毕赤酵母表达操作手册(精译版)

2023年12月4日发(作者：落叶归根前一句是什么)

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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒

毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒

用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白

综述：

基本特征：

作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。

与酿酒酵母相似技术：

许多技术可以通用：

互补转化 基因置换 基因破坏 另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。

毕赤酵母是甲醇营养型酵母：

毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。

两种醇氧化酶蛋白：

毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。

表达：

AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+

RNA来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。

AOX1突变表型：

缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。

蛋白胞内及分泌表达：

外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分制作者：陈苗 商汉桥

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泌信号序列，利用酿酒酵母α因子前原肽信号序列也获得许多成功。

分泌表达外源蛋白的最大优点是：毕赤酵母只分泌很少的自身蛋白，加上毕赤酵母最小生长培养基中只有少量的蛋白，这意味着分泌的外源蛋白是培养基中蛋白的主要组成成份，也可算作蛋白纯化的第一步。注意，如果外源蛋白一级结构中有可识别的糖基化位点（Asn-X-Ser/Thr）,则这些位点可能发生糖基化。

翻译后修饰：

与酿酒酵母相比，毕赤酵母在分泌蛋白的糖基化方面有优势，因为不会使其过糖基化。酿酒酵母与毕赤酵母大多数为N-连接糖基化高甘露糖型，然而毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链8-14个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150个甘露糖残基）短得多。

另外，酿酒酵母核心寡糖有末端α-1,3聚糖连接头，而毕赤酵母则没有。一般认为酿酒酵母中糖基化蛋白的α-1,3聚糖接头与蛋白的超抗原性有关，使得这些蛋白不适于治疗应用。虽然未经证明，但这对毕赤酵母产生的糖蛋白不构成问题，因为毕赤酵母表达蛋白与高级真核生物糖蛋白结构相似。

选择载体用于基因多拷贝整合：

在某些情况下，毕赤酵母中重组基因多拷贝整合可增加所需蛋白的表达量。该试剂盒中的三个载体均可用于在体内（pPIC3.5K, pPIC9K）或体外（pAO815）产生并分离多拷贝插入，同时可检测增加重组基因的拷贝数是否增加蛋白表达量。体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。pPIC3.5K,

pAO815用于胞内表达，而pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利用AOX1启动子来诱导高水平表达。

多拷贝插入频率：

毕赤酵母His+转化子高拷贝整合事件自发发生的概率为1－10%，体内方法可筛选可能插入多拷贝外源基因的His+转化子，体外方法可通过连接构建多拷贝子。当选择His+转化子时，它们中插入体外构建结构多聚体的概率很高。

体内多拷贝插入的产生：

Ppic3.5k及Ppic9k含有细菌kan基因，赋予毕赤酵母遗传霉素抗性，注意Kan并不赋予毕赤酵母卡那霉素抗性。遗传霉素抗性水平主要依赖整合的kan基因的数目。单拷贝Ppic3.5k或Ppic9k整合入毕赤酵母基因组后，赋予毕赤酵母约0.25mg/ml的遗传霉素抗性水平。任何载体多拷贝整合可增加遗传霉素抗性水平，从0.5mg/ml（1-2拷贝）到4mg/ml（7-12拷贝）。由于kan基因与表达盒（pAOX1及目的基因）之间有遗传连锁，可从遗传霉素高抗性推断该克隆所包含多拷贝目的基因数。由于基因的剂量效益，蛋白的表达可能会增加。因此，kan基因可检测转化子是否含有多拷贝目的基因。下图显示多拷贝插入及kan基因与表达盒的连锁。

制作者：陈苗 商汉桥

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遗传霉素直接选择：

在酵母中对遗传霉素抗性进行直接选择并不十分有效，因为新转化的细胞需要时间表达足够量的抗性因子。由于酵母生长比细菌慢得多，大部分重组酵母在积累足够多的抗性因子

以抵抗平板上抗生素之前就已经被杀死了。最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先对HIS＋转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。

虽然可以用电泳进行直接筛选，但用在遗传霉素筛选之后再进行电泳筛选，获得含高拷贝克隆的机会更大，大约可获得5-9拷贝的克隆，而直接电泳选择只能获得平均为1-3拷贝的克隆。原生质转化时不能用遗传霉素直接选择。

体外多拷贝插入的产生：

下图显示如何产生多表达盒插入载体以转化毕赤酵母。目的基因插入独个EcoRI位点

后，产生的表达盒（pAOX1及目的基因）上下游侧翼分别为独个的BglII及BamHI位点。

含目的基因的pAOX815用BglII及BamHI消化以分离表达盒，表达盒再插入BamHI位点以产生串联重复表达盒，重复该插入程序可产生一系列含单个HIS4基因及逐渐增加数目表达盒的载体。

用体外形成的多拷贝子转化毕赤酵母增加了多拷贝表达盒重组子出现的频率，可设计包含一特定数目多拷贝插入的毕赤酵母重组子。

转化及整合：

可产生两个不同表型的His+重组菌株：质粒DNA线性化位置不同，转化GS115后可产生两种转化子His+Mut+及His+Muts。KM71只产生His+Muts，因为该菌株为Muts表型。两种重组子Mut＋及 Muts都是有用的，因为一个表型可能比另一个表型更有利于蛋白表达。理想条件下，每一个表型应该检测6-10个重组子。没有办法预测哪个结构或克隆更利于蛋白表达。强烈推荐用PCR分析重组子来证实整合情况。

成功将基因构建至AOX1启动子下游后，线性化质粒转化毕赤酵母时激发重组。下图显示用不同酶消化时产生何种重组子。

限制酶

SalI或StuI

SacI

BglII

插入事件

插入his4

插入5’AOX1

取代AOX1

GS115表型

His+Mut+

His+Mut+

His+Muts

KM71表型

His+Muts

His+Muts

His+Muts（不推荐）

制作者：陈苗 商汉桥

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表达及扩大培养：

用PCR证实毕赤酵母重组后，可检测His+Mut+及 His+Muts的表达。小规模培养每个重组子，用甲醇诱导，检测时间点.如果是胞内表达，每个时间点细胞沉淀用SDS-PAGE分析;如果是分泌表达，分析每个时间点的细胞及上清。如果有蛋白的抗体，推荐既用考马斯亮蓝染色又用western blot分析SDS-PAGE凝胶。如果可以,建议检测蛋白活性。因为并不是所有蛋白都能达到g/l的水平，所以建议进行western blot或活性分析，不要仅做SDS-PAGE考马斯亮蓝染色分析。

如何选择最佳的表达蛋白毕赤酵母菌株及优化诱导见P49-50。如表达已达最优，大规模表达以产生更多蛋白。

制作者：陈苗 商汉桥

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方法

毕赤菌株表型：

毕赤酵母菌GS115及KM71在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变,因而不能合成组氨酸，所有表达质粒都有HIS4基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。

GS115及KM71自发回复突变到His＋原养生物机率小于1/108。

KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因（arg4）有突变，在不含精氨酸的培养基中不能生长。用野生型ARG4基因破坏AOX1基因后，产生KM71 MutsArg+His-菌株。

GS115及KM71都可在复合培养基如YPD（YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长。转化之前，GS115及KM71都不能在最小培养基中生长，因为它们是His-。

KM71结构：

ARG4基因（约2kb）插入到克隆的野生型AOX1基因的BamHI(AOX1基因15/16密码子)及SalI(AOX1基因227/228密码子)位点。ARG4取代了AOX1基因16－227密码子。此结构转化至KM71亲本菌（arg4his4）中,分离Arg+转化子并分析Muts表型。Arg+转化子遗传分析显示野生型AOX1被aox1::ARG4结构所取代。

重点：

用KM71的优点是，不需要在甲醇最小培养基中筛选Mut表型。所有转化子都是Muts表型。第二，AOX1位点没有被完全缺失，理论上可用你的目的结构通过基因取代方法替换aox1::ARG4结构，这样重组菌株的表型是His+MutsArg-，这意味着重组菌株生长时需精氨酸。不幸的是，仅添加精氨酸并不能完全缓和arg4突变的影响，arg4菌株在含精氨酸的最小培养基中不能很好地生长。因此不推荐在KM71中通过取代aox1::ARG4结构来获得His＋转化子。

菌株表达对照：

GS115/His+Muts 白蛋白：该菌株为筛选毕赤酵母分泌表达转化子与Muts表型时的对照。血清白蛋白基因及其自身分泌信号被整合进毕赤酵母AOX1位点。该菌株可分泌白蛋白（67kDa）到培养基中，分泌水平＞1g/l。

GS115/His+Mut+ β－半乳糖苷酶：该菌株为筛选毕赤酵母转化子胞内表达与Mut+表型时的对照。β－半乳糖苷酶（lacZ）基因被整合进毕赤酵母his4位点，该菌株表达β－半乳糖苷酶（117 kDa），达到通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色或ONPG分析可测水平。

毕赤酵母菌株生长：

毕赤酵母生长温度为28-30度（液体、平板、斜面）。在32度以上诱导生长时，对蛋白表达有害，甚至会导致细胞死亡。

另外注意点有：

1在YPD中，处于对数期的Mut+、Muts毕赤酵母倍增时间为2小时

2除了在甲醇中生长速度不同外，Mut+、Muts生长速度没有差别

3甲醇培养基（MM）中，处于对数期的Mut+倍增时间为4-6小时

4甲醇培养基（MM）中，处于对数期的Muts倍增时间为18小时

51OD600=5×107细胞/ml

注意：生长特性依重组菌株不同而不同

制作者：陈苗 商汉桥

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在甲醇中生长：

当使用甲醇平板或培养基培养时，建议每天添加甲醇以补偿甲醇挥发及消耗。

1平板培养时，在倒置平板盖中加入100ul 100%甲醇

2液体培养时，加入100%甲醇至终浓度为0.5%

3部分研究者在进行液体培养时，对Muts菌株每天加甲醇至浓度为1%，对Mut+菌株每天加甲醇至浓度为3%时，对液体培养没有不良影响。

贮存：贮存细胞几周或几月，用YPD培养基或YPD琼脂斜面

1挑取所需菌株单克隆在YPD平板上划线生长

2挑取单克隆转移至YPD进行穿刺培养，30度2天

3细胞在4度可放几周

几月或几年，存于－80度

1挑取所需菌株单克隆在YPD中过夜培养

2收集细胞，在含15%甘油的YPD中悬浮至终OD600为50-100（大约2.5-5.0×109细胞/ml）

3细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80度。

注意：在4度或－80度长期保存后，用之前建议在MM、MD或MGY平板上划线培养以检测His+转化子的表型是否正确及其活力。

大肠杆菌菌株：

大肠杆菌菌株表型：提供 Top10F’以防没有合适的菌株。其它合适的菌株为DH5αF’，JM109或其它重组缺失菌株（recA），最好是endA，及带有选择性的F’附加体。Top10F’适用于重组及单链拯救。

如果不需进行单链DNA拯救，也可用不含F’附加体的大肠杆菌菌株。

建议：建议冻存Top10F’

