毕赤酵母表达知识归纳

2023年12月4日发(作者：岁月留声)

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毕赤酵母表达知识归纳1

a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：

1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；

2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；

3、水浴加热，温度不能高于50度。

D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。

在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。

b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）

1、制感受态细胞，OD多少比较好？

pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中。

说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低

2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。

Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. U only lithium chloride.

3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。

过滤灭菌的怎么操作？

我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。

4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。

该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！

5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。

都是从园里看到的！

电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）

6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？

如果不想筛 高拷贝的，是否PCR验证一下即可？

网友的回答：

ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。invitrogen手册上可以灭菌的。

gluco和含氮化合物在一起容易产生美拉德反应，这是配制培养基中的禁忌。颜色很深的话，基本不能使用了。

想请教下关于菌种保存的方法。

我现在是采用斜面保存的方法，但感觉每次接菌都要打开斜面，而且每次的接菌量难免会有不少的误差，所以很想问一下大家都是怎么保存菌种的，特别是甘油菌的保存方法。

我一般吸取300ul的菌液到灭菌的ＥＰ管然后加等体积的甘油，混匀．防于－２０度．保存长的话最好放－８０度冰箱 一般OD是2-6，过夜菌

在筛选高表达菌种中，我一般有一下步骤，很很多人做的不太一样，和说明书也有点差异，如下：

每次转化前，均用多种酶切，BlgII/salI/sacI同时切，然后转化时，用GS115/KM71/KM71H同时转化，转化的条件也和大家一样，即1.5/25/200但是我用的是0.1的杯子，不是0.2的，转化后涂MM及YPD+0.25G，长出菌落后，即进行大规模的表达试验，这里我要重点说明的是，我直接用YPD表达的，一般48h后即进行大量的SDS-PAGE鉴定，鉴定时，样品不用浓缩，直接上样，看到目的带后再做PCR，测序。

我已用这儿方法做了好几个基因出来。

关于酵母表达时BMMY的PH值

我也觉得PH7.0-7.5要比PH6.0好，我表达的两个蛋白都是这样，表达量要高一些。但也不能一概而论，不同目标蛋白表达最适pH不一样，不过表达的pH值最好要远离目标蛋白的pI。

像目前国内外做的最好的rHSA，最适pH大概5-6左右，也有不同的报道，可能和工艺页有关系。而我自己正在做的一个蛋白pH4较好，3、5表达时上清电泳目标带大量减少，杂带大量增多。

求助一下很棘手的问题，大家在酵母表达过程中控制目标蛋白降解方面有什么高招，小弟最近为这个有点儿焦头烂额。

我试过用酸消解酪蛋白，可是作用并不是很明显。

不知道兄台是胞内表达还是胞外表达，如果是分泌表达，目标蛋白确实容易被降解。你可以尝试以下几种办法：1、尽可能降低培养液的pH值减少酶活，酵母生长pH值比较广，4～7都可以试一下；2、多试几种蛋白添加剂，充当酶解底物；3、摸索最适下罐（摇瓶也一样），宁可少表达点也别给降解光了。实在没办法，只好换菌株或做pcr突变酶切位点（当然不能影响表达和蛋白活性）。

Several strategies have been reported as effective in minimizing the proteolytic instability of

specific foreign proteins creted into the is culture medium.

The first is adding to the culture medium of amino-acid rich supplement such as peptone or

casamino acid, which reduce product degradation possibly by acting as execess substrates for one

or more problem proteas.

The cond strategy to minimize proteolytic degradation is to optimize the culture pH between pH

3.0 and pH7.0. The third strategy involves elevating the level ofammonium in the culture broth adequately, which

is explained by the hypothesis that portea activity is induced under nitrogen starvation.

The forth strategy is let the culture temperature 28 deg instead of 30 deg.

如何优化密码子来提高蛋白表达量，具体考虑哪些因素（肯定不是单纯的全部置换为使用频率高的密码子吧）看有些文献优化后的密码子有些都是使用频率不高的，实在很困惑.有没有做过这方面的，急切的想得到你的指导，收取一定的费用也可以。谢谢了，我在上海。

密码子改造对提高表达量只有有限的作用。

影响外源蛋白在Pichia中表达水平的限速步骤（rate-limiting factors)很多。

涉及到转录，翻译，蛋白在ER和Golgi的合成和折叠，以及分泌信号肽定位和切割，蛋白修饰等很多方面（H. Hohenblum, Biotechnology and Bioenginering, 2004, 85:367-374) 。

关键是根据你要表达的蛋白性质以及DNA序列特性来推测（！）哪个步骤是关键的限速步骤。

实际上，很多分泌表达的蛋白，蛋白在ER中合成和折叠以及信号肽的切割是关键步骤。现象是很多错误折叠的蛋白在胞内聚集和降解。

密码子作为限速步骤很多时候体现在某些蛋白由于高AT含量或者其他因素转录提前终止，这方面文献在NCBI上有一些。

毕赤酵母表达知识归纳2

我用Pichia酵母分泌表达两个不同的蛋白，结果Western Blot的结果显示，两个蛋白均比理论分子量少了20k左右。难道都是被发酵液中的蛋白酶降解了？大家碰到过这样的情况吗？

如果是少了20K左右,肯定要考虑酶解的可能了.你的目的蛋白一级序列是否有Pichia酵母的Kex2酶降解位点.我现在做的蛋白就有这种情况,但是是降解产物和目的蛋白共存,有的蛋白幸免遇难

用BglII、SalI、SacI酶切 的区别是什么？

我是想做蛋白表达，用BglII后转化行么？

它们三个是不是哪个可以用了？

BglII 好像能把质粒切成两段，与其它两种线性化方法比较，较易生成muts型的转化子，当然比例也是少。

SalI、SacI酶切基本只能产生mut+型的转化子，我看文献介绍，后者的转化效率比前者要高。

我用前者线性化的，感受态也是用常规方法，没有DTT LiCl什么的，板子也是长得满满的。 哪位有毕赤酵母上罐的一些无机培养基配方能提供参考！谢谢！

毕赤酵母表达知识归纳3

毕赤酵母基因组DNA PCR怎么也p不出来，

质粒和线性化后的质粒都能P出来，

但是电转化进入毕赤酵母GS115后怎么也p不出来，

不知怎么了？

以前做的都是小菜一碟呀，

那位战友有这方面的经验啊？

是不菌株有问题啊？

恳求指点一下！

非常感谢！

电转化后涂在MD平板上的么？

应该大部分都是阳性克隆，可能是你提基因组的方法有问题，

以前有战友介绍过菌落PCR的方法，我刚试过，效果非常非常好。

2.2kb的片段非常清楚。

退火温度我用的56度1min，72度2min，35个循环。

挑取单菌落均匀涂抹于管底，开盖在微波炉中档加热1min，-80℃5min，再加热一次，然后加入20ul水，取1ul作为PCR模板。

他本来说离心取上清为模板，我就直接取的。

非常非常好用，

一般的方法提基因组，比如煮冻煮法等，很难P出2.2kb的AOX1 基因

而这个方法就能，还非常明显。你翻一下前两页吧，我还把自己的图贴出来了。

选5‗aox和3‘aox这两个引物，这样还能判断你的转化子是mut+或muts型的。

跑出两条来说明是mut+，其中一条2.2kb的就是aox1基因。

这里不涉及aox2，建议你去invitrogen网站下一本multicopy pichia expression manual，看一遍就很清楚了。

MD平板上的阳性克隆应该比例很大的，我觉得3个就至少有一个是。

万事都没那么觉对的，在整合时，可能仅His4基因整合入了酵母基因组，所以也能生长，但无目的基因。

请教几个问题 1. 鉴定重组时候，我煮冻煮方法获取酵母基因组作为模板，用目的基因的引物进行扩增，结果有些产物很强，有些很弱，为什么？

2。是否存在这样情况，线性化载体进入酵母内，没有进入核内进行重组，或者进入核内，仅仅黏附在酵母基因组上，没有发生重组呢？

如果有这个情况，该如何区别？

3.用烧瓶摇菌的转速对表达有什么影响，听说过高转速使酵母总处于分裂增殖，而表达低？

4.大家大规模发酵的步骤是怎么样的，能提供一个方案吗？

关于PCR的问题，我觉得你的模板差异大吗？我做很多次PCR鉴定，发觉模板量的差别对PCR的结果会有非常大的影响。不过我做的PCR鉴定，基本上都是用AOX1引物P的，倒是没用过目的基因引物。

