓度。1．4RSM优化发酵条件在前期的单因素实验基础上，选取初始诱导pH值、温度和甲醇添加量三个关键因素为自变量，以重组人源胶原蛋白表达量为响应值，采用RSM［9］中的BBD对巴氏毕赤酵母发酵表达重组人源胶原蛋白的条件进行优化。利用DX7Trial软件设计实验方案，根据该方案设置不同培养条件进行实验并测定相关参数。。鉴于此，利用基因工程技术生产重组胶原蛋白成为近几年该领域的研究热点。利用转基因技术和基因重组技术，可以在动物［6］［7］、植物和微生物表达体系获得重组人胶原蛋白，从而可解决传统提取方法存在的如［5］猪瘟或疯牛病病毒隐患等缺点，同时也改善了胶原蛋白的亲水性、免疫排异性等，但目前利用上述不同表达体系制备的胶原蛋白尚存在水溶性差和表达量低等缺陷。针对此问题，本实验室基于人Ⅲ型胶原蛋白胶原域序列特征，以改善胶原蛋白水溶性和提高表达量为目的，利用蛋白质工程、分子生物学及基因重组技术，设计并人工合成了一段编码具高亲水性的Gly－X－Y三肽重复序列重组人源胶原蛋白的基因单体，采用同向串联方式，构建了含六个单体的蛋白将pPIC9KG6电转化巴氏表达载体pPIC9KG6，毕赤酵母（Pichiapastoris），经G418筛选得到高拷贝重组酵母基因工程菌；通过甲醇诱导表达［8］重组人源胶原蛋白。本文采用响应曲面法（Responsurfacemethodology，RSM）中的Box-22．1结果与讨论实验设计及结果BBD的因素水平见表1。用A、B和C分别代表初始诱导pH值、甲醇添加量和温度三个因素，设计了三因素三水平实验。按照5个中心点、12个析因点设计安排实验，共17个实验点，区域中心点即零点的重复多次是为了估计实验误差。实验方案及结果见表2。表1因素BBD的因素水平符号ABC水平－13．512605228+16．5330Behnken设计（BBD）优化摇瓶发酵表达重组人源胶原蛋白条件，为实现基因重组酵母工程菌发酵法制备重组人源胶原蛋白及其在医学材料领域的应用奠定基础。11．1材料与方法菌株pH值甲醇添加量%/24ht/℃重组巴氏毕赤酵母Pichiapastoris（GS115/［8］pPIC9KG6），His+，Mut+，本实验室构建。560表2试验号17pH值3．56．53．56．53．56．53．56．5555555555甲醇添加量/（%/24h）322222南京理工大学学报BBD实验设计及响应的预测和实测值t/℃2828282826263828282828·L－1）实际值/（mg16．2726．2420．5720．438．213．0817．5013．486．4611．159．1515．0829．3529．9229．9528．0230．87·L－1）预测值/（mg17．1322．3524．4619．577．477．0913．4914．226．348．0012．3015．2029．6229．6229．6229．6229．62第35卷第4期残差－0．863．89－3．890．860．74－4．014．01－0．740．123．15－3．15－0．12－0．270．300．33－1．601．25学生化残差－0．4802．179－2．1790．4800．414－2．2452．245－0．4140．0661．765－1．765－0．066－0．0850．0930．103－0．5020．3912．2实验数据统计分析以重组人源胶原蛋白表达量为响应值，回归拟合后各试验因子对响应值的影响用函数表示：R=a0+a1A+a2B+a3C+a4AB+a5AC+a6BC+a7A2+a8B2+a9C2（1）采用统计软件DX7Trial对实验数据进行多元得到二次回归方程模型（编码形式）：回归拟合，R=29．62+0．085A+1．14B+3．29C－2．53AB+0．28AC+0．31BC－4．32A2－4．43B2－14．74C2（2）实验方差分析及显著性检验结果见表3。表3BBD实验方差分析F值p值变异源平方和自由度均方显著性9141．6111．11660．0022*模型1274．48A0．0610．060．00450．9482B10．37110．370．81440．3968C86．53186．536．79260．0351*AB25．55125．552．00600．1996AC0．3110．310．02420．8808BC0．3810．380．03020．867078．52178．526．16430．0420*A282．48182．486．47500．0384*B22914．311914．3171．7756＜0．0001*C84．78328．2625．72290．0045*失拟4．3941．10误差总和1357．09162B2、在此实验中，自变量一次项C，二次项A、2和C显著（均p＜0．05），表明温度的一次项，初始诱导pH值和甲醇添加量的交互作用对重组人源胶原蛋白表达量的影响不显著（p＞0．05）。2方差分析中的确定系数R=0．9346，校正确定22系数RAdj=0．8505。RAdj可显示所选模型的拟合程Jogleker和度，即预测值与实测值之间的相关性，May建议一个拟合较好的模型R2至少应为0．80［10］，说明可用此模型拟合巴氏毕赤酵母发酵表达重组人源胶原蛋白的工艺过程，进行初步分析和预测。2．3因素水平优化巴氏毕赤酵母发酵表达重组人源胶原蛋白的响应面及对应的等高线图分别如图1～3所示。图1显示重组人源胶原蛋白表达量受pH值和甲醇添加量的交互影响。左图为pH值与甲醇添加量对重组人源胶原蛋白表达量的响应面图，右图为相应的等高线图。在所选定的水平范围内，保持A（pH值）为一定值，随着B（甲醇添加量）的增加响应R（重组人源胶原蛋白表达量）快速增大，达到峰值后又开始下降。同样，保持B为一定值，随R也出现先增大后减小的趋势。等高着A的增加，线近乎圆形，表明pH值与甲醇添加量之间的交互作用较弱，图示结果与表3数据分析结果相吻合。图2显示在选定的范围内保持A（pH值）为一定值，随着C（温度）的增加响应值R（重组人源胶原蛋白表达量）先增大到最大，随后又下降。同样R随A的变化趋势也如此。等保持C为一定值时，高线显示A与C的交互作用也不强，但相比于A和B却显著了很多，这个判断通过对表3的数据进pAB=0．1996）。行分析也可得出（pAC=0．