1在5ml含50－100mg/ml四环素的LB中培养Top10F’过夜

2取0.85ml培养液加0.15ml灭菌甘油完全混匀

3转入冻存瓶中，冻在液氮或干冰/酒精浴中

4存于－80度

选择毕赤酵母表达载体：

选择载体：如果目的蛋白是细胞溶质型且是无糖基化蛋白，可选择胞内表达蛋白。如果目的蛋白是正常分泌、糖基化蛋白或直接分泌至胞内细胞器内，可尝试分泌表达目的蛋白。

建议用体内及体外方法产生并分离外源基因多拷贝插入子。无法预测哪种方法适用于你的蛋白，每种方法的优缺点如下：

体外方法 pAO815

优点

可构建特定数目的多拷贝子

大多数His＋转化子含有正确的特定数目插入

筛选多插入子很容易，因为大部分His＋转化子含有多拷贝目的基因

体外构建可以分析拷贝数对蛋白表达的影响

多拷贝插入位于单一位点

载体上无需另外的药物抗性标记

缺点

克隆特定数目多拷贝子需要更多工作

载体可能会很大，与基因大小及插入拷贝数有关

在中可能会发生重排

制作者：陈苗 商汉桥

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体外方法 Ppic3.5k或Ppic9k

优点

开始实验比较容易，转化毕赤酵母前载体中只需克隆单拷贝基因

1-10%的His＋转化子有自发的多拷贝插入

载体平均大小与其它毕赤酵母表达系统相似

多拷贝插入位于单一位点

缺点

定量筛选－遗传霉素抗性并不一定与基因拷贝数相关

筛选His＋转化子需要做很多工作，因为要从成千上万个His＋转化子中才能筛选到足够多的遗传霉素抗性克隆进行检测

多拷贝插入的数目不知（尽管可用southern 或dot blot分析方法进行检测）

遗传霉素筛选对细胞密度敏感，可能会分离到假阳性

特点：下表显示毕赤酵母多拷贝表达载体的一般特点及优点：

特点

5‘AOX1

段

α-factor

信号序列

MCS

TT

HIS4

编码α因子信号序列的269bp，用于毕赤酵母分泌表达（只能用于Ppic9k）

多克隆位点

描述

含AOX1启动子的约1000bp片优点

毕赤酵母中可实现甲醇诱导的高水平表达

分泌所需蛋白至培养基中

在表达载体中插入目的基因

AOX1基因自带的转录终止及mRNA有效的转录终止及多聚腺polyA信号（约260bp） 苷酸化

毕赤酵母野生型基因编码组氨为选择毕赤酵母重组菌株提供选酸脱氢酶（约2.4kb），用于与毕赤酵择标记

母his4菌株进行互补

AOX1基因序列，在TT3‘远端序列（约650bp）

Amp抗性基因

复制起始

质粒靶向整合进AOX1基因

用于选择、复制及维护

3‘AOX1

Amp

pBR322复制起点

BamHI

BglII

NotI

SacI

SalI

StuI

Kan

单一酶切位点 可线性化载体，使有效插入毕赤（StuI在Ppic3.5k或Ppic9k中不酵母基因组产生Mut+或Muts重组子

是唯一的）

来自Tn903的卡那抗性基因，赋通过增加的抗遗传霉素抗性，可予卡那基因抗性，赋予毕赤酵在体内筛选多拷贝插入子

母遗传霉素抗性（Ppic3.5k或Ppic9k） 在大肠杆菌中筛选Kan抗性菌株

在该试剂盒中，任何毕赤酵母表达载体都没有酵母复制起始位点。只有当质粒与毕赤酵母基因组发生重组时，才能分离到HIS＋转化子。

Ppic9k：含卡那基因，体内筛选多拷贝子插入，分泌重组蛋白至培养基中。在GS115及KM71中有功能。

制作者：陈苗 商汉桥

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1 9276bp融合载体

2 在α-factor分泌信号阅读框中含有用于克隆的4个单限制酶位点。SnaBI、EcoRI、AvrII、NotI

3 α-factor分泌信号分泌表达目的蛋白。表达时，目的基因必须克隆进信号序列起始密码的读码框中

毕赤酵母HIS4筛选

GS115或KM71，在AOX1基因处插入，用SacI线性化（对于GS115产生His+Mut+，对于KM71产生His+Muts）

在HIS4位点插入，用SalI线性化（对于GS115产生His+Mut+，对于KM71产生His+Muts）

在GS115菌株中，替换AOX1基因，用BglII线性化（产生His+Muts）

克隆进毕赤酵母多拷贝表达载体：

介绍：下面列出用这些载体进行克隆策略时应考虑的方针。考虑位点，如用Ppic9k载体，应考虑将目的基因克隆进α-factor信号序列读码框中。

建议将3个超螺旋毕赤酵母表达载体转化，以便长期保存。

1用灭菌水或TE缓冲液稀释1ul质粒（1ug/ul）至10-100pg/ul

2取1-2ul稀释质粒转化感受态，在含50-100 ug/mlAmp的LB平板上选择

一般考虑：下面是应用pAO815、 Ppic3.5k或Ppic9k时的一般考虑

1毕赤酵母的密码偏爱与酿酒酵母相同，已证明许多酿酒酵母中基因在毕赤酵母中有交叉功能

2应在含recA, endA突变的菌株如Top10F’中构建质粒

3AOX1mRNA的5‘末端在各多克隆位点都已标注出。如需分析RNA，可计算插入基因mRNA的大小

4插入基因的终止密码子或3‘AOX1序列可使翻译有效终止，3‘AOX1序列终止密码已标注出

制作者：陈苗 商汉桥

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5在毕赤酵母及其它真核系统中均发现了“AT富含区”导致的转录提前终止。如果表达蛋白时出现问题，应检查是否是提前终止及AT富含区。如要表达基因则需改变基因序列。

6Ppic9k中预测的蛋白酶裂解位点如图（p28）所示

7插入成熟基因的开放阅读框，应克隆进α-factor信号序列读码框的下游

一般克隆策略：

1连接适合的限制性片段

A直接插入MCS上两个不同位点

B利用相同的限制性末端，将片段连入单个合适位点

2PCR扩增插入基因以产生合适的用于连入合适载体的限制性末端

3扩增含目的基因片段通过TA克隆盒进行直接克隆，再将合适的片段亚克隆进所选择载体

克隆程序：

注意：如果你要插入pAO815上EcoRI位点，而基因中也含有EcoRI位点，我们建议：

1BsaI可识别以下的限制性识别位点：

5‘GGTCTCN/

3‘CCAGAGNNNNN/

2将EcoRI位点改造成BsaI可识别位点

5‘GGTCTCG/AATTC……

3‘CCAGAGCTTAA/G……

3将该序列通过PCR整合进DNA片段中，或在体外制造其它限制性位点的适配子接头

4用BsaI消化PCR产物或适配连接产物，这样不用EcoRI消化就可产生EcoRI的限制性末端。

信号序列加工：Ppic9k中α-factor成熟信号序列加工分两步：

1KEX2基因产物初步切割信号序列，在 Glu-lys-arg*glu-ala-glu-ala中星号位置即arg及glu之间出现Kex2断裂

2STE13基因产物接着切割Glu-Ala重复序列

优化信号切割：酿酒酵母中，Glu-Ala重复序列并不是Kex2切割时的必需序列，但Glu-Ala重复序列可使该切割更有效。

Glu-Lys-Arg-X-序列中，在X位置上有许多氨基酸都可替代Glu，如芳香族氨基酸，小氨基酸及组氨酸。但脯氨酸会抑制Kex2的切割。

许多情况下，Stel13切割Glu-Ala重复片段效率不高，Glu-Ala重复序列就留在了表达的目的蛋白的N端，这一般与目的蛋白本身性质有关。

细菌转化：一旦确定克隆策略，在进行连接反应前应制备好感受态，可参考电感受态或化学感受态方法或使用本实验室实验程序。

Ppic9k的pAOX1及MCS:

特殊考虑：

1目的片段必须克隆进分泌信号序列开放阅读框中

2信号序列中含ATG，翻译从离mRNA5‘端最近的一个ATG开始

3如果插入片段中有BglII位点，毕赤酵母转化时，可选取其它限制性位点来线性化质粒(P30)

制作者：陈苗 商汉桥

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转化：

介绍：连接反应之后，要通过化学或电转的方法转化感受态细胞(Top10F’或相似菌株)

转化分析：

1转化后，将转化混合物涂在含50-100ug/ul Amp的LB平板上，选择Amp抗性克隆

2挑取10个Amp抗性转化子，接种含50-100ug/ul Amp的培养基，37度振荡培养过夜

3小量制备分离质粒DNA用于分析及测序。pAO815或pPIC3.5k测序时，用5‘AOX1及3‘AOX1测序引物；pPIC9k测序时，用α-factor引物及3’AOX1测序引物。将引物重悬于20ul灭菌水中，制成0.1ug/ul溶液。

4在0.85ml过夜培养菌液中加入0.15ml灭菌甘油，以便保存所需克隆，涡旋混匀转入标记好的储存管中。在液氮或干冰/酒精浴中冷冻后移入-70度保存。

5测序证实结构正确后，可准备转化DNA

重组克隆测序：强烈建议转化毕赤酵母前进行测序

1正确读码框(分泌表达)

2真核翻译起始所需的ATG正确的上下文

制作者：陈苗 商汉桥

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克隆基因后：克隆进pAO815后，需在体外构建多插入子

如果克隆进Ppic3.5k或Ppic9k，可准备将质粒DNA转入毕赤酵母。转p28

准备转化DNA：你应该已经获得正确插入目的基因的毕赤酵母表达载体质粒，以用于表达。下表列出下阶段应做的实验。

步骤

1

2

3

4

5

6

7

8

实验

准备转化用DNA

GS115或KM71用于制备去壁细胞

DNA转化GS115或KM71

选择His+转化子

如果将基因克隆进Ppic3.5k或Ppic9k，筛选His+转化子的遗传霉素抗性

证实重组菌的Mut+Muts表型

PCR鉴定基因是否存在

检测基因表达

页数

28-30

31-34

35-36

35

37-40

41-43

70-71

44-48

建议同时分离His+Mut+及His+Muts毕赤酵母转化子，因为很难预测哪种结构更利于蛋白表达。通过线性化DNA 5‘AOX1区或HIS4基因及使用GS115（Mut+） 或KM71（Muts）菌株，可方便地分离到Mut+及 Muts重组子。每次转化时使用约10ug线性化DNA。

质粒DNA准备：用于毕赤酵母转化的质粒DNA起码纯到可以做酶切，DNA越纯，转化效率越高。建议用S.N.A.P MiniPrep Kit来准备质粒DNA用于常规毕赤酵母转化，质粒DNA也可通过碱裂解、酚：氯仿抽提及乙醇沉淀来获得。

线性化质粒DNA：建议使用下列方法线性化载体以获得Mut+及 Muts重组子，可能其中一个会比另一个更利于表达多拷贝重组子。如果只想得到Muts重组子，使用KM71菌株。单个十字交换事件可比双重十字交换更容易、更有效地获得Muts重组菌（例如：插入AOX1或his4而不是取代AOX1）。如果插入片段含有下列任何限制性位点，见p29-30以替换位点。