摇瓶的问题我也说不出来，因为我到目前为止都没做出分泌性表达来，汗啊……（都在胞内了）速度我都是按照Protocol上的推荐速度摇的，一般都是250rpm以上。

我做的时候使用蜗牛酶消化0.5h，然后沸水浴15min，12000g离心3min，取1ul做模板即可。

再问个有关GAP质粒表达的问题。

小量摇瓶表达的时候需要保证氧通量而使用双层纱布包住瓶口吗？还是直接用牛皮纸包住就行了？

一般说来，小瓶发酵的时候只需要用牛皮纸包住瓶口就可以了，摇床的速度不要过快，那样会使得通气量不够，小瓶发酵时由于不添加消泡剂所以应该避免摇速过快而引起得泡沫。泡沫得产生直接影响到通气的效果。

我们在做大规模发酵时才用纱布将发酵罐的饿通气口都包住，小瓶发酵，那么做得话，可能会导致污染，因为酵母是长得比较慢的。

这个想法可以阿

盐浓度对表达的影响

我想有个问题，缓冲液是起缓冲作用的，

浓度低了影响缓冲效果，浓度高了抑制菌生长？

可以做不同pH的比较试验，

再加上其他的因素，比如转速，所加培养基的量（通气量），甲醇量等

做个正交设计，学了统计，就是不会用阿，呵呵

pH和甲醇浓度我之前都有尝试过。转速啥的没做过。

浓度也是偶然想到的，所以想尝试下。

我的目的基因序列中有一个AAAATT,不知道这个序列是否会影响我的目的蛋白的表达，心里没有谱，希望能有高手指点。

应该不会，现在鉴定出来的导致转录提前终止的序列只有HIV gp120蛋白上一段序列包含TTTTATA。如果不怕麻烦，做一下Northern鉴定，或者直接突变掉一两个碱基。

酵母发酵两三天后有些菌体发红，是怎么回事啊

是突变还是真菌污染呢

我的最近也出现这样情况，是否真的是污染呢？

我的最近也出现这样情况，是否真的是污染呢？

个人认为是老化了

试过同一批转化的克隆，有些克隆在培养几天后就转粉红，但多数克隆没有转变，听说是培养的代数多了，酵母的某个酶发生突变

回纤夫兄：

你的目的基因是1.7kb，有没有加493bp左右的载体序列？你有没有做一个空载体的转化？应该是500bp左右，这样你的带也在2.2kb左右，呵呵

分不清了，可以用a-factor 3‗aox来扩，这样好像增加196

pPIC9K ：9276 bp

AOX1基因为2.2kb

以GS115基因组为模板，5‘ AOX1/ 3‘ AOX1为引物，将扩出2.2kb的AOX1基因。以α-factor/

3‘ AOX1为引物，将不能扩出任何片段。

以整合了pPIC9K的GS115基因组为模板，5‘ AOX1/ 3‘ AOX1为引物，将扩出2.2kb的AOX1基因以及pPIC9K载体上的493bp，以α-factor/ 3‘ AOX1为引物，将扩出pPIC9K载体上的196bp。

毕赤酵母表达知识归纳4 另外求助以下几个问题：

1、BCA法测酵母上清总蛋白含量（BMMY）可以么？

详细的见下面的帖子，请在此贴回复，谢谢。

BCA法测酵母上清蛋白浓度的问题

我做的时候是把上清稀释了20倍，然后才落在标准曲线范围内，

蛋白的量是6ug吧（标准曲线范围是0-10ug，是每孔的蛋白量，不是浓度）

那样，也就是说稀释20倍后的上清浓度是6ug除以20ul（96孔板测得，每孔加20ul样品）

未稀释的上清就是6ug/ul，每升就是6g，我的蛋白跑SDS-PAGE，占上清的80%，那我蛋白的量岂不达到克级了！

而通过SDS-PAGE判断，30多mg左右吧，这是怎么回事呢？

请问是否有干扰？就是BMMY培养上清阿

添加了1%的酪蛋白氨基酸，会影响么？

/bbs/post/view?bid=65&id=5990019&tpg=1&ppg=1&sty=1#6008621

2、用软件分析的SDS-PAGE光密度，是否与其蛋白浓度成正比？

如果一条带是另一个带的3倍，是否蛋白量就是它的3倍？

但我测其蛋白浓度，却相差不是很多？

3、电泳看到我的蛋白占上清的绝大多数，70%以上吧，但上亲和柱，流出液的吸收都在5000mAU，好像大部分都流出了阿，我流速1ml/min，柱子是5ml的，绝对没有过载，因为洗脱时可以看到，我的蛋白才从顶端下来，也就利用了1/10的柱子不到。

这是怎么回事呢？是否也与BCA法测蛋白浓度达到g级有关呢？

我用Lowry法测定的BMMY培养基中总蛋白浓度约200－300mg/L，使用的是Sigma的试剂盒，不过没有加1％酪蛋白氨基酸，我看过的文献BMMY培养基上清总蛋白浓度一般这个范围。

BCA法应该也可以，但是6g/L的总蛋白浓度似乎太高，不过也有可能，因为1升培养基你加了10g酪蛋白氨基酸。

另外你绝对不能根据你所谓的SDS-PAGE的蛋白含量来计算你的蛋白表达量，实际值应该要小很多很多倍，酵母粉、蛋白胨和酪蛋白中那么多的蛋白降解片段和小肽等，电泳上是看不出来的，你过柱时光吸收值5000mAU，这就说明了5000mAU绝大部分是BMMY培养基中的杂蛋白。

感谢husiyi兄出来给我解答！

我也不知为什么BCA法测出来这么高，

我用TCA法将上清沉淀后，跑电泳，后来见蛋白质技术手册上说用TCA法沉淀上清能去除干扰物质，我就测了下TCA沉淀后的蛋白浓度，经过换算，是153mg/L。

TCA法应该不沉淀小肽吧？我记得以前做空载体对照的诱导表达，好像沉淀不出东西。

那我该如何估算我目的蛋白的表达量呢？

我见过都是用SDS-PAGE分析目的蛋白占上清总蛋白的比例阿，然后根据上清总蛋白推算。标准的方法该是什么样呢？

SDS-PAGE上显示不出小肽，显示的只是分泌的蛋白，这样的话推算也该比较准的吧？

我的GS115宿主放在-80°C冻存有两年多了，最近拿出来做了感受态做转化，用的是LiCl法，载体是pPIC9，按照推荐的量最后铺板，生长48h后RDB板上密密麻麻一层，设阴性对照同样也长了一层。我觉得可能是GS115的组氨酸缺陷标记丢失了，于是用RDB ＆RDBH板筛选（这两个板我没配错可以确定），结果挑了16个单菌落化版在RDB板上也均能生长，我不知道是不是全部冻存的GS115均已丢失标记，大家有遇到过这种情况嘛？能给我一些建议？