8808，诱导pH值、甲醇添加量和温度的二次项对重组人源胶原蛋白表达量在统计学上具有显著影响；而初始诱导pH值和甲醇添加量的一次项及温度、初始总第179期刘斌郭红丽钮小松张小霞杨树林基因重组酵母工程菌优化表达人源胶原蛋白561图1pH值、甲醇添加量对重组人源胶原蛋白表达量的响应面（a）和等高线（b）图2pH值、温度对重组人源胶原蛋白表达量的响应面（a）和等高线（b）R也是呈现先图3显示随着B和C的增大，达到最大值后又下降的趋势。且由图中很明显可以看出温度对响应值R的影响显著，这与表3数据分析中温度的p值很小以及模型中温度因素的二阶影响系数很大相符。由图1～3及数据分析软件DX7Trial，可以得到三个因素的最优值分别为：初始诱导pH值4.95，诱导温度28．16℃，甲醇添加量2．16%/24h。在此组合下响应值R在试验区域内可达最优点，即重组人源胶原蛋白表达量最大，理论值为29．87mg/L。图3温度、甲醇添加量对重组人源胶原蛋白表达量的响应面（a）和等高线（b）5622．4模型适合性检验残差分析［9］南京理工大学学报第35卷第4期见图4。优化了内计学方法对该模型进行了显著性检验，找出了最佳条件，为利用优化的发酵在因素水平，条件指导在发酵罐中进行高密度发酵奠定了基础。由于毕赤酵母高密度发酵所采用的补料策略除上述已优化的参数外还可对底物有多种模式，（甘油和甲醇）的流加速率、流加时机、流加方式以及外加营养物的添加等进行优化，以实现重组人源胶原蛋白的高表达。参考文献：图4残差的正态概率图［1］YoungS，WongM，TabataY，etal．Gelatinasadeliveryvehicleforthecontrolledreleaofbioactivemoleculars［J］．JournalofControlledRelea，2005，109（1）：256－274．［2］LandoulsiJ，RoyCJ，Dupont-GillainC，etal．Synthesisofcollagennanotubeswithhighlyregulardimensionsthroughmembrane-templatedlayer-by-layerasmbly［J］．Biomacromolecules，2009，10（5）：1021－1024．［3］GimenezB，TurnayJ，LizarbeMA，etal．Uoflacticacidforextractionoffishskingelatin［J］．FoodHydro-colloids，2005，19（6）：941－950．［4］HeLirong，MuChangdao，ShiJiabo．Modificationofcol-lagenwithanaturalcross-linker，procyanidin［J］．Inter-nationalJournalofBiologicalMacromolecules，2011，48：354－359．［5］TakahiroAdachiT，WangXB，MurataT，etal．Productionofanon-triplehelicalcollagenachainintransgenicsilk-wormsanditvaluationasagelatinsubstituteforcellculture［J］．BiotechnologyandBioengineering，2010，106（6）：860－870．［6］ZhangC，BaezJ，GlatzCE．Purifcationandcharacteriza-tionofa44－kDarecombinantcollagenⅠα1fragmentfromcorngrain［J］．JournalofAgriculturalFoodChemis-2009，57：880－887．try，［7］BuechterDD，PaolellaDN，LelieBS，etal．Co-trans-lationalincorporationoftrans－4－hydroxyprolineintoJ］．TheJournalofBi-recombinantproteinsinbacteria［ologicalChemistry，2003，278（1）：645－650．［8］高力虎，杨树林，储卫华，等．类人胶原蛋白表达载．南京理工大体的构建及在毕赤酵母中的表达［J］2008，32（2）：252－256．学学报，［9］RaoKJ，KimCH，RheeSK．StatisticaloptimizationofmediumfortheproductionofrecombinanthirudinfromSaccharomycescerevisiaeusingresponsurfacemetho-dology［J］．ProcessBiochemistry，2000，35（7）：639－647．［10］JoglekarAM，MayAT．Productexcellencethroughde-signofexperiments［J］．CerealFoodsWorld，1987，32（12）：857－868．由图4观测值（重组人源胶原蛋白表达量）残差的正态概率图可以看出，图像总体呈一直线，没有发现异常值的存在，说明潜在的误差分布是近似正态的。图5残差与预测值的关系图说明未显现出任何明显的模式及异常的结构，证实了模型的正确性。图5残差与预测值的关系图2．5优化验证为验证上述优化结果，按照确定的最优条件，实际取初始诱导pH值为5．0，诱导温度为28℃，甲醇添加量为2．2%/24h，进行发酵表达，重复试验3次，重组人源胶原蛋白表达量的实测平均值为29．63mg/L，与模型的预测值29．87mg/L较为接近，进一步说明此回归模型的拟合程度较好。3结论外源基因在巴氏毕赤酵母表达系统中的高效表达，除受目的基因本身影响之外，外界环境因素pH、同样不可忽视，如培养温度、培养基成分、通气量、蛋白酶的降解、甲醇诱导的浓度和诱导时间等。因此选择合适的发酵条件，可有效提高表达产物得率，降低生产成本。实验采用响应曲面法Behnken设计建立了主要因素影响重组中的Box-人源胶原蛋白表达量的二次回归模型，并利用统

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