1如果克隆进Ppic3.5k，线性化时，

插入AOX1用SacI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts)

插入HIS4用SalI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts)

2如果克隆进pAO815，线性化时，

插入HIS4用SalI或StuI（GS115, Mut+ 或KM71, Muts）

注意如果用pAO815载体，插入2个或更多拷贝子会产生SacI酶切位点

3如果克隆进Ppic9k，线性化时，

插入AOX1用SacI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts)

插入HIS4用SalI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts)

程序：

1酶切新构建载体及亲本载体。将亲本载体转入GS115或KM71用作表达的背景对照

2凝胶分析酶切产物以确定是否酶切完全。如酶切不完全，转化数及靶向效率都会降低

3用酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提酶切产物，乙醇沉淀DNA，用10-20ulTE缓冲液重悬。不需要将目的基因片段从线性化质粒中分离纯化出来。

4贮存于-20度直至转化

替换酶切位点：下表列出线性化载体转化毕赤酵母时的可替换酶切位点。

注意Ppic9k中Kan基因中含StuI位点，而HIS4上的StuI位点则被去除。

制作者：陈苗 商汉桥

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对照：建议转化毕赤酵母时用以下对照：

1亲代载体与重组载体以相同方式进行酶切，可在用PCR证实整合时作对照，还有表达分析及定量dot blot或southern分析时作为背景对照。

2含有单拷贝目的表达盒的pAO815、Ppic3.5k及Ppic9k。以与多拷贝子同样方式线性化pAO815载体。

大多数通过转化重组Ppic3.5k或Ppic9k而得到的His+重组子只含有单拷贝插入。确保你挑取的转化子只能抗0.25mg/ml遗传霉素。pAO815、Ppic3.5k及Ppic9k单拷贝对照应与正检测的假定多拷贝重组子具有相同的Mut表型。这些单拷贝重组子可作为与多拷贝子进行表达比较的参照，也可作为定量dot blot及southern分析时的参照。这是非常重要的参数，因为目的基因拷贝数的增加并不一定会增加重组蛋白的表达量。

培养毕赤酵母用于制作原生质细胞：

介绍：一般，对大多数的研究者来说，原生质细胞及电转是效率最高的转化方法（103-104转化子/ugDNA）。毕赤酵母同样可用PEG1000（P68）或LiCl（P69）进行转化。这两种方法，特别是LiCl方法不如原生质法及电转化方法。如果没有电转化装置，建议使用原生质细胞法或PEG1000法。毕赤酵母的转化效率不如酿酒酵母的转化效率高。

原生质细胞的解释：毕赤酵母细胞壁阻止摄入DNA，有必要去除部分细胞壁以吸收DNA。藤黄节杆菌酶是一种葡聚糖酶，可在细胞壁水解葡聚糖的β－1,3接头，还可部分地消化细胞壁。该方法的关键在于不能过度消化细胞壁，否则会导致细胞死亡。藤黄节杆菌酶消化能力受细胞对SDS敏感性的影响。等量细胞加入SDS，以产生原生质细胞，该步的结果是溶液变澄清，其澄清度可由800nm处的吸光值获得。

一般经验，获得70%原生质细胞时，消化程度较好。用等渗溶液清洗细胞除去酶并与DNA共孵育。将细胞重悬于山梨醇溶液中，细胞壁再生后再铺板。

准备：制备下列溶液，存于4度。

YPD（Yeast Extract Peptone Dextro）培养基 1L

YPD平板 1L

RDB（Regeneration Dextro Ba） 平板 1L

RDHB（Regeneration Dextro Histidine Ba） 平板 1L

转化当天，配制下列试剂：存于4度

5% SDS溶液

制作者：陈苗 商汉桥

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RD（Regeneration Dextro） 融化琼脂 100ml

溶液：细胞去壁及转化试剂

1M 山梨醇

SE: 1M 山梨醇, 25mM EDTA pH8.0

DTT: 用水配制成1M浓度

SCE： 1M 山梨醇, 1mM EDTA , 10mM 柠檬酸钠缓冲液 pH5.8

CaS: 1M 山梨醇, 10mM Tris-HCl pH7.5, 10mM CaCl2

藤黄节杆菌酶：用水配制成3mg/ml的浓度

40%PEG：用水配制40%（w/v）PEG3350(试剂纯)

CaT: 20mM Tris pH7.5, 20mM CaCl2

SOS: 1M山梨醇, 0.3×YPD, 10mM CaCl2

每次转化时配制：

SED：19mlSE加1ml 1M DTT

PEG/CaT: 1:1混合40%PEG及CaT

程序：

1在YPD平板上划线培养GS115或KM71,28－30度培养2天，以得到分散的单克隆。

2在50ml离心管或100ml摇瓶中，从GS115或KM71平板上挑取单个克隆接种10ml

YPD，28－30度剧烈振荡（250-300rpm）过夜。该培养基可在4度保存数天。

3在3个500ml培养瓶中加入200mlYPD，分别取5、10及20ul第2步中的细胞，于28-30度剧烈振荡（250-300rpm）过夜

4第二天早上，将试剂盒中的转化溶液（SE，SCE，灭菌水，SOS，PEG，CaS,1M山梨醇），RDB平板（用于转化）、RDHB平板（活力对照），放置于室温下。

5测每个培养瓶中的OD600值

6收集OD600值为0.2-0.3瓶中的细胞，室温，1500g离心5-10min。去除上清，接下去准备细胞去壁

注意：如果培养基都超过0.3，选择一个培养基，用新鲜培养基以1：4稀释，28-30度孵育直至OD600值至0.2-0.3（2-4小时）。收集细胞如第6步

准备细胞去壁：取得上述第6步细胞

1取100ml融化的RD琼脂糖，存于45度

2解冻1管1M DTT

3为该次去壁细胞试验准备新鲜的SED

无菌条件下，将19mlSE转入合适的灭菌容器中（如50ml离心管），加1ml 1M DTT混合均匀，为得到最好的效果，SED现配现用

注意：DTT的质量及新鲜度是成功制备去壁细胞的关键，1M DTT分析纯，-20度保存。

洗涤细胞：

1用20ml灭菌水悬浮洗涤细胞，转入灭菌的50ml的离心管中

2室温1500g 离心5min，收集细胞

3将细胞重悬于20ml新鲜的SED中洗涤，如2离心

4用20ml 1M 山梨醇洗涤，离心如2

制作者：陈苗 商汉桥

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5用20ml SCE缓冲液重悬细胞，将悬液分至两个50 ml离心管中(10ml/管)

6取1管藤黄节杆菌酶置于冰上，轻弹管壁以混匀，藤黄节杆菌酶以浆液的形式存在，无需配成溶液，将它混匀以确保每次的量是相等的。

加入藤黄节杆菌酶：可先取一管细胞来确定用藤黄节杆菌酶消化细胞的最佳时间，一旦确定时间，取另一管细胞进行裂解。藤黄节杆菌酶消化细胞壁，使细胞变脆，拿样品时要轻柔些，加入藤黄节杆菌酶后，即开始消化细胞壁。

*准备至少20ml 5%SDS溶液

*将分光光度计调至800nm处，用800ul 5%SDS及200ul SCE作空白

*准备10个灭菌离心管，编号0，2，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，45，50

1取5步中一管细胞，取出200ul加入标0的管中，置于冰上，此即0点

2加7.5ul藤黄节杆菌酶到该管剩余细胞中，轻轻颠倒混匀，30度孵育，不要晃动样品。该样品可用于建立细胞去壁最佳时间表。将另一管细胞置于室温，用于第六步。将剩余藤黄节杆菌酶放于冰上。

3监测去壁细胞的形成：2min时，取200ul步骤2中的悬浮细胞，加入标2的管中。在t=4,5,6,,,50min时，重复上述操作，读样品OD800值

4用公式确定每个时间点时去壁细胞的形成比例：

%去壁率=100-［(时间t时OD800值/时间0时OD800值)×100］

如t=0时，OD800=0.256， t=15时，OD800=0.032

计算：%去壁率=100-［(0.032/0.256)×100］=100-［(0.125)×100］=100-12.5=87.5%

5确定去壁率为70%时的时间，藤黄节杆菌酶的用量不同，最佳时间也各不相同。Invitrogen 实验室的最佳去壁时间为15-40min。

注意：确定获得所需量去壁细胞的最小时间很重要，藤黄节杆菌酶消化时间过长，对细胞有害，效率会降低。

6在另一管中加入7.5ul藤黄节杆菌酶(如步骤1)，将管放于30度，时间为步骤5中建立的最佳时间，以获得最佳比例70%的去壁细胞。

7室温750g离心10min，收集去壁细胞，去除悬浮液

8用1M山梨醇洗去壁细胞1次(轻叩管壁以分散去壁细胞团，不要涡旋)。如上离心

9用10ml CaS洗涤去壁细胞，如7中离心，用0.6mlCaS重悬细胞。去壁细胞必须立即(至多30min)用于转化。不能放更长时间，这些细胞共可作6次转化

转化毕赤酵母：

开始前：将RDB平板放于室温，准备好融化的RD上层琼脂，取出线性化DNA置于冰上

GS115中，用SalI,StuI或SacI线性化的DNA可分离His+Mut+重组子

KM71中，用SalI,StuI或SacI线性化的DNA可分离His+Muts重组子

亲代载体用相同酶线性化

对照包括无DNA，线性化PBR322DNA及质粒(无细胞)涂板来检测是否有污染

程序：

1取上述9中100ul去壁细胞到1.5 ml灭菌的有盖管中

2取10ugDNA，室温孵育10min

3同时配制PEG/CaT溶液，计算所需用量，加入等量的40%PEG/CaT(1:1)

4加1ml新鲜的PEG/CaT溶液至细胞与DNA混合物中，轻轻混匀，室温孵育10min

制作者：陈苗 商汉桥

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5室温750g离心10min，小心抽吸PEG/CaT溶液，颠倒管，轻叩管壁以排出多余的PEG/CaT溶液。

6用150ulSOS培养基悬浮转化细胞，室温孵育20min

7加入850ul1M山梨醇，接下来涂板

涂板：毕赤酵母去壁细胞需要铺在顶层琼脂糖或琼脂上，以防止在选择前被裂解

1接第7步，取100-300ul去壁细胞-DNA，与10ml融化的RD琼脂糖混匀倒于RDB平板上，直至上层琼脂变硬。注意，确保有足够的去壁细胞-DNA铺第二板，第三板

2倒置平板，28-30度孵育，转化子会在4-6天内出现

3细胞活性：用100ul去壁细胞加入900ul 1M山梨醇

4取稀释样本100ul，加入10ml融化的RDH，铺在RDHB平板上，等上层琼脂凝固

5倒置平板，28-30度孵育，4-6天出现克隆，表明去壁细胞可再生成分裂细胞

His+转化子分析：如用Ppic3.5k及Ppic9k构建载体转化毕赤酵母，接着做体内筛选多插入子

如用pAO815构建载体转化毕赤酵母，筛选Mut+及Muts转化子

评价转化试验：使用去壁细胞，一般转化效率为103-104His+转化/ugDNA，在无DNA、线性化PBR322及只有质粒(无细胞)平板上应均无克隆。

功能分析筛选：有些研究者通过功能分析直接检测高表达毕赤酵母重组克隆，而不进行Mut+及Muts表型筛选。检测完高表达后，最好也检测Mut表型，这可帮助你优化重组克隆的表达。