我在两年前做过一批酵母转化，用此方法均很顺利的就挑出来阳性克隆，那个时候宿主是刚刚和别人讨来的应该是筛选过的。其他试剂我都重新配过了应该没有问题。

组氨酸缺陷标记丢失不太可能

因为GS115菌株组氨酸基因本身就是整合在基因上组的

保种菌株搞混倒有可能，说不定是一个你以前的转化菌株

"原始单克隆菌重复生长"是这个意思:单克隆菌摇起来再涂板的话,也会长出许多个,它们其实是一种,这对于以后筛选多拷贝重组子来说增加了无谓的困难。

sooow，你好！你说的方法我看到了，正在尝试，只是煮了煮，没有液氮处理，扩了两次，可能是我挑菌后用无菌去离子水稀释的浓度不对，或是其它原因，还没有扩增出来，我会继续摸索条件的。

husiyi 你说的方法在Invitrogen手册上是用96孔板，小孔液体培养的，我看过外文也有在电转化之后，将转化子直接涂不同G418浓度的YPDS平板（不是涂MD平板），我还没有试过这种方法，我现在是要筛选MD板上长出的HIS＋重组子，我觉得这个方法不合适，还是对"原始单克隆菌重复生长"有顾虑。因为课题是以应用为主的，必须为后面的高产着想。用极少量的菌涂YPD－G418板，浓度提高，我会尝试的。谢谢你们

依我看过的文献和我们这边表达的至少十几个不同类型的蛋白来看

高拷贝对应高表达在99％的情况下是瞎扯，尤其对分泌表达的蛋白来说

决定蛋白分泌表达水平的一个重要因素是蛋白在胞内正确折叠和信号肽分泌处理过程，很多蛋白表达量太低基本上都是由于这个问题

酵母对二硫键的加工能力有一定局限性，所以二硫键含量较多的蛋白，以及一些很大的蛋白表达不是很好 我个人认为MD板结合G418－YPD板筛选的主要作用是利用两个标记进行―双保险‖筛选，保证挑选的克隆基本是整合了目的基因的阳性克隆，但是不代表重组蛋白一定会有表达

毕赤酵母表达知识归纳5

影响蛋白分泌表达水平的因素有很多，如:蛋白本身性质、基因剂量（拷贝数）、启动子类型、信号肽种类、细胞内蛋白折叠能力、蛋白降解以及培养条件、诱导起始菌体浓度、诱导时间等等。这些从DNA、转录、翻译到翻译后加工水平的各种因素都可以说是蛋白高水平分泌表达的必要条件，不是充分条件。在起始条件下，可能某一因素是限制条件，如基因剂量。你提高了基因拷贝数，表达有所提高。提高到一定水平，细胞内蛋白折叠能力又成为了限制因素。加入分子伴侣提高了折叠能力，表达提高了，这时蛋白降解问题又出来了。所以具体蛋白要具体分析。能找到蛋白表达水平的特定限制因素那就是水平。就单一强调某一因素而不结合具体表达目标情况，那都是片面的。

毕赤酵母表达系统现在研究的热点包括：

1 寻找新的启动子、信号肽和筛选标志；

2 蛋白折叠、聚合和降解；

3 表达蛋白糖基化；

4 表达全抗体、膜蛋白及富含二硫键蛋白；

5 基础研究包括过氧化物酶体、基因组测序（已完成，正注释）。

哎！我的问题解决了！！！！！！冷丙酮造成的盐共沉淀，不是蛋白沉淀！！！！！

看来我的分泌表达量是太少了，做了半年了，哎！！！！

我该如何优化表达条件，提高表达量呢？？我半年的工作时间呀！！！！！！

我也碰到了类似问题。请问，你如何知道是―冷丙酮造成的盐共沉淀‖呢？

1.蛋白沉淀为絮状,盐沉淀呈片状晶体;

2.我用tca沉淀做了对照,沉淀两很少,在有丙酮不预热沉淀会很少,不过还是盐沉淀.

就是这样了!

Casamino acid 中文名叫什么呢？

能加热灭菌吗?

酸水解酪素，可以加热灭菌。没有问题。

1、采用pyrimidine 兄弟推荐的毕赤酵母高效转化实验方案,方法附后.果然每个MD板子上长了上千个克隆.但是洗涤菌体后,稀释200倍涂G418板子,在2~4mg的G418上都没有生长.相反,上次每个MD板子上只长了30个左右克隆,在在2~4mg的G418上都有生长.大家知道什么原因吗?

2、在G418板子上长出的克隆,大家都用什么办法,简捷而又准确地知道蛋白是否表达了呢?是否PCR鉴定正确的克隆,都能表达呢?

1.对于能用抗体检测的表达产物,用western blot法,可以直接检测电转化后MD板上生长出来的HIS+转化子,方法就是在BMMY平板上,覆上NC膜(无菌),用牙签将菌落点到膜上,培养几天,期间往平板盖上补加甲醇,因为是倒置的,甲醇挥发可以补充培养里的甲醇消耗. 到时取出NC膜,检测,通过显色圈位置与大小,就可初步判断是否表达与表达量的多少.

2.另外的情况,就是没有抗体可用的. 遇到上千个重组子要筛选的话,真的很头疼,看到很多发表的文献上,用G418浓度梯度,从最小的0.25mg/mL,0.,4mg/mL. 操作条件和检测效果真的有这么理想么? ? ?假若1000个重组子里有一个是抗4mg/mL的多拷贝,其他都无抗性,这一个重组子也会增值,可能在每个浓度梯度的板上都会长,在4mg/mL的板上也可能会长出好多个,结果做花了这么多功夫,到底还是就那么一个. (这是推测了,但可能就是事实)

所以当你面对 --几千--个MD板上长出的HIS+转化子时, 是---喜悦还是苦恼呢?!

(除了Invitrogen手册上,在96孔板里传3代,使每个转化子都达到相同的稀释外),还有什么好方法能使每个转化子的浓度均一? 或有什么更简便有效的方法?

用G418浓度梯度,想把梯度放大,少做几板,有什么经验可以参考呀? 请教了

对于楼上的，我也有相同的困惑。如果载体是pPIC9K,pPIC3K,这样转化出的重组子可以进行G418筛选，如果对于普通的载体转化的重组子除了进行营养型筛选，PCR鉴定目的片断已经整合到酵母基因组中，对于其是否表达，表达产物的量 多少，大家有没有好点的方法啊？

对于楼上说的鉴定多拷贝的烦恼我也理解，

不过我觉得如果你的转化子很多的话，

也就说明你的转化率很高，

形成多拷贝的几率也越大，

我这几次做的时就是直接点到G418 4mg/ml的平板上，

这样虽然费点事，

但是各个克隆还是独立的，

比较可靠！

G418筛选不能用点的方法，你会发现所有的克隆在高浓度平板上都会长。应该是把MD板上的菌落全洗下来，稀释到一定浓度，然后涂板。

0.25 0.5 1 1.5 2mg/ml，我做了这几个浓度，每个浓度就是一个板，不是很多吧？ 可以看到每个板长得菌落数是越来越少，长出来的时间也越来越长。

当然存在你从0.25板上取得可能是抗更高浓度的，可以通过杂交法准确确定拷贝数的，说明书上提到了。

但肯定不存在venthcat说的那种情况，高拷贝生成的几率是非常低的。

电转化过程，生成了低拷贝的基础上才能生成高拷贝。

我的结果是1.5的表达量最高，2.0的虽然蛋白总量挺高，但目的蛋白并不是最多的。

我们不可能对每个转化子都去比较它们的表达量，而且它们之间差距并不大，我觉得后面的条件优化对表达量的影响更大。

一般的做研究生课题，表达了就达到了你的目的了，可以找上十几个比较一下。

本人刚开始作毕赤酵母表达，碰到了一个实质性问题，我的欲表达蛋白前端有一个信号肽，设计引物时没有注意到这个问题，现在就带着信号肽直接连到载体上了，前面的工作都作完后，发现甲醇诱导表达的上清液中检测不到目的蛋白，不知是不是我引入的这段信号肽影响了目的蛋白的表达，请高手赐教！急！