体内筛选多插入子：

介绍：His+转化子越多越好，因为只有1-10%His+转化子可能含有多拷贝插入。这意味着，如果多拷贝插入概率为1%，你必须筛选1000个克隆，才能得到10个高遗传霉素抗性克隆，这需要1-5个含His+转化子的平板。筛选数以千计的克隆并不罕见。如果有抗高遗传霉素抗性的克隆，可检测重组蛋白的表达(P44)，或者检测Mut表型(P41)。

筛选遗传霉素抗性转化子方法：

一、技术上简单，可筛选大量克隆，但不那么可信。筛选HIS+转化子后，将它们集中起来，铺在遗传霉素浓度逐渐升高的YPD平板上，可应用于去壁细胞及电转化方法。

二、技术上较难，只可筛选少量克隆，但更可信。每个克隆在微量测定板上生长至浓度一致，将培养基点到YPD-遗传霉素平板上计算抗遗传霉素抗性。

注意：用遗传霉素筛选可能会有假阳性。划线挑取假定的抗遗传霉素单克隆，然后在YPD-遗传霉素平板上进行证实很重要。如果你真的选择复制平板，一定要证实遗传霉素抗性。

开始前：准备10个YPD平板，每个的遗传霉素浓度为0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0及4.0mg/ml。

(去壁细胞)方法1：从含HIS+转化子的平板开始

1用灭菌刮片将含有HIS+转化子的顶层琼脂最上层刮下，放入无菌的50ml离心管中。

2加入10-20ml灭菌水，量应为琼脂的两倍，剧烈振荡1-2min

3将离心管置于管架上，让琼脂沉淀(1min)

4用血球计数计确定上清中细胞浓度。至少要5×105细胞/ml，那样在200ul或更少溶液中可含105个细胞。(如果太稀，可将液体转入另一管中，离心细胞，再用适量灭菌水重悬至5×105细胞/ml)

5每块含遗传霉素的YPD平板涂105细胞。每个浓度用四块板。

制作者：陈苗 商汉桥

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(需要证实在没有遗传霉素的YPD板上细胞的滴度，计算每个遗传霉素抗性平板上抗遗传霉素克隆的比例，以确定你所得到的多拷贝子是否占平板上转化子的1-10%，将收集的转化子稀释到10-5，10-6，10-7浓度，每板加100-200ul)

6在30度孵育平板，每天检查。抗遗传霉素克隆需2-5天出现，不含遗传霉素的YPD平板上克隆需2-3天出现。接下来做结果分析。P39

(电转化)方法1：电转化毕赤酵母时用以下程序。转化子不需要铺在上层琼脂。从含HIS+转化子平板开始。

1吸取1-2ml灭菌水于所有HIS+转化子平板上

2用灭菌刮子重悬HIS+转化子，不要划破琼脂

3将细胞悬液集中转移至灭菌的50ml离心管中，稍涡旋(5-10S)

4用分光光度计测定浓度(1OD600=5×107细胞/ml)

注意：混有琼脂会干扰读数

5在每块含有遗传霉素的YPD平板上涂105细胞。

(需要证实在没有遗传霉素的YPD板上细胞的滴度，计算每个遗传霉素抗性平板上抗遗传霉素克隆的比例，以确定你所得到的多拷贝子是否占平板上转化子的1-10%，将收集的转化子稀释到10-5，10-6，10-7浓度，每板加100-200ul)

6在30度孵育平板，每天检查。抗遗传霉素克隆需2-5天出现，不含遗传霉素的YPD平板上克隆需2-3天出现。接下来做结果分析。P39

注意：如果在以上方法里你将所有细胞都悬浮，加15%灭菌甘油，存于-80度，可在以后时间里做遗传霉素抗性筛选。

方法2：需要三组各两块微量测定板(共6块)来筛选180个HIS+重组子。通过持续接种，得到相同浓度的克隆子，以确保遗传霉素平板上细胞数相等。如将转化子铺于顶层琼脂中，有必要从琼脂上收集细胞，重新涂最小组氨酸平板(P42)以收集克隆。记住要有菌株背景对照及单拷贝基因对照。每180个克隆，可选择出1-10个抗遗传霉素克隆。

1无菌条件下，在每个微量测定板上加入200ul YPD

2用灭菌牙签在第一组平板中每孔接种单个HIS+转化子，轻轻搅动以悬浮细胞

3盖住微量测定板在30度孵育2天(不需摇动)

4 2天后，取新的微量测定板，加入190ulYPD

5用多道移液器吸取10ul培养液于第二组测定板中，确保第二组板标记好并放置好，这样可指示细胞所在孔。

6盖住第二组板，30度孵育过夜

7第二天，在第三组测定板上重复第5,6步

注意：持续生长及传代可使克隆达到相同细胞浓度

8孵育后，取第三组板，用100ul多道移液器上下吹打重新悬浮细胞

9取10ul每孔中液体点在含遗传霉素浓度为0，0.25，0.5……4.0mg/ml的YPD平板上。用多道移液器或在平板底下划线，确保以规则方式排列。

10待液体吸收，将板放于30度，2，3，4，5天后检测抗遗传霉素克隆，接着分析结果。

结果分析：可能只有少数的抗遗传霉素克隆，大小可能也不一样，但克隆形态上应一致。挑取抗遗传霉素克隆，划线培养纯化，挑取单克隆，确保记录抗遗传霉素的水平。

可能在2.0，3.0，4.0mg/ml遗传霉素平板上找不到克隆，因为抗如此高遗传霉素的“头彩”克隆很少见。需要筛选数以千计的HIS+转化子以分离抗2-4mg/ml遗传霉素的克隆。

因为不能保证多拷贝克隆会确实增加蛋白表达量，许多人选择直接表达来看是否有克隆制作者：陈苗 商汉桥

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可大量表达蛋白。确保有单拷贝插入作为对照，检测所有抗遗传霉素抗性克隆的Mut表型(P41)，以期进行正确诱导表达。

确保划线纯化单克隆，并加入甘油冰冻保存遗传霉素抗性克隆，每次从冻存样本中挑菌开始表达研究而不是从老的平板上挑菌。

确定拷贝数目：如果发现抗遗传霉素HIS+重组子明显大量表达蛋白，你可能想要知道基因拷贝数。可用southern blot 或dot blot 分析拷贝数(P74)。转化空载体或含单拷贝基因载体的毕赤酵母重组菌基因组DNA也非常重要，可作为实验的对照。

解决问题：因为有可能挑取假阳性(看起来可抗高浓度遗传霉素，其实并不是)，纯化假定的遗传霉素抗性克隆，并证实其所抗遗传霉素的水平非常重要。

体内方法另一个普遍的问题是，只能分离少数遗传霉素抗性克隆，这意味着需要筛选更多的HIS+转化子。记住你正分离的多拷贝插入事件，它发生的概率为1-10%，这意味着需筛选数以千计的克隆而不是区区几百个。另外，为分离含较多拷贝插入基因的重组子，需要筛选更多的HIS+转化子。连续的多拷贝插入更是少见。

如果你的转化效率很低，尝试用电转化替代去壁细胞方法。这样可增加转化效率，帮助你分离更多HIS+转化子。

筛选Mut+及Muts 转化子

介绍：此处，你可分析HIS+转化子的Mut+及Muts表型。试剂盒中有两个菌株可提供Mut+及Muts表型对照。GS115 Albumin是Muts表型，GS115 β-gal是Mut+表型。HIS+ KM71重组子不需要筛选重组子表型，因为它们都是Muts表型。

记住要用两个对照菌株作为毕赤酵母蛋白表达的背景：一个对照即亲本质粒线性化产生HIS+ Muts转化子，另一个对照是亲本质粒线性化产生HIS+ Mut+转化子。

在GS115中筛选HIS+ Mut+转化子：用SalI或StuI线性化质粒转化GS115后，大多在HIS4位点上发生重组，大多数转化子是Mut+表型；然而由于质粒含有AOX1基因序列，有可能在AOX1位点发生重组，破坏野生型AOX1基因，产生HIS+ Muts转化子(P66)。在MD及MM平板上检测可证实HIS+ Mut+转化子。

在KM71中筛选HIS+ Muts转化子:转化KM71的HIS+转化子都是Muts，因为AOX1基因被破坏(aox::ARG4)。不需要检测重组子Mut表型，所有都是Muts。SalI或StuI线性化质粒转化KM71在HIS4位点重组，SacI线性化质粒在AOX1基因5’区重组。HIS+重组子需在不含组氨酸的平板上纯化后再进行表达。

准备：下列培养基可提前准备存于+4度

最小葡萄糖(MD)琼脂板 1L

最小甲醇(MM)琼脂板 1L

灭菌牙签及筛选平板 (P43)

在MD，MGY平板上划线培养GS115 Ablumin(HIS+ Muts)及GS115β-gal HIS+ Mut+，作为Mut+或 Muts在MD或MM平板上生长的对照。

筛选GS115/HIS+ Mut+ 或HIS+ Muts：筛选HIS+转化子的Mut+或 Muts表型

1用灭菌牙签挑取单克隆，在MM及MD平板上以一定的方式划线或点HIS+转化子，确保先在MM平板上点

2每个克隆换一次牙签，点100个转化子后再继续向下做(约2-3板)

3为分离Mut+及Muts表型，在MD及MM平板上各点上对照(GS115/HIS+ Muts Ablumin及GS115/ HIS+ Mut+β-gal)

4 30度孵育2天

制作者：陈苗 商汉桥

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5两天后，计数平板，寻找在MD平板正常生长而在MM平板上生长很小或不长的菌株。

注意：建议纯化HIS+转化子，确保分离的是单克隆，这可在检测Mut表型前后进行。

复制平板程序：该程序错误分离的概率较小，但分离的程序要增加2天，需要仪器复制平板。

制作者：陈苗 商汉桥

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1用灭菌牙签，在MD平板上(2-3板) 点100个HIS+转化子，点GS115/HIS+ Muts Ablumin及GS115/ HIS+ Mut+β-gal在MD上作对照。

2在28-30度孵育2天

3两天后，复制平板至新鲜的MM、MD平板，筛选Muts

4 28-30度孵育复制平板2天

5在28-30度孵育两天后，计数复制平板，查找在MD平板上正常生长而在MM平板上长得小或不长的菌落。每块板上的HIS+Mut s及 HIS+Mut+对照菌落，可作为Muts及 Mut+表型的参照。

转化子更简单的选择方法：由于铺在上层琼脂，导致转化子中有些在上层有些则包埋在琼脂里，无法挑取克隆。下列程序可进行转化子选择，直接将它们铺于板上，而无需用上层琼脂。

1用灭菌刮子刮取含HIS+转化子的琼脂置于灭菌的50ml离心管中，加入20ml灭菌去离子水，剧烈涡旋重悬细胞

2用4层干酪包布过滤上清，室温1000g离心5min。细胞在底部，残留的琼脂在细胞上方

3仔细去除琼脂，轻轻晃动管子，使琼脂颗粒分散于水中，弃去含琼脂的上清。

4用5ml灭菌去离子水重悬细胞，用小超声头，20-30%输出功率下超声细胞10秒，只将细胞超声分散而不是裂解细胞。

5将细胞稀释至104，在MD平板上铺50-100ul。30度孵育过夜。选择方法进行Mut表型筛选。

重组酵母菌表达：

介绍：确定目的基因表达的最优方法及条件，下面为毕赤酵母表达因素及指导，因为对于任何表达系统，最优化条件因表达蛋白的特征而不同。

培养基：需要BMGY/BMMY(缓冲复合甘油或缓冲复合甲醇培养基)BMG/BMM(缓冲最小甘油或缓冲最小甲醇培养基)MGY/MM(最小甘油或最小甲醇培养基)进行表达(P60)。BMG,BMM,BMGY,BMMY用于分泌蛋白表达，特别是当PH对蛋白活性比较重要时。它们是缓冲培养基，这与MGY、 MM不同。这四种培养基用磷酸盐缓冲，PH值在一个较大的范围内，可用于蛋白优化表达。BMGY/BMMY含酵母浸出物及蛋白胨，可稳定分泌蛋白，阻止或减少分泌蛋白的分解。酵母浸出物及蛋白胨作为“混合饲料”，使生长更好并可积累大量表达产物。

蛋白酶：有些蛋白特别易受在中性PH值时有很好活性的蛋白酶的影响。在这种情况下，建议用MGY，MM培养基，因为当毕赤酵母在无缓冲培养基如MM中表达时，PH降至3或更低，许多中性PH蛋白酶都将失活。毕赤酵母对低PH值有抗性，因此低PH值不会影响生长。与此相对的是，有报道称加入1%酪蛋白氨基酸(Difco)并将培养基PH值缓冲至6.0，胞外蛋白酶受抑制，增加了小鼠表皮生长因子的表达。

如果你的目的蛋白对中性PH蛋白酶敏感的话，可在无缓冲培养基(MM)中表达。如果没有证据证明你的分泌蛋白对中性PH值蛋白酶敏感，建议开始表达时用BMMY。如果表达蛋白降解了，尝试在无缓冲培养基中进行表达。

如果以上条件仍不能有效防止蛋白降解，可将基因转入SMD1168中，该菌株表型是his4pep4，缺失了蛋白酶，转化与表达程序与GS115相同，也可用于大规模发酵。

制作者：陈苗 商汉桥

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换气：毕赤酵母高效表达的重要因素是在甲醇诱导时充分换气。基本上在诱导时，培养基不要超过摇瓶体积的10-30%。建议使用隔板摇瓶，用2-3层干酪包布或松散合适的盖子盖住摇瓶，不要用很紧的盖子。(换气在诱导前大量培养时并不那么重要)

生长动力学：当Mut+及Muts在YPD或甘油培养基中生长接近相同速度时，加入甲醇，由于AOX1基因产物的产生，Mut+将比Muts生长快。

温度及振荡：所有表达需在30度的摇床中进行。温度不能超过30度很重要，如果摇床温度不稳，设置在28度。使用落地式摇床，速度为225-250rpm，如果为台式摇床，速度调至250-300rpm。

开始前：先证实重组子及对照重组子(无插入，1拷贝插入)在GS115或KM71中的表达情况。进行表达时，选择合适的对照很重要，可以更好地解释你的表达结果。表达对照如下：

GS115/HIS+ Muts Ablumin Muts分泌表达对照

GS115/ HIS+ Mut+ β-gal Mut+胞内表达对照

GS115或KM71/载体(无插入) 背景对照

GS115或KM71/载体(1拷贝插入) 单拷贝基因表达水平对照

不同的重组形式均会影响表达，建议挑取6-10个克隆进行表达水平筛选。从最新的平板上挑取克隆。克隆子活力随时间而下降，如果有任何怀疑，最好划线纯化菌株。(也可以从冻存的甘油菌中取部分进行培养)

表达指导：下面信息有关如何开始表达，可能需要改变条件来表达不同蛋白，如可能使用底隔板或边隔板摇瓶。如果分析许多重组子，可用50ml离心管。为确保有效换气，可增加摇瓶速度或将离心管以一定角度置于摇床中。

Mut+胞内或分泌表达：为检测表达条件是否有效，可培养GS115β-gal (Mut+)(胞内表达-半乳糖苷酶)。亲代载体转化GS115或KM71作为胞内表达背景对照。

1挑取单克隆，接种至25mlMGY，BMG或BMGY中，(250ml摇瓶)，28-30度，250-300rpm摇至OD600=2-6(对数生长，大约16-18小时)

2室温1500-3000g离心5min，收集细胞，去除上清，用MM，BMM或BMMY重悬细胞至OD600=1.0，进行诱导表达(大约100-200ml)

3在1L摇瓶中加入上述培养物，加盖两层灭菌纱布或干酪包布，放入摇床继续生长。

4每24小时，加甲醇至终浓度为0.5%以继续诱导。检查培养基的量，确保正确加入甲醇，因为蒸发作用会减少培养基的体积。

5在下列的各个时间点，取1ml培养基至1-5ml离心管。这些样品用于分析表达水平及确定诱导后收集细胞的最佳时间。室温用水平离心机最大转速离心2-3min。时间点：0，6，12，24(1天)，36，48(2天)，60，72(3天)，84，96(4天)。

6分泌表达时，将上清转移至单独管中，将上清及细胞沉淀存于-80度直至开始检测。在液N2或干冰/酒精浴中快速冷冻

胞内表达时，去除上清将细胞沉淀存于-80度，直至开始检测。在液N2或干冰/酒精浴中快速冷冻

7用考马斯亮蓝染色SDS-PAGE，western blot或功能分析方法来分析上清及细胞沉淀的蛋白表达(SDS-PAGEp47)。

Muts胞内或分泌表达:可培养GS115 Ablumin (Muts，分泌白蛋白至培养基中)检测培养条件的效率。记住要用转化亲本载体的GS115或KM71作为胞内表达的背景对照。

制作者：陈苗 商汉桥

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1挑取单克隆，接种至含100mlMGY，BMG或BMGY的1L隔板摇瓶中。在摇床中28-30度，250-300rpm生长至OD600=2-6(约16-18小时)

2室温1500-3000g离心5min收集细胞，去除上清，用1/5-1/10原培养基体积的MM，BMM或BMMY重悬细胞(约10-20ml)

3置于100ml隔板摇瓶中，用2层灭菌纱布或干酪包布盖住瓶口，放入摇床继续培养。

4每隔24小时，加入甲醇至终浓度为0.5%以继续诱导。

5在下列的各个时间点，取1ml培养基至1-5ml离心管。这些样品用于分析表达水平及确定诱导后收集细胞的最佳时间。室温用水平离心机最大转速离心2-3min。时间点：0，6，12，24(1天)，36，48(2天)，60，72(3天)，84，96(4天)。

6分泌表达时，将上清转移至单独管中，将上清及细胞沉淀存于-80度直至开始检测。在液N2或干冰/酒精浴中快速冷冻

胞内表达时，去除上清将细胞沉淀存于-80度，直至开始检测。在液N2或干冰/酒精浴中快速冷冻。

7用考马斯亮蓝染色SDS-PAGE，western blot或功能分析方法来分析上清及细胞沉淀的蛋白表达(SDS-PAGE p47)。

SDS-PAGE分析：

介绍：任何标准SDS-PAGE仪器及程序均可用，如12%聚丙烯酰胺凝胶，5%浓缩胶用于分离40-100kDa蛋白。

样品准备：需要准备Breaking 缓冲液(P60)及酸洗0.5mm玻璃珠

细胞洗涤准备：(胞内或分泌表达)

1快速融化细胞沉淀，置于冰上

2每1ml样品，加入100ul裂解缓冲液(细胞+上清)

3加入等量的酸洗玻璃珠(0.5mm)，通过置换来估算相等体积

4涡旋30s，冰上孵育30s，重复8次

5 4度最大转速离心10min，将上清转移至干净的微量离心管中

6取50ul上清(细胞裂解物)，，加入50ul2×SDS-PAGE凝胶上样缓冲液(样品buffer)

7煮沸10min,每孔加10-20ul，依胶的厚薄及孔量，决定点样量。剩下样品存于-20度，用于western blot。细胞裂解物存于-80度用于分析。

蛋白浓度：Lowry,BCA(pierce)或Bradford蛋白分析可用于定量分析细胞裂解物中及培养基上清中蛋白量。一般，毕赤酵母细胞裂解物含有5-10ug/ul蛋白。毕赤酵母培养基上清中蛋白含量各有不同，基本上与分泌蛋白的量有关。毕赤酵母只分泌很少自身蛋白，如果培养基中蛋白量大于50ug/ml，10ul培养基在SDS-PAGE上通过考马斯亮蓝染色可得一条弱带。

对照：在SDS-PAGE上用下列样品作对照：

1与所需蛋白相适的分子量标准

2标准蛋白(如果有的话)

3含亲本载体的GS115或KM71样品，这可显示毕赤酵母胞内自身蛋白背景，如果在胞内表达，可帮助你将目的蛋白从背景蛋白中区分开来

4分析GS115β-gal 及Ablumin 对照，可指示培养基或条件是否有问题

用考马斯亮蓝染色时，强烈建议进行western blot或其它更敏感的分析方法来分析蛋白，表达蛋白依染色而呈现出来依靠多种因素，如表达水平，可溶性，分子量及胞内相同分子量的蛋白是否掩盖了它等等。Wetern blot,酶活分析或特定的纯化方式，可帮助在自身蛋白中辨认表达蛋白。

制作者：陈苗 商汉桥

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分析蛋白表达：检查考马斯亮蓝染色SDS-PAGE时，会发现随不同时间诱导产生目的蛋白与标准蛋白移行相同距离，如果没有可见的重组蛋白，进行western blot或功能分析。

*如果重组蛋白的表达量很低，见(毕赤酵母表达蛋白优化)P49，优化表达指导。

*用试剂盒自带的两个对照菌检测表达条件

*如果没有检测到表达，进行northern blot分析，看是否有及有多少被诱导的全长mRNA。见P76，RNA分离程序。

优化毕赤酵母蛋白表达：

介绍：根据现有数据，在毕赤酵母中表达可测水平外源蛋白的概率大约为75%。最大的障碍可能是最初的成功---表达任意水平蛋白，虽然表达≧10g/l的例子很少，仍有许多表达水平≧1g/l的例子，使得毕赤酵母表达系统成为最高产的真核表达系统之一。也有一些无法在杆状病毒及酿酒酵母中表达而在毕赤酵母中成功表达的例子，表明毕赤酵母系统是一个很好的替代选择，如果你最初没有表达或很少的话，使用下列指导来优化表达。