应该不会，信号肽是被切割后，目的蛋白才分泌到培养基中的，也就是说，只要酵母本身切割彻底，你的目的蛋白就能够在培养基中得到。

这几天做表达，

我觉得我的目的蛋白条带较弱，

而且在前面有不明条带，

我怀疑是被降解了，

不知毕赤酵母本身分泌的蛋白酶都是什么了？

怎么可以避免降解了？

我用的是BMGY/BMMY培养基，

谢谢了！

蛋白酶的成分很复杂，研究没有意义，如果想避免降解，可以注意以下方面：

1.优化培养基PH值，从3到6，不影响酵母生长，用添加缓冲液的方式来调PH值。

2.加入酸水解酪素，1％比例，可作为保护剂。也可以添加一些蛋白胨。

3.降低酵母表达温度，可以试验25度，这样蛋白酶的活性会受到抑制。

请问个位战友：

煮-冻-煮提酵母DNA方法很灵验么

为什么我做了两次都没有呀

用了5AOX和3AOX引物和目的基因的引物都没有个扩出来，以前用化学方法做出来过呀 ！

望赐教 ！！

煮-冻-煮提酵母DNA方法,我试了6次,只有上次不成功,但是我认为我作的转化肯定没有问题,所以我用玻璃珠法抽基因组DNA,在PCR,2.2kb,目的条带都P出来了，不过就是麻烦了一点。但是这个方法很好用，不管是啤酒酵母，还是PICHIA，都没有问题。

玻璃珠法提取酵母基因组DNA

1）接种到5ml YEPD液体培养基中， 30℃，250RPM过夜培养。

2）把培养液转到15ml离心管，4000RPM离心5分钟，去上清。

3）用3ml 灭菌水洗细胞，离心去上清。

4）把细胞悬浮在500ul 细胞裂解液中，并转到1.5ml Eppendorf管中。

5）加入250ul~300ul玻璃珠， 并加入25ul 5M Nacl.。

6）在蜗旋震荡器上最大速度震荡一分钟。.

7）2000rpm 离心2 minute。

8）用1ml的移液枪把液体转到1.5ml Eppendorf管中。

9）加入500ul Tris平衡酚（ph8.2）, 用手剧烈摇1 分钟,13200rpm 离心1 分钟。用1ml的移液枪把水相（上层）转到一个干净的Eppendorf管中。

10) 加入500ul SEVAG(24:1 氯仿: 异丙醇), 用手剧烈摇1 分钟,13200rpm 离心1 分钟。用1ml的移液枪把水相（上层）转到一个干净的Eppendorf管中。

11) 加入 1ml 预冷的95%乙醇并在 -20℃沉淀DNA一个小时。

12) 13200RPM离心5 分钟,去上清, 用70%的乙醇洗两次，把DNA悬浮在500ul的TE中。

13) 加入 50ul EDTA-Sark 和3ul RNa (10mg/ml) ,在37℃孵育30分钟。再加入 2.5ul

proteina K (20mg/ml) , 在37℃孵育30分钟。

14) 加入17ul 5M Nacl , 终浓度为0.15M, 重复步骤9和10。

15）13200RPM离心5 分钟,去上清, 用70%的乙醇洗两次，把DNA悬浮在200ul的TE中。

缓冲液：

细胞裂解液 : 0.1M Tris-Hcl (pH 8.0)

50mM EDTA

1% SDS

EDTA-Sark: 0.4M EDTA(pH 8.0)

2% Sarkosyl

TE : 10mM Tris-Hcl

1mM EDTA (pH 8.0)

to 超马兄， 你说的细胞内外的蛋白都是一样的，

我倒是没做过验证，

但是我总觉得细胞内的应该是带有信号肽的，

如果你说的正确的话，

那么也就是说，

当信号肽分泌到细胞膜的时候，

Kex2信号肽酶切割完了又回到胞内了？

还是外源蛋白有ATG，信号肽没有翻译，

直接从你的外源基因开始翻译？

望赐教！

我上次表达的外源蛋白没有自身的ATG，而且没有kex2酶切序列（当时怕酶切不完全，没有设计），我想信号肽应该是在内质网完成切割的，停留在胞内进行糖基化，磷酸化等修饰。这样胞内带信号肽的外源蛋白量很少，western的时候看不出来，而切了信号肽的外源蛋白占了绝大多数，不知我说的是否正确？.

这次我要表达的外源基因没有自身的信号肽，为一个膜蛋白，我想是否 需要将它自身的ATG也要设计进去呢？谢谢

你说的―信号肽应该是在内质网完成切割的，停留在胞内进行糖基化，磷酸化等修饰。‖我觉得是正确的，

毕赤酵母表达载体pPIC9K上的信号肽是引导外源融合蛋白到内质网的，

但是要分泌到细胞外就得靠a－因子，

a－因子是一个13个氨基酸的多肽，

也就是说从内质网出来的蛋白，

在外源蛋白的N末端仍然有13个氨基酸（a－因子），

最后在分泌到细胞外的过程中被kex2酶切割，

成为合适的外源蛋白，

不知是否正确？

望赐教！

毕赤酵母表达知识归纳6

最近做了一次电转化失败了，想了好多原因，不太明白啊。 这里我想问一下，我看资料和书上都说转化时间是4.2-4.9ms,

但我用的电转化仪是BTX的ECM830的型号，它在高压模式下时间只能调到最高200μs,只有在低压模式下才可达到ms，不知道这个是不是会影响到转化的成功啊，希望高手指点一下，很急啊！谢谢！对了忘了说我用的载体是PPIC9K,酵母是GS115,外源基因是用SalI线性化酶切后进行转化的。

转化时间不是通过设置来确定的，这个参数不用调，我也没见哪个地方可以调，设好电压、电容和电阻就OK了，按pul，然后会出来电击的一个曲线，那就是转化时间，和样品及电转杯用的次数有关。如果你的转化时间在那个范围，说明比较正常，如果小于4ms，说明盐多了，记得以前有人这么说过。

还想问一个问题，质粒线性化后需要纯化吗？是如何进行纯化的？

我是这样做的，不知道有没有什么毛病，请指教

酶切产物纯化

①加1ml树脂，混匀20s（不要vortex）

②连接miniprep和枪管，将混合物加到枪管内，用真空泵抽吸

③加入2ml 80%异丙醇，待液体完全流尽后干燥树脂30s

④将miniprep转到1.5ml离心管中，10000×g离心2min

⑤将miniprep转到新的1.5ml离心管中，加50ul预热65℃的去离子水，放置1min

⑥10000×g离心20s，洗脱DNA

⑦保存于－20℃冰箱中

需要纯化，等体积的酚/氯仿抽提，然后2倍体积无水乙醇沉淀，一定要用70%的乙醇洗两遍，去除盐，盐多了，可能击穿电转杯。

乙醇沉淀比用柱回收的好。

毕赤酵母表达知识归纳7

1. 磷酸钾溶液手册说要过虑,但能否高压灭菌呢?

2. 未转化的酵母单克隆YPD培养液在摇了16h后,菌体像豆腐渣的,这样正常吗?