蛋白酶水解或降解：作一系列表达时间研究，检测是否在某一个时间点产生较多比例的全长蛋白。

1如果分泌表达，在无缓冲的MM培养基中培养，检测蛋白是否对中性PH蛋白酶敏感。另外，在缓冲培养基中加入1%酪蛋白氨基酸，抑制胞内蛋白酶

2用SMD1168(蛋白酶A缺陷)进行表达

3分泌表达水平低：检测细胞沉淀，看是否总体表达水平低或蛋白没有分泌 。如果不分泌，尝试不同的信号序列(自身或α-factor信号序列)

4用硫酸铵沉淀或超滤浓缩上清(P52)

5Mut+，用高浓度培养物进行诱导表达

表达水平低：

1检测Mut+及Muts重组子以期增加表达，一些蛋白在一种遗传背景下表达比另一种好

2如果是分泌表达，尝试胞内表达，因为蛋白不能正确加工或不能分泌，检查细胞沉淀是否有表达。如果胞内表达有困难，尝试进行分泌表达。可能的糖基化也许是你需要的也许是不要的，如果不要，寡糖苷可用peptide: N-Glycosida F进行去除。(P54)

3进行大规模发酵(P52)，毕赤酵母是酵母，当然更适于发酵。致电Invitrogen技术服务部寻求帮助。

没有表达：

1先按前面所列简单方法进行优化，因为没有表达与表达量极低情况相似。如果这些方法仍不能增加蛋白表达，进行northern blot分析或检查基因转录情况。附录中有毕赤酵母RNA分离方法(P76)

2 PCR分析插入情况(P70)。PCR选取12-20个转化子才可信，记得用空载体及单拷贝插入载体作对照分析PCR结果

3如果有转录提前终止，检测基因的AT结构，在酿酒酵母中，只有很少序列会使转录提前终止,其中之一TTTTTATA，与HIVI-gp120中ATTATTTTATAAA序列相似，在酵母中表达时，会出现提前终止。改变该序列，才能出现更长的转录。

过糖基化：如果是过糖基化的

1试用胞内表达，因为蛋白不经过分泌通路，不会被修饰

2用peptide: N-Glycosida F或其它酶进行去糖基化

3去除基因N端糖基化位点

制作者：陈苗 商汉桥

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大规模表达：

表达指导：表达优化后，可用更大摇瓶或用发酵罐来生产更多蛋白(P79)。用下列指导来进行规模化表达，纯化蛋白见参考(P53)

Mut+胞内或分泌表达：

1挑取单克隆，接种至含25mlMGY，BMG或BMGY的250ml摇瓶中，28-30度，250-300rpm培养至OD600=2-6(约16-18小时)

2将25ml培养基接种至含1LMGY，BMG或BMGY的3-4L摇瓶中，28-30度剧烈振荡(250-300rpm)，至对数生长期(OD600=2-6)

3用灭菌离心管，室温1500-3000g离心5min收集细胞。诱导表达时，去除上清，用MM，BMM或BMMY重悬细胞至OD600=1.0(2-6L)进行诱导

4分装培养基至几个3-4L隔板摇瓶，用2层灭菌纱布或干酪包布盖住，放入摇床28-30度继续培养

5每24小时，加甲醇至0.5%浓度，直至到达最佳诱导时间

6室温，1500-3000g离心5min收集细胞。胞内表达去除上清，细胞立即进行处理或存于-80度。分泌表达，保留上清，置于4度预冷，如需要可进行浓缩。接下来进行蛋白纯化或将上清存于-80度备用。

Muts胞内或分泌表达：

1挑取单克隆，接种至含10mlMGY，BMG或BMGY的100ml隔板摇瓶中，28-30度，250-300rpm培养至OD600=2-6(约16-18小时)

2将10ml培养基接种至含1LMGY，BMG或BMGY的3-4L摇瓶中，28-30度剧烈振荡(250-300rpm)，至对数生长期(OD600=2-6)

3用灭菌离心管，室温1500-3000g离心5min收集细胞。诱导表达时，去除上清，将细胞重悬于1/5-1/10原体积的MM，BMM或BMMY培养基中(100-200ml)

4将培养基加至1L隔板摇瓶中，用2层灭菌纱布或干酪包布盖住，放入摇床28-30度继续培养

5每24小时，加甲醇至0.5%浓度，直至到达最佳诱导时间

6室温，1500-3000g离心5min收集细胞。胞内表达去除上清，细胞立即进行处理或存于-80度。分泌表达，保留上清，置于4度预冷，如需要可进行浓缩。接下来进行蛋白纯化或将上清存于-80度备用。

建议：为增加Muts重组子的数量，增加摇瓶数量，将200-300ml培养基加至3L摇瓶中或发酵培养。

浓缩蛋白：分泌进培养基中的蛋白，同质性>50%，需要另外进行纯化，如果蛋白表达水平并不太高，可优化浓缩蛋白。有几种方法浓缩毕赤酵母分泌蛋白

*硫酸铵沉淀法 *透析 *体积小时，离心集中器 *体积大时，加压浓缩 *冻干浓缩

细胞裂解：用玻璃珠进行裂解

发酵：Invitrogen有发酵指导，建议曾做过或身边有人曾做过发酵时再尝试发酵。

蛋白纯化与糖基化：

介绍：你已经优化蛋白表达程序，也通过大规模培养生产大量蛋白以进行纯化。你也许有蛋白纯化的方法，由于每种蛋白都不同，很难推荐统一的技术用于纯化

一些蛋白纯化技术：确保细胞裂解及纯化蛋白都在4度进行

*离子交换色谱 *凝胶过滤 *亲和色谱分析 *聚焦色谱 *等电聚焦免疫沉淀

制作者：陈苗 商汉桥

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*可溶性（膜蛋白）Lectin亲和色谱

细胞裂解程序：准备breaking buffer（BB）见附录P60

1用BB重悬清洗细胞，4度下3000g离心5-10min，

2用BB重悬细胞至OD600＝50-100

3加入等体积的酸洗玻璃珠（0.5mm），通过替代预测体积

4涡旋混合物30s，冰上孵育30s，重复7次，间隔涡旋并预冷细胞抽提物减少蛋白变性

5在4度，12000g离心5-10min

6将上清转至干净容器并分析，总蛋白含量应在5-10mg/ml

7保留细胞沉淀，用6M尿素或1%Triton X-100抽提来检测不可溶蛋白

糖基化分析：在异源表达系统中表达纯化糖基化蛋白，需要尽快确定是否正确糖基化，最近发表的一些蛋白碳水结构分析方法，使得分子生物学家可对糖基化目的蛋白进行分析。

毕赤酵母培养基配方：

贮存液：

*10×YNB （13.4%酵母氮源碱（YNB）含硫酸铵不含氨基酸）

溶解134gYNB于1000ml水中，过滤除菌，加热至YNB完全溶解，存于4度。或者用34gYNB（不含硫酸铵不含氨基酸），100g 硫酸铵进行配制，可放1年。注意毕赤酵母在高浓度YNB下生长更好。该试剂盒中所用YNB的量是酿酒酵母中的两倍。

*500×生物素（0.02%）

溶解20mg生物素于100ml水中，过滤除菌，放于4度，可放1年

*100×H（0.4%组氨酸）

溶解400mg L-组氨酸于100ml水中，低于50度加热以促溶解，过滤除菌，可放1年

*10×D（20%葡萄糖）

溶解200g D-葡萄糖于1000ml水中，高压灭菌15min或过滤除菌，可放1年

*10×M（5%甲醇）

混合5ml甲醇与95ml水，过滤除菌存于4度，可放2个月

*10×GY（10%甘油）

混合100ml甘油与900ml水，过滤或高压灭菌，室温放置，可存放1年以上

*100×AA（0.5%各种氨基酸）

溶解各50mgL-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100ml水中，过滤除菌，存于4度，可放1年

*1M磷酸钾缓冲液 PH6.0

132ml 1M K2HPO4，868ml 1M KH2PO4，调整PH值为6.0±0.1（如果需调PH值，用磷酸或KOH）。过滤或高压灭菌，室温下可放1年以上

*YPD或YPED：Yeast Extract Peptone Dextro Medium(1L)

1%Yeast Extract 2% Peptone 2%Dextro (gluco)

1溶解10gYE, 20gPEP于900ml水中，如制平板加入20g琼脂粉

2高压20min

3加入100ml 10×D

*YPD-遗传霉素平板：

1%酵母浸出物， 2%蛋白胨 2%葡萄糖 2% 不同量的遗传霉素

100mg/ml遗传霉素：用无菌水制备30ml 100mg/ml遗传霉素贮存液，过滤除菌，存于-20度。用来制备含不同终浓度遗传霉素平板：0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0，4.0

250ml（8－10个遗传霉素平板）

制作者：陈苗 商汉桥

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1溶解2.5g酵母浸出物,5g蛋白胨,5g琼脂粉于225ml去离子水中

2高压灭菌20min

3加入25ml 10×D，混匀

4待YPD冷至55-60度，加入合适量遗传霉素贮存液，同时也制几个不含遗传霉素的YPD平板

5混匀，不要产生太多气泡

6倾倒10cm彼得里培养皿，凝固后，倒置存于4度，可放至少6个月

终浓度

0.25 0.5 0.75 1.0 1.5 1.75 2.0 3.0 4.0

ml遗传霉素贮存液/250mlYPD

0.625 1.25 1.875 2.5 3.75 4.375 5.0 7.5 10

*MGY及MGYH （minimal glycerol medium±histidine）1L

1.34%YNB 1%甘油 4×10-5%生物素 ±0.004%组氨酸

1在800ml水中加入100ml 10×YNB,，2ml 500×B，100ml 10×GY

2培养his4菌株，需加入组氨酸（称为MGYH），加入10ml 100×H贮存液。

3存于4度，可放2个月

*RD及RDH液体培养基：regeneration dextro medium±histidine 1L

1M山梨醇 2%葡萄糖 1.34%YNB 4×10-5%生物素 0.005%氨基酸 ±0.004%组氨酸

1溶解186g山梨醇于700ml水中

2灭菌20min

3放冷并置于45度水浴

4准备预温（45度）的混合液

100ml 10×D

100ml 10×YNB

2ml 500×B

10ml 100×AA

88ml 灭菌水

加至山梨醇溶液中

5培养his4菌株，需加入组氨酸，在4中45度预温混合液在加入10ml 100×H。4度保存，可放几个月

*RDB或RDHB琼脂平板：

1溶解186g山梨醇于700ml水中，加入20g琼脂粉

2灭菌20min

3将溶液置于60度水浴，以防止溶液变稠

4准备RD及RDH中用到的预热的（45度）混合物，加至山梨醇/琼脂粉溶液中。如选择HIS＋转化子，不要加组氨酸。

5制备平板，放于4度，可放几个月。

*RD及RDH上层琼脂：

1溶解186g山梨醇于700ml水中，加入10g琼脂或琼脂糖

2灭菌20min

3置于60度水浴

4准备RD及RDH中用到的预热的（45度）混合物，加至山梨醇/琼脂粉溶液中，如选择HIS＋转化子，不要加组氨酸。

5如立即作转化，将溶液置于45度

6存于4度，可放几个月

制作者：陈苗 商汉桥

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*MD，MDH (minimal dextro medium±histidine) 1L

1.34% YNB 4×10-5%生物素 2%葡萄糖

1灭菌800ml水

2于60度下加入100ml 10×YNB，2ml 500×B, 100ml 10×D

3制MDH时，加入10ml 100×H,混匀存于4度

4如制备平板，于第一步加入15g琼脂粉

5倒置平板，4度放置几个月

*MM、MMH minimal methanol ±histidine 1L

13.4%YNB 4×10-5%生物素 0.5%甲醇

1灭菌800ml水

2于60度 下加入100ml 10×YNB, 2ml 500×B, 100ml 10×M

3制MMH时，加入10ml 100×H,混匀存于4度

4如制备平板，于第一步加入15g琼脂粉

5倒置平板，4度放置几个月

*BMG、BMM Buffered minimal glycerol (methanol) 1L

100mM 磷酸钾 PH6.0 1.34%YNB 4×10-5%生物素 1%甘油或0.5%甲醇

1灭菌700ml水，

2冷至室温，加入下列：100ml 1M磷酸钾缓冲液PH6.0, 100ml 10×YNB, 2ml 500×B, 100ml 10×GY

3制BMM时,加入100ml 10×M取代10×GY

4放置于4度，可放2个月

*BMGY Buffered Glycerol-complex Medium

BMMY Buffered Methanol-complex Medium 1L

1%酵母浸出物 2%蛋白胨 100mM磷酸钾 PH6.0， 1.34%YNB 4×10-5%生物素1%甘油或0.5%甲醇

1溶解10g酵母浸出物，20g蛋白胨于700ml水中

2灭菌20min

3冷至室温，加入下列混合液：

100ml 1M 磷酸钾缓冲液 PH6.0

100ml 10×YNB

2ml 500×B

100ml 10×GY

4制BMMY时，加入100ml 10×M取代10×GY

5存于4度，可放2个月

裂解缓冲液：

50mM 磷酸钠 PH7.4

1mM PMSF(或其它蛋白酶抑制剂)

1mM EDTA

5%甘油

1准备所需蛋白酶抑制剂贮存液，正确保存

2取900ml去离子水，6g磷酸钠（单碱），372mg EDTA，50ml 甘油

3用NaOH调节PH，定容至1L，存于4度

4使用前，加入蛋白酶抑制剂

制作者：陈苗 商汉桥

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毕赤酵母重组及整合

介绍：通过转化DNA与毕赤酵母基因组中同源序列的同源重组，毕赤酵母与酿酒酵母一样可产生稳定转化子。这些整合在无选择压力条件下，即使是以多拷贝出现，也表现出极度稳定性。常用的表达载体含有选择用HIS4基因，这些载体用限制酶线性化后，可在AOX1或his4位点进行重组，从而产生HIS＋重组子。注意单十字交换事件（插入）比双十字交换事件（替换）更容易发生，多拷贝插入事件自发发生率只有单插入事件的1-10%。

基因插入AOX1或aox1::AGR4位点：GS115的AOX1或KM71的aox1::AGR4位点与载体上三个AOX1区：AOX1启动子，AOX1转录终止子（TT）或AOX1下游远侧序列（3‘AOX1）中的任一个之间发生单十字交换事件都会形成基因插入。结果在AOX1或aox1::AGR4基因的上游或下游插入一个或多个载体。转化子在GS115中为HIS+ Mut+表型，在KM71中为HIS+ Muts表型。在重组质粒5’或3‘AOX1区用限制酶进行线性化，依转化宿主菌的不同，可方便地产生Mut+或Muts重组子。

下图显示质粒3‘端插入完整的AOX1位点（Muts），增加pAOX1、目的基因、HIS4（表达盒）。这也可发生在载体及基因组的5 AOX1区，在5‘AOX1位点产生5‘方向插入。尽管发生频率很低，该事件也可发生在未线性化载体或自连的载体上。

基因插入His4位点:GS115（Mut+）或KM71（Muts）中，染色体上his4位点与载体上HIS4基因之间发生单十字交换事件后会在his4位点形成插入。结果在his4位点插入一个或多个载体。由于基因组上AOX1或aox1::AGR4位点未发生重组，这些His＋转化子的表型均与亲本菌株相同。通过HIS4基因处限制性内切酶线性化，依转化宿主菌不同，可方便地产生Mut+或Muts重组子。

下图显示质粒插入双拷贝HIS4/his4基因。一个为突变子，另一个为野生型。

制作者：陈苗 商汉桥

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基因多拷贝插入事件：细胞中单位点多基因插入确实可自发形成，虽然比例低，占所有HIS＋转化子的1-10%，但却是可测的。多拷贝插入事件的发生是因为基因可在AOX1、

aox1::AGR4位点或his4位点进行插入。结果在GS115中产生Mut+ 表型，在KM71中产生Muts表型。定量dot blot及southern blot分析，差显杂交均可检测到多基因插入事件。（P74筛选多拷贝插入）

GS115中基因在AOX1处发生替代：在his4菌株如GS115中，载体及基因组中AOX1启动子及3‘ AOX1区的双十字交换事件，可产生基因替代（omega插入）。结果AOX1编码区全部被取代，产生HIS＋Muts表型。以AOX1位点由于基因替代而产生的Muts表型作为指示，可很容易地筛选HIS＋转化子的Mut表型。基因取代的结果是缺失了AOX1位点（Muts），增加了含pAOX1、目的基因、HIS4的表达盒。下图显示AOX1位点的基因取代。

制作者：陈苗 商汉桥

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基因取代（双交换事件）不如插入（单交换事件）发生得多，一般我们建议线性化质粒通过单交换事件产生毕赤酵母重组子。用GS115或KM71菌株时，Mut表型与亲本菌相同。

毕赤酵母电转化：

介绍：该方法无需产生去壁细胞，是产生毕赤酵母重组子的简便方法。与去壁细胞效率相似。

细胞准备：

1在含5mlYPD的50ml离心管中，培养毕赤酵母，30度过夜

2取0.1-0.5ml过夜培养物，接种含500ml新鲜培养基的2L摇瓶，过夜生长至OD600＝1.3-1.5

3在4度，1500g离心5min收集细胞,用500ml预冷的灭菌水悬浮细胞

4如上离心，用250 ml预冷的灭菌水悬浮细胞

5如上离心，用20ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞

6如上离心，用1 ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml

注意：可冻存80ul等量的电感受态细胞，但转化效率会下降很多

转化：

1取80ul上述细胞与5-20ug线性化DNA（溶于5-10ulTE）混合，转入预冷的0.2cm电转杯中。

2在冰上放置5min

3根据所使用装置推荐的酿酒酵母参数进行电击

4立即加入1ml预冷的1M山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中

5分成200-600ul等份，涂于MD或RDB平板上

6在30度孵育平板至克隆产生，按P41筛选Mut+/Muts表型

PEG1000转化方法：

介绍：据称PEG比LiCl方法好，但不如去壁细胞及电转化法，但对没有电转装置的人来说，更方便，效率为102-103/ugDNA。

溶液准备：

Buffer A: 1M山梨醇， 10mM bicine（N－二（羟乙基）甘氨酸）pH8.35，3%（v/v）乙二醇

Buffer B: 40%(w/v)聚乙二醇1000， 0.2M N－二（羟乙基）甘氨酸 pH8.35

Buffer C: 0.15M NaCl, 10mM N－二（羟乙基）甘氨酸 pH8.35

过滤除菌，存于-20度

新鲜的试剂级DMSO，未打开或刚配制，存于-70度直至使用。

注意，当细胞溶解后，即使放在冰上，其感受性下降都极快，加入DNA于冰冻的管中制作者：陈苗 商汉桥

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很关键。可进行多个转化，建议每次转化6个。

感受态细胞制备：

1在YPD平板上划线培养毕赤酵母菌，30度孵育2天

2从平板上挑取单克隆于10mlYPD中，30度振荡过夜

3早上，在100mlYPD培养基中接种等量的过夜培养物，至OD600达0.1，在30度生长至OD600为0.5-0.8

4室温3000g离心收集细胞，用50ml Buffer A洗涤细胞1次

5用4ml Buffer A重悬细胞，分成0.2ml等份分装至1.5ml离心管中，加入11ulDMSO于各管中，混合，并在液氮中快速冷冻细胞

6存于-70度

转化：在<20ul水中加入50ug DNA,将DNA直接加入仍处于冰冻状态的感受态细胞管中。载体DNA（40ug变性及超声处理的鲑鱼精DNA）中加入＜1ug DNA样品，检测最大转化效率。

2在37度水浴中孵育各管5min，其间混匀1-2次

3取出各管，加入1.5ml Buffer B，完全混匀

4在30度水浴中孵育1小时

5室温，2000g 离心样品10min，去除上清，用1.5ml Buffer C重悬细胞

6再次离心，用0.2ml Buffer C重悬细胞

7将管中内容物全部涂在选择生长平板上，30度孵育3-4天，筛选Mut表型（P41），或筛选遗传霉素高抗性克隆（P37）

LiCl转化方法：

介绍：该程序是依酿酒酵母修改的版本，是电转化的替代方法。转化效率为102-103cfu/ug线性化DNA。

溶液准备：不能用醋酸锂，一定要用氯化锂

*用无菌去离子蒸馏水配制1M LiCl，过滤除菌，用无菌水稀释

*用无菌去离子蒸馏水配制50%PEG（3350），过滤除菌，存于盖紧的瓶中

*用TE（10mM Tris-HCl pH8.0 , 1.0mM EDTA）溶解2mg/ml变性断裂鲑鱼精DNA，存于-20度

细胞准备：

1在50mlYPD中培养毕赤酵母至OD600＝0.8-1.0（约108个/ml）

2收集细胞，用25ml灭菌水洗涤，室温1500g离心10min

3去除水，用1ml 100mM LiCl 重悬细胞

4将细胞悬液转至1.5ml离心管中

5最大转速沉淀细胞15s,用吸头吸去LiCl

6在400ul 100mM LiCl中悬浮细胞

7将50ul细胞悬浮液移到1.5ml离心管中，每次用一管，现做现用，不要置于冰上或-20度保存

转化：

1煮沸单链DNA 5min，快速放于冰水中使变冷，后置于冰上。注意：载体DNA不需要在每次用之前都煮，在-20度保存等份少量样品，每次解冻一管，用3-4次后再煮。

2取上面第7步中细胞，离心去除LiCl

3每个转化样品，按顺序加入下列试剂，PEG可保护细胞免受高浓度LiCl的有害作用

240ul 50%PEG， 36ul 1M LiCl， 25ul 2mg/ml 单链DNA， 溶解于50ul灭菌水中的制作者：陈苗 商汉桥

PDF created with pdfFactory trial version 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒

质粒DNA（5-10ug）

4剧烈涡旋细胞沉淀至完全混匀（1min）

5在30度孵育30min（不要摇动）

6在42度水浴热击20-25min

7 6000-8000rpm离心，将转化溶液转移走

8用1ml灭菌水重悬细胞沉淀

9在RDB或MD平板上涂25-100ul,在30度孵育2-4天，筛选转化子Mut表型及遗传霉素高抗性克隆

PCR分析毕赤酵母整合：

介绍：下列程序可分析目的基因是否整合到基因组中，从6-10个Muts或Mut+毕赤酵母克隆中分离基因组DNA（P73），从转化亲本质粒的菌株中提取DNA，进行整合分析。用α-factor引物（仅用于pPIC9K）或5‘AOX1引物与3‘AOX1引物配对扩增目的基因。该程序可证实基因插入，但不能证实插入位点。