1 磷酸钾溶液高压灭菌没有问题

2 肯定不正常，是不是染菌了，涂片看看。

某些外源性蛋白在酵母中表达不理想，但经过基因优化以后有不少蛋白还是可以获得一定量的表达。常见的优化方式有密码子优化及发卡结构消除。我们实验室已经有两个这样的情况通过上述办法得到解决。一个基因的表达主要也就转录和翻译两步。如果说还有一部比较关键的话，也许再加一步分泌（在此，只讨论分泌型表达的情况），这样就算作三步：转录、翻译、分泌。那一步有问题都将导致表达量过低，但就我个人认为转绿应该不是大问题，诸如密码子优化、二级结构消除等优化策略均直指翻译一步且效果不错，最近看到一篇文献，作者针对于其表达的基因从mRNA水平、蛋白质水平分别进行了检测结果发现野生型低表达与优化后告表达在mRNA水平上无明显差别，而在蛋白质水平有较大差别。翻译和分泌我个人认为可能是影响目的蛋白表达的关键环节。先说翻译，密码子的偏好性无疑是影响蛋白表大量的一个关键因素，基因二级结构比如发卡结构也应当是一个重要因素。但是在基因优化过程中一味地选用高效密码子或单一地消除二级结构都不见得有好的效果。因此有关基因优化的策略还希望有高人贡献一下自己的心得或大家一起探索一些可能的策略。最后，分泌一步导致培液中蛋白量过少或没有可能确与蛋白自身有些关系，更换信号肽或选择其它表达方式可能是一条出路。

今天最想和大家讨论也是最想求助与大家的是：如果要通过Real-time PCR去分析一个外源基因的mRNA水平（哈哈，别笑我太奢侈）选择一个什么样的内参合适，beta-actin？GAPDH？酵母中是否也有这些看家基因。我没有能从NCBI上查到酵母中这两个基因的序列。希望有哪位知道的施舍一下。

提高表达量的方法有很多:

1 构建多拷贝质粒

2 选用酵母偏爱密码子

3 增加产物稳定性,在培养基中加PMSF,蛋白水解物等

我也正在进行Pichia的表达，可是在诱导过程的第2，3 天是，酵母液的颜色变红且味道发臭，请问这是污染吗？我一共摇了3次，都是这种情况，请问有什么可以预防的方法吗？

是污染了，我的也曾经出现过这种情况，但我不知道污染的是什么，记得以前也有人讨论过这个问题，好像是一种酵母，也有人说是老化了，预防的话就是严格无菌操作，另外你的培养基是否已经被污染了，我感觉我的就是培养基时间长了，被污染了，重新配了就好了，另外，我不知道你是怎样诱导的，你最好在MD板上划菌，调单菌落，因为有时板上也会长出红色的菌落的啊，good luck!

1、酵母分泌的蛋白酶在pH中性附近活力高。表达液彻底离心后,调节pH避开中性范围。

2、蛋白质几次冻融应该没大的问题，故先分装-20度冷冻保存。

3、另外，可根据情况加入蛋白酶抑制剂。 我用的是Difco 0919-07,的YNB 无氨基酵母氮源, 250g装,

For classifying yeasts bad on amino acid and carbohydrate requirements

Ammonium sulfate .....5.0g/L RT

这是 北京拜尔迪生物公司" 的YNB（无氨基酵母氮源），BD 291920(原DIFCO公司)，250g，价格：￥680/250g，现货，Ammonium sulfate------5.0g/L，含有硫酸铵，请参考。

134g用1L去离子水融解,就是10X的YNB了,不用加其它成分,过滤除菌就可以,不能高压(我就是这样做的,我们实验室就是买的这家公司的)

G418我们这用的是上海生工的 SD6308, 40mg/mL的

GS115的基因组DNA的提取方法分子克隆上讲的很清楚,采用更简单的方法,就是反复煮冻煮,我就是这样做,扩不出来再煮冻,做了好几轮PCR,最后出来了扩增很亮,结果重复性也很好(当然是用G418对HIS+转化子进行了高拷贝筛选之后的重点菌落做的,需要鉴定的菌落个数也不多,十有七八都是阳性的,需要有耐心).

我还没开始做，现在遇到一个问题是，怎么能使信号肽被完全切掉，一个氨基酸残基都不剩，因为不知道剩下的氨基酸残基会不会影响蛋白的活性，所以现在要先构建一个质粒，使其信号肽能100%被切掉。

所以请教一下高手们关于各种信号肽及其切割位点的信息。

几天以后：最近查了一些文献，α因子信号肽包含83个氨基酸残基的前导肽及后面一段由lys—Arg(Glu—Ala)l-2或Lys—Arg—Glu—Ala—Asp—Ala氨基酸序列组成的间隔肽。膜结合蛋白酶KEX2基因产物识别lys—Arg—C端，STE13基因表达产物则识别(Glu—Ala)或Asp—Ala外侧。前导肽和间隔肽对蛋白质的正确切割和分泌至关重要，但有时由于上述两种基因产物的切割活力不同，会在外源蛋白的N端产生不同的切割位点，使一些分泌的蛋白N端带有(Glu—Ala) 融合序列 ，即产生酵母信号肽切割不完全现象，也就是我在上面提到的问题。但是还是有很多人用以α因子为信号肽的载体并得到了成功表达。也有一些人采用别的信号肽来克服这方面的问题。迄今我查的基本上是中文资料，所以还要继续努力。

我要做的蛋白N端对活性很重要，所以需要一个信号肽可以完全切掉的载体，目前正在查这方面的资料。各位园友谁比较了解这方面，望多多指教！

有没有人试过低温表达酵母(30以下), 据说有助于蛋白结构的折叠,对分泌表达也有好处. 试过的请说一下,在什么温度下表达,效果如何?

我做的就是在28度下表达的，量还可以至于对于空间结构的影响没有鉴定过.

毕赤酵母表达知识归纳8 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。

甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较

1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+

强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++

3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。+++=

4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。=+

5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低++++

+ 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多

EasySelect Pichia Expression System

产品性能：

优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化

缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题

全面产品报告及心得体会：

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。

毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。

第一步——构建载体

Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用

抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。

leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。

基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等情况后，当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐怖，有100KD，本来当然应该放在大肠杆菌中表达，但是为了分泌表达（其实后来发现大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错）和糖基化修饰（主要是这个方面，因为我的蛋白是人源的，表达出来用于酵母双杂，因此需要有完备的糖基化修饰）。这样我的DNA片段由于较长，所以在做克隆的时候也要非常小心，需要注意的是：

①酶切位点不能出现在目的DNA片段中——如果片段长无法避免，可以采用平末端连接；

②虽然α-factor可以自动切除，但是在设计表达的时候，如果在N端不能出现任何多余的aa（比如药物蛋白表达），需要特别留意（说明书上有详细说明：P13）；

③有三种不同的读码框（对于pPICZα系列来说就是对上α-factor序列），在设计克隆的时候要反复确定自己的读码框是否正确，这可是致命的问题；

④无论pPICZ还是pPICZα都有TGA（终止密码子），但是pPICZ系列没有ATG（起始密码子），有人认为酵母启动子与外源基因的ATG之间的距离越短对于表达的该基因越有利；

⑤如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子；

⑥Pichia的密码子与酿酒酵母的相似，有关基因表达偏好密码子的问题有人认为没有必要更换，有人认为一定要换，个人认为以产量为主要目的的可以考虑更换基因密码子，而如果片段过长就比较麻烦，不过有许多真核保守蛋白其实是和酵母密码子相似的；

⑦克隆菌株需要有recA，endA，试剂盒带有的TOP10挺好用的（其它像是DH5α都行），但是要注意带有筛选抗生素Zeocin的培养基要用低盐培养基（NaCl减半），这主要是因为怕影响到抗生素作用（Zeocin平板要避光保存）；

⑧测序引物可以用α-factor信号引物，也可以用5'AOX1引物； ⑨如果需要高量表达，可以考虑做克隆的时候串联基因片段进行表达，另外也可以在转化酵母的时候重复转化。