更直接的PCR筛选方法见P72

PCR分析：设置PCR反应如下：

10×PCR buffer 5ul

基因组DNA（1ug） 5ul

100mM dNTPs(25mM/个) 1ul

5‘AOX1引物(0.1ug/ul) 5ul

3‘AOX1引物(0.1ug/ul) 5ul

加入灭菌水至 50ul

Taq多聚酶（5U/ul） 0.25ul

用20ul灭菌水重悬引物，制成0.1ug/ul溶液，如需要可减少引物量。如20pmol引物，加2ul引物进行扩增。

对照： 100ng重组质粒（阳性对照），100ng不含插入基因的相同质粒（阴性对照）

2加入50ul矿物油，如果PCR仪有防蒸发系统，不需要加矿物油。

3上样，按下列程序：

步骤

热启动

变性

退火

延伸

最终延伸

温度

94度

94度

55度

72度

72度

时间 min

2

1

1

1

7 1

循环

1

25-35

4用0.8%琼脂凝胶分析10ul样品，缓冲液为1×TAE

5如果筛选Mut+整合，可见两条带，一条与目的基因相关，另一条为AOX1基因（大约2.2kb），如果筛选GS115中Muts整合，可见与目的基因相关的一条带。在KM71中，由于ARG4插入AOX1，PCR产物为3.6kb。亲代质粒产生下列大小PCR产物。在分析PCR结果时，需将这些片段的长度加到最终片段中。

载体

pPIC3.5k

pAO815

pPIC9k(用5‘AOX1引物)

pPIC9k(用α-factor引物)

PCR产物

220bp

189bp

492bp

195bp

制作者：陈苗 商汉桥

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重要：如使用α-factor引物，在GS115及KM71中都可见一条带。因为染色体AOX1基因上没有α-factor信号序列。

注意：有时PCR会产生假带，这不重要因为它们并不产生什么问题。

PCR分析示例：下面是PCR分析的典型例子，从毕赤酵母重组菌、合适的对照中分离基因组DNA，在0.8%琼脂糖凝胶上，每个PCR样品点10ul。

泳道1含有1kb及100bp条带。

泳道2显示野生型AOX1基因2.2kb及含目的基因的2.4kb产物

（GOI, 1.9kb）及GS115/ pPIC9k/ GOI中492bp的AOX1基因侧

翼序列 。

泳道3显示GS115中野生型AOX1基因。

注意：Invitrogen“Easy-DNA”试剂盒可快速简便地分离

毕赤酵母基因组DNA。

毕赤酵母克隆直接进行PCR筛选：

介绍：有报道称可用PCR直接检测毕赤酵母克隆中的插入基因，简单讲，通过酶、冷冻及热处理相结合的方法裂解细胞，基因组DNA可直接用作PCR模板。

开始前：准备下列试剂及仪器

＊毕赤酵母转化子培养基或单克隆 ＊1.5ml离心管 ＊5U/ul溶细胞酶溶液（Lytica）＊30度水浴，或热击 ＊液氮 ＊PCR试剂

程序：

1在1.5ml离心管中加入10ul毕赤酵母培养物，若培养物很浓，可将1ul培养物稀释至9ul水中，或直接挑取单克隆，重悬于10ul水中。

2加入5ul 5U/ul的溶细胞酶lityca, 30度孵育10min

3将样品冻存于-80度10min，或浸入液氮中1min

4设立50ul PCR反应体系

10×反应buffer 5ul

25mM MgCl2 5ul

25mM dNTPs 1ul

5‘AOX1引物(0.1ug/ul) 1ul

3‘AOX1引物(0.1ug/ul) 1ul

灭菌水 27 ul

细胞裂解液 5 ul

总体积 45ul

5混合溶液，覆盖20ul矿物油

6将溶液置于热循环器中，95度孵育5min

7加入5ul 0.16U/ul Taq聚合酶（0.8U）

8按下列参数循环30次

步骤

变性

退火

延伸

最后延伸

温度

95度

54度

72度

72度

时间min

1

1

1

7

9在琼脂糖凝胶中分析10ul等量样品

制作者：陈苗 商汉桥

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毕赤酵母总DNA提取

介绍：下列操作可从所需的HIS＋重组子及未转化的GS115、KM71中提取DNA，适用于southern 分析，dot /slot blot分析 或基因组PCR

溶液：需要配制下列溶液，有些试剂在试剂盒中没有

最小培养基 (MD，MGY) 灭菌水

SCED(1M 山梨醇，10mM柠檬酸钠 pH7.5, 10mM EDTA, 10mM DTT)

藤黄节杆菌酶 3mg/ml 贮存液 1%SDS 5M醋酸钾 pH8.9

TE buffer pH7.4 (10mM Tris-HCl pH7.4, 1mM EDTA pH8.0)

7.5M醋酸铵 pH7.5 酚：氯仿(1：1，V/V)

准备：

1在30度，在10mlMD或MGY中培养重组子，在10mlMDH，MGYH中培养GS115或KM71至OD600=5-10

2室温，1500g离心5-10min

3用10ml灭菌水洗涤细胞，如2中离心

细胞去壁及裂解：

1在2mlSCED缓冲液(pH7.5)中重悬细胞，溶液现配现用

2加入0.1-0.3ng藤黄节杆菌酶(加前混合均匀)，37度孵育50min，获得去壁率<80%去壁细胞(监测去壁细胞比例，P33-34)

3加入2ml 1%SDS，轻轻混匀，冰上放置5min(0-4度)

4加入1.5ml 5M醋酸钾 pH8.9， 轻轻混匀

5在4度 1000g离心4min，保留上清

DNA沉淀：

1从上述5中转移上清，加入2倍体积乙醇，室温放置15min

2在4度 1000g离心20min

3用0.7mlTE pH7.4轻轻重悬沉淀，转入离心管中

4以下操作需轻柔，用等量的酚：氯仿(1:1 v/v)抽提取,再用等量的氯仿：异戊醇(24:1)抽提。将上层水相转入两个离心管中。

5每管中加入1/2体积的7.5M醋酸铵，2倍体积的乙醇，干冰上放置10min，或-20度放置60min

6在4度 10000g离心20min,用1ml70%乙醇洗涤沉淀，空气干燥沉淀。用50ulTE pH7.5重悬沉淀。测定DNA样品浓度。两管可分别存放或合在一起存放于-20度。

多拷贝重组子拷贝数：

介绍：你若想知道毕赤酵母重组子准确插入数，可用定量blot或southern 杂交来分析拷贝数。需要分离转化有亲代载体、含单拷贝的pAO815或pPIC3.5k及含多拷贝外源基因的毕赤酵母重组子的基因组DNA。

定量dot blot溶液：需要下列溶液，每个反应10-15ml，3MM纸, 50mM EDTA, 2.5% β-

巯基乙醇 pH 9.0, 1mg/ml藤黄节杆菌酶100T, 0.1N NaOH, 1.5M NaCl, 2×SSC

定量dot blot 程序：下列为DNA快速dot blot技术检测多拷贝插入。在滤纸上点等量的细胞对定量拷贝数很重要。另外可提取基因组DNA，直接点在醋酸纤维膜或尼龙膜上，固定并分析。

1在30度，在96孔板上用200ul YPD分别培养Mut+及Muts转化子直至到相同浓度，制作者：陈苗 商汉桥

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可能要传几代(p39)。另外可在培养管中培养单个转化子，加入培养基至OD600吸收值一致。

2用多孔道移液器吸取50ul样品至安装于dot blot装置上的醋酸纤维膜或尼龙膜上，自然干燥膜。

3裂解膜上细胞，用下列4种溶液进行处理：在托盘中放置两块3MM纸，用10-15ml

50mM EDTA，2.5% β- 巯基乙醇 pH 9.0进行浸泡。确保纸浸泡一致，不要有气泡。将醋酸膜正面对着3MM纸，室温孵育15min

4将醋酸膜从3MM纸上取走，更换另两张3MM纸，用10-15ml 1mg/ml藤黄节杆菌酶100T 浸泡，将醋酸膜正面对着3MM纸，37度孵育4小时

5将膜移走，再换两张3MM纸，用10-15ml 0.1N NaOH, 1.5M NaCl浸泡，将醋酸膜正面对着3MM纸，室温孵育5min

6将膜移走，再换两张3MM纸，用10-15ml 2×SSC浸泡，将醋酸膜正面对着3MM纸，室温孵育5min,重复一次

7在80度烘干醋酸纤维膜，或用UV-crosslink烘干尼龙膜。膜可用与目的基因互补的非放射性标记或32P标记的随机引物探针进行反应。多拷贝整合可通过与单拷贝对照相关的强烈杂交信号来进行确定。Dot blot 可通过膜或blot 的密度计量，如用放射性标记的用β-scanner来确定拷贝数。

Southern blot:用正确的内切酶消化DNA非常重要，消化后凝胶分离基因组DNA可用于点膜。如果用pPIC3.5K或pAO815产生的多拷贝，那样方法可能不一样。消化含多拷贝目的基因的重组子DNA，会产生一条因插入数目不同而密度不同的带。用单拷贝作对照看密度也非常重要，用密度计量计定量条带的密度可预测基因的数量。

对照：用宿主菌(GS115，KM71)DNA，转化亲本载体菌DNA(pPIC3.5K或pAO815)，转化含单拷贝基因载体的DNA作对照很重要。用HIS4基因探针作为单拷贝及基因的内在对照。注意，如果基因插入his4位点，可产生两拷贝HIS4基因，一个突变型，一个野生型。(见毕赤酵母重组及整合部分)

基本指导：

1用分子克隆中southern 标准溶液

2分离基因组DNA，用荧光计定量。确保去除RNA。确定拷贝数时，点相同量DNA很重要。

3要有southern 探针，HIS4基因探针及目的基因探针。注意：如果你的探针完全与野生型基因互补的话，宿主菌中his4基因的点突变并不影响杂交。

4如用pPIC3.5K产生多拷贝，用BglII消化DNA。注意：如用pPIC3.5K，并不是所有多插入子都是以头-尾形式存在。有些可能是头-头、尾-尾形式。建议你们自己思考可能产生的产品。相反方向的表达盒会产生不同的带，Southern blot时，当拷贝数>2时，会产生1条或2条带(根据方向)，这都会增加密度。

5如用pAO815产生多插入子，用BglII及BamHI消化基因组DNA，释放多插入子，条带的分子量可帮助确定插入数。如果多插入子很大，可用SacI进行消化。这样可产生包含单个目的基因的片段。这样将会产生一条非常亮的带。根据它与单拷贝基因所产生的带的相对亮度，可判断插入数。

6用BalII消化GS115基因组。转化pPIC3.5K或pAO815的GS115基因组，用HIS4互补探针进行反应时，可产生一条2.8kb的带(基因组中HIS4基因)及一条约6.7kb(载体来源的HIS4基因)的带。

制作者：陈苗 商汉桥

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