⑩目的基因中最好不要含有pro-glu-r-thr这样的序列，因为这个序列是激活蛋白水解酶的作用底物，会影响表达，另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x这样的序列（x=任何氨基酸），因为这些序列容易受到容酶体的切割，而且目的蛋白末端最好是ala,asp,val,r这样的氨基酸。除此之外许多高A+T含量的基因通常会由于提前终止而不能有效转录，也需要多加注意。

第二步就是将线性化的DNA转化入Pichia酵母中。

Xiang

Yang：EasySelect试剂盒准备了三种菌株：X33，GS115和KM71H。我倾向于选择X33，因为这个菌株转化率和表达量相对而言较高，如果你有电转仪（electroporator），可以尝试一下。如果没有的话，EasySelect也准备了化学转化试剂——EasyComp

Transformation，但是由于转化率的缘故，我建议使用电转仪。

leslie：在得到了正确的序列之后就可以准备转化毕赤酵母了，试剂盒携带有的是X-33，GS115和KM71H这三种毕赤酵母（另外常用的还有SMD1168），每种酵母的特点有些不尽相同（Manual上写的很清楚），其中X-33由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而GS115与X33一样都是属于MUT＋表现型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响，KM71是MUT-型酵母，在甲醇培养基中生长缓慢，但是也有利于翻译后加工，比如形成二硫键，糖基化等等，另外SMD1168则是基因组中的Pep4基因发生突变，造成蛋白水解酶活性的丧失，可以保护表达产物免受降解，促进表达量的提高。

一般来说，如果是胞内表达，应尽量用Mut－细胞，这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量相对较多(约占Pp总分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰胆碱酯酶B变异链的含量占到90%，使下游纯化更易进行。而对于分泌蛋白的表达，无论是甲醇利用慢

(Mut-)还是甲醇利用快(Mut+)的细胞都可应用，如在人血清白蛋白(HSA)(为分泌型蛋白)的表达中就看不出两种类型的细胞之间有什么明显差别。

所以一般手册都会建议同时在这几种菌株中进行转化，这主要是因为不同的基因在不同的酵母菌中可能表达量截然不同，因此在最开始的时候建议多用几种酵母菌实验。

另外有个保存问题，原始酵母菌一定要保存好，因为酵母在传代多次后会影响其转化率和表达量，所以一方面分多管分装保存于-80℃，另一方面如果出现了转化或者表达的问题，在其它方面都没有出错的前提下可以考虑重新取出新菌液（每次都要涂平板挑菌）。

在准备酵母菌的同时也需要准备质粒，由于酵母菌转化对转化质粒的要求较高，量也较大（5-10ug），因此许多时候都会用PEG大提质粒，或者用大提试剂盒，总而言之要准备好足够量的质粒，并且不要忘记也要同时准备空载体以做对照。在转化前质粒需要进行线性化，这主要是为了增加重组率（EasySelect试剂盒表达量高的一个重要原因也就在于其原理是将目的片段整合到载体上，大大的增加了目的片段的表达）。线性化位点个人认为也会影响到表达量，对于基因片段不大的蛋白可以考虑用几个线性化位点同时进行转化筛选，但是如果片段大，就有可能供选择的机会少，而且也有可能遇上没有合适的线性化位点的情况，这个时候也不是说不能进行表达，但是准备的质粒就要增加10倍，另外也可以进行部分酶切（即先进行预实验，掐定时间和酶量保证被切开的质粒有部分是在线性化位点切开而基因片段保存完好）。

在线性化之后的质粒就可以酒精沉淀回收了——中间步骤需要使酶失活，说明书建议是热失活或者EDTA，个人认为前者比较好，主要是担心EDTA对于转化的影响，另外这三种酶失活的温度都是65℃/20min。沉淀回收之后是离心10分钟，用80%的酒精洗涤后风干，这一步需要多加注意保证风干完全，因为有实验证明残留的酒精对于转化的影响颇大。

接下来就是酵母转化了，这是令许多人头疼的一步，也是影响实验决定表达的关键步骤。转化方法有不少，例如电转，化学转化，原生质体转化，其方法的难易程度和转化率高低呈反向递减的，也就是说电转最容易，转化率较高（但要求有电转仪），而原生质体最麻烦，而且效果不好（比较传统），因此不建议使用，EasySelect说明书上这么建议，并且也详细说明了电转，化学转化（EasyComp和LiCl）方法的过程，可以按部就班。需要注意的是：

（电转过程）

①最好每次都从平板上挑酵母菌，用培养过的酵母放置时间不要超过一个星期；

②扩大培养的浓度一定要控制好，个人认为不需要OD600达到1.3-1.5，1.0-1.3的就好，这个时候的酵母比较新鲜，转化率比较高；

③整个感受态制作过程中一定要在冰上操作，离心最好也用冷冻离心机，这是影响转化的关键——为了进一步保证这一点，无菌水可以是冰水混合物，另外山梨醇和电转杯都要预冷；

④电转仪需要预热，所以准备感受态的时候就可以把电转仪打开了，电转后山梨醇的加入要快，曾有人做实验证明晚一秒就会降低转化的数量级，虽然不一定可信，但是我个人也认为这个过程要快，电转后可以看看时间，如果时间过短（比如〈4）就可能说明杂质较多，会影响转化率；

⑤转化后温育是个增加同源重组，增加存活率的过程，需要注意不要感染了大肠杆菌，再加入培养基30℃摇一段时间，可以取部分涂板（不同浓度抗生素），或者也有人将菌短暂离心，弃去上清，剩余全部涂板以保证转化率。

（化学转化）

如果没有电转仪，LiCl转化是一种可供选择的方法，转化率是102到103cfu/ug。

主要过程为：

取过夜活化培养的菌液按1：1000接种于15ml新鲜的YPD液体培养基，30℃培养至OD600达到0.8-1.0；4℃，4500rpm离心5分钟，用8ml冰预冷的无菌水洗涤菌体，倾除洗涤液，用1mL

，4℃，4500rpm离心5分钟，沉淀用50μl冰预冷的100mmol/L LiCl悬浮，最后定容至80-90ml。

LiCl转化 取适量单链鲑精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上备用，取上述制备好的感受态细胞12

000rpm，离心15s，吸弃LiCl溶液，按顺序依次加入

50%PEG 240ml

1mmol/L LiCl 36 ml

单链鲑精DNA 25ml

线性化质粒DNA 10 ml (约10mg)

用吸头反复吹打，使细胞沉淀与加入的溶液混匀，30℃静置温育30min，42℃热击20-25min，4500rpm离心10min，吸弃转化液，细胞沉淀加1ml

YPD培养基于30℃ 200 rpm培养2-4hr，取转化混合液100ml涂布含100µg/mL ZeocinTM

的YPDS平板，30℃培养2-3天。

第三步——挑克隆筛选

Xiang

Yang：在protocol中用了许多篇幅来指导这一步，包括如何去通过平板筛选，观测生长速率来确定Mut表现型等。这个过程需要3到5天，而我一般只用用了4个小时进行PCR（AOX引物）筛选。

leslie：完成转化后就是克隆鉴定的过程了，包括高拷贝筛选，PCR鉴定和表型鉴定的过程，其中我做的比较多的是PCR鉴定（因为比较快），具体过程protocol上说的很清楚，其实也很简单，就是冻融破菌进行菌落PCR，但是其中许多具体细节问题也挺让人头痛的，第一就是破壁的问题，许多人用PCR方法进行鉴定都无法得到结果，甚至在表达出了以后还是无法得到这张鉴定图片，主要原因之一就是无法正常释放酵母基因组，一般通过培养菌然后进行沸水和-20℃冷冻循环过程裂解细胞在目的蛋白片段比较合适的范围以内是可以得到好的结果的，但是有时候片段过长，模壁就会阻碍扩增，所以我们实验室会用蜗牛酶（很便宜的酶来的）来帮助溶菌，我看许多实验室也会这么做，不过加入的时间不同而已，其次也有奢侈的用试剂盒的。

第二就是是模板量，个人建议模板真的不要加太多了，按照说明书的上的5ul我觉得还是多了，而且建议总体积不用这么大，当然加入模板的量也与自己培养菌的浓度以及用来冻融的菌数量有关。其次是假阳性和假阴性结果，在Mut-和Mut+情况是不一样的，如果用的是5'AOX引物，KM71H会出现3.6kb的片段，而Mut+则会出现AOX1基因原本长度的片段——大约长2.2kb，因此如果的基因片段长度相似，要注意区分。建议PCR过程中使用多对引物进行反应，包括自己基因的，α-factor的，5'AOX的，都可以，反正各种对照多了有利于比较——当然前提是你不能晕了头。

掉了毛的鸵鸟：巴斯德毕赤酵母包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的启动子的转录终止子(5‘AOX1和3‘AOX1),他们被多克隆位点分开,外源基因可在此插入,此外，载体中还包含组氨酸脱氢酶基因(HIS4)选择标记（HIS4区的整合方式为位点特异性单交换引起的基因插入，整合后使组氨酸缺陷型宿主（his4）恢复野生型.HIS4区或AOX1区位点的整合都使转化子具有HIS4基因，因而可利用表型差异进行筛选，酵母GS115具有组氨醇脱氢酶缺陷型基因his4，可接受含HIS4的载体而具有HIS＋表型以筛选转化子.）及3‘AOX1区,当整合型载体转化受体菌感受态细胞时,他的5‘AOX1和3‘AOX1能与染色体上的同源基因重组,从而使整个载体和外源基因插入到受体菌染色体上，在加入甲醇作为唯一碳源的培养基中,外源基因在5‘AOX1启动子的控制下表达.在载体中引入Tn903Kanr基因(抗G418)有助于筛选高拷贝转化子,转化子的拷贝数与抗G418的能力有关,通过筛选抗G418能力强的酵母即可获得高拷贝转化子.外源基因是以同源重组的方式插入到酵母菌的染色体中,因此不易丢失，多次传代后酵母仍能稳定表达外源蛋白，具有良好的遗传稳定性.

第四步——表达

Xiang

Yang：将你的克隆在YPD培养基中培育到OD600值达到6.0，就可以离心收菌。用表达培养基（比如BMMY）重悬沉淀，在30ºC培育过夜。

leslie：筛选鉴定出自己的重组子可以说什么都不能证明，还是要看这一步的酵母表达，有许多人在酵母表达上花费了大量的时间——不同于大肠杆菌的两天出结果，一次毕赤酵母的表达就需要起码一周的时间，筛选了上百上千的克隆，但是仍然是竹篮打水一场空，我个人建议如果在筛选完3批以上就可以放弃这一批转化的酵母菌，另外调整进行重新转化。

另外刚开始的时候可以用小量表达，可以用5ml：生长慢型，生长快型，阴性对照（空质粒），阳性对照（可以是曾经表达成功的重组子）和没有进行转化的酵母菌的单克隆，BMGY中培养到OD值2-6，离心收菌（如果怕污染或者麻烦，可以放置酵母菌一段时间，一半为20-30分钟，让菌沉淀下来，小心倾倒去上清培养基获得菌），转入BMMY中诱导表达，这些步骤都需要在超净工作台里进行，如果要区分是否染菌，可以取一些到显微镜下观察，或者闻气味（酸甜的是酵母），观颜色（乳白色的是酵母）。除此之外，如果是小量表达，有可能会在没有达到4天的时间培养基就，所以可以适当补充一些，以及在摇床里放置盛有无菌水的深口瓶，来保持摇床里湿度。

诱导物甲醇注意要在超净台中打开，可以分装到灭过菌的瓶子中——当然甲醇是不能灭菌的，而且也要注意在用酒精灯过甲醇瓶口的时候要小心，如果真的引起爆炸那可就损失大了。另外如果觉得每天添加甲醇麻烦，也有人用一次性注射器透过纱布添加甲醇，这个方法可能会造成染菌，慎选。说到纱布就想到了通气性问题，酵母在无氧和有氧的情况下都可以存活，但是在甲醇诱导的情况下毕赤酵母用的是醇氧化酶，自然氧气量对于这一基因的表达影响重大，但是由于害怕感染大肠杆菌，纱布裹的也不能太少，最好专辟出一个摇床进行三十度酵母表达，这样可以考虑将纱布减少到3—5层，同时需要注意的是摇瓶内菌液体积不要超过10-30%。

每天取样出来进行SDS-PAGE电泳鉴定，能这样最好，不过每天做胶跑胶染色真的很麻烦，可以汇集一批同时跑，不过样品一定要煮过冻存，而且每次取样不要反复冻融，最好分装保存——因为蛋白经煮沸变性会不稳定，容易降解。另外为了防止蛋白在分泌出来的过程就降解了（特别是小分子蛋白），也可以通过调节培养基pH值抑制蛋白水解酶的活性（这一方面说明书讲解得详细），还可以加入酪蛋白氨基酸等保护物质，竞争性抑制蛋白水解酶的活性来防止表达产物降解。

如果使用的是分泌型培养基，按道理收集培养基上清就可以进行下一步分析了，但是由于培养基中的蛋白浓度PAGE胶一般是检测不出来的——除非你的表达蛋白量非常大。所以需要进行浓缩，方法有TCA法，硫酸氨盐析，PEG沉淀，透析，超滤等等，当然最简单的就是煮沸蒸发水分浓缩了。另外跑胶的时候同时对照酵母胞内蛋白，以防没有分泌出来。SDS-PAGE的配置参见分子克隆，注意你的蛋白大小与胶的浓度的对应性，如果小到20kD以下，可以考虑用tricine胶，不过是个需要全盘重新准备的过程，要考虑清楚。如果选用的载体是带有信号肽的，虽说是分泌表达好纯化，但实际上毕赤酵母本身还是有本底表达的，而且有时候会造成假阳性，所以最后表达过程需要用Western

blot或者Elasa，通常都是用WB，具体的细节可见Western

Blotting前传：想成为高手吗？系列文章，另外要提一句的是，如果本身蛋白没有合适抗体（如果是利用从大肠表达出来的蛋白做出的抗体也有可能与用真核系统表达出来的蛋白无法发生免疫作用），可以选用anti-myc或者anti-his的，前提当然是你的蛋白没有提前终止。

其它在表达中可能出现的情况包括表达量低，没有分泌表达（针对pPICZa系列），头两天蛋白量较大，无法重复，表达出来的蛋白偏大等等，需要分各个方面分析原因，比如蛋白明明加上了信号肽，但是就是无法分泌出来，这可能是蛋白结构在通过细胞膜的时候受到了阻碍，可能需要重新转化，更换线性化位点或者更换菌株；如果蛋白表达第一天较高，但是之后越来越少，这很有可能是蛋白降解了或者产生了竞争表达；毕赤酵母无法重复的问题比较严重，许多情况下在第一次获得了高量表达之后就再怎么也重复不了这个结果，遇到这种情况真是令人非常痛苦，可是除了重新摸索条件还能怎么样呢？而表达出来的蛋白分子量偏大则是个正常现象，除了糖基化以外还有其它原因，比如二聚体，这些需要进行WB或进一步实验验证。

第五步——发酵和产物纯化

Xiang Yang：我用的是HisTraP Columns（GE

Healthcare），经过简单的纯化之后我可以得到90%的目的蛋白。我的目的蛋白是一个大小为45kDa，可以通过二硫键形成反向平行二聚体（antiparallel

homodimer）的糖蛋白，经过纯化，我通过一个细胞增殖实验（cell proliferation

assay）检测了其活性，结果表明表达出来的蛋白在体外有完全的活性。并且我也在体外利用受体分析了蛋白结合活性，与对照（通过大肠杆菌和Bacular细胞未带tag的蛋白）相比，his-tag有一点副作用。

伊可丽：由于在摇瓶培养中巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的水平往往不能准确地反映罐发酵中的表达情况，使之成为令人头痛的问题。主要原因是在摇瓶培养中，培养液的pH值无法控制，培养物通气不充分及无法控制添加碳源的最适速率。但是为了避免对每一个表达菌株进行繁琐的发酵罐培养条件的实验，仍需摸索表达菌株的摇瓶培养条件，使其产物的表达量与预期的发酵罐培养结果相近。

总而言之，EasySelect系统是一个便于操作的酵母表达系统，我已经使用这一系统表达过15个类似物了，每一个我都获得了超过1mg/1升培养液的纯化蛋白。

毕赤酵母表达知识归纳9

以pPIC9K为例，pPIC9K是用于在毕赤酵母中的多拷贝整合分泌表达蛋白的穿梭载体，利用组氨酸缺陷型标记进行互补筛选。

一、信号肽的2步切割 pPIC9K载体带有自身信号肽，在分泌过程中被切除，但是由于切割效率，在目的产物N端带有3－5个左右的信号肽的氨基酸。

设计引物时，为了防止切割不完全，能去掉GluAla两个重复单位，不过文献报道多个Glu会提高kex2的切割效率。

要求目的蛋白中不能含有信号肽酶切割序列：glu-lys-arg-glu-ala-glu-ala。

信号肽的切除分为两步：kex2在glu-lys-arg和glu-ala-glu-ala之间初步切除，STE123在两个glu-ala之间切割。

二、是否在3' 端是带上一些其本来的序列？

1,首先，你要保证表达后细胞内信号肽酶能正确识别原来的位点，即此位点是不能随便增减的，否则信号肽不能正常切割，在这个基础上你再决定3' 端其本来序列的去留。

2，一般5'端多出一些氨基酸不会明显影响到你的目的蛋白的活性，我们平时在做酵母表达时，信号肽切割后，目的蛋白往往有几个多余的AA，这对活性好象没什么影响，虽然如此，但你还得注意多余AA的性质，不能过酸或过碱。

三、重组pPIC9K/GS115表达出目的条带后，

确定信号肽是否切除完全的方法：

1、N端测序

2、先查查你的氨基酸序列里有没有糖基化位点，如果有就只能N端测序了。如果没有，看分子量大小。

信号肽中有kex2和ste13两个酶切位点，现在担心的是kex2的位点酶切完全了，但ste13的两个酶切位点glu， ala重复序列没有切干净，如果这两个氨基酸没有切除完全的话，分子量差异不大，两个氨基酸的差异应该看不出来，一般来说，N端多一两个AA应该对蛋白的活性没有太大影响。western检测有两个条带的问题，可能是目的蛋白有一部分被降解了。

四、附：信号肽切割原理和优化切割

《Expression of Your Recombinant Protein with a Native N-terminus》

If you wish to have your protein expresd with a native N-terminus, you should clone

your gene flush(直接地) with the Kex2 cleavage site. U PCR to rebuild the quence from the

Xho I site at bp 1184-1189 to the arginine codon at nucleotides 1193-1195. Remember to include

the first amino acid of your protein, if necessary, for correct fusion to the Kex2 cleavage site.

Signal Sequence Processing

The processing of the α-factor signal quence in pPICZα occurs in two steps: 1. The preliminary cleavage of the signal quence by the KEX2 gene product,

final Kex2 cleavage occurring between arginine and glutamine in the quence

Lys-Arg * Glu-Ala-Glu-Ala, where * is the site of cleavage.

2. The Glu-Ala repeats are further cleaved by the STE13 gene product.

Optimization of Signal Cleavage

In Saccharomyces cerevisiae, it has been noted that the Glu-Ala repeats are not necessary

for cleavage by Kex2, but cleavage after Glu-Lys-Arg may be more efficient when

followed by Glu-Ala repeats. A number of amino acids are tolerated at site X instead of

Glu in the quence Glu-Lys-Arg-X. The amino acids include the aromatic amino acids,

small amino acids, and histidine. Proline, however, will inhibit Kex2 cleavage. For more

information on Kex2 cleavage, plea e (Brake et al., 1984).

There are some cas where Ste13 cleavage of Glu-Ala repeats is not efficient, and Glu-

Ala repeats are left on the N-terminus of the expresd protein of interest. This is

generally dependent on the protein of interest.

continued on next page

五、翻译Genebank所查序列

为设计一个引物，在Genebank上查找序列如下：

CDS 序列是 57～560， sig_peptide 从 57～119， mat_peptide 从 120～557。

问题如下：

1、sig_peptide和 mat_peptide 各代表什么意思，sig_peptide是不是就是信号肽，哪mat_peptide

是什么？

2、sig_peptide前面1～57是序列的什么部分？

3、cDNA序列中除了CDS是编码区外其它部分主要起什么作用，在设计引物时应该从第一个碱基开始还是从信号肽开始，还是从CDS的第一个碱基开始！

答：sig_peptide 信号肽，mat_peptide 成熟肽，就是切除信号肽以后的成熟蛋白元件。sig_peptide前面1～57是5‗非编码序列，它一般含有Kozard序列，在翻译起始过程中发挥作用。3‘非编码序列是帮助翻译的终止。

母转化原理：

Like Saccharomyces cerevisiae, linear DNA can generate stable transformants of Pichia

pastoris via homologous recombination between the transforming DNA and regions of

homology within the genome (Cregg et al., 1985; Cregg et al., 1989). Such integrants show extreme stability in the abnce of lective pressure even when prent as multiple copies.

Note that single crossover events (inrtions) are much more likely to happen than double

crossover events (replacements). Multiple inrtion events occur spontaneously at about 1-10% of

the single inrtion events.

像酿酒酵母,线性化的转化DNA和Pichia pastoris基因组的同源区域发生同源重组,使得线性化DNA产生稳定的转化子(Cregg et al., 1985; Cregg et al., 1989).这样的整合方式显示极强的稳定性,即使多拷贝转化子在没有选择压力的情况下也很稳定.单交换事件(插入)比双交换事件(置换)发生几率更大.单插入事件中约发生1-10%概率的多插入事件.

电转化注意点：

一、 制备感受态的菌液收集时间：

1、准确测定OD值：OD在1.2～1.5之间。

1） 为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系）。每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能OD稀释倍数不够！

2） OD值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。

2、75ml的菌，经18h左右的培养，最后sorbital洗涤完毕后，50ml离心管里所剩菌体特别浓，需要1ml sorbitol才可溶解为糊状。正常培养的OD在1.2～1.5之间的500ml菌液，收集的感受态也用1ml稀释的，没那么粘稠。可以看看降低培养温度（27摄氏度）或缩短培养时间（12h）。

3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50－100mlYPD中摇过夜，效果也很好

二、制备感受态的菌液量

如果只转一个样品，50ml就够了，一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。用大试管摇5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态，每一步的离心时间30秒就行。整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。

山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。

三、感受态的保存

感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。如果感受态细胞要保存，不需要加甘油，一般80ul EP管分装，-70 或 -80 摄氏度保存。 另附：酵母GS115点种分离纯化

接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布 YPD平板，30℃培养48 小时，用 YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。

四、电转化注意点：

1、感受态做好后，最后一次吸出sorbital时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。

2、最后用毛细管取出100ul出来，加入质粒，混匀！（怕量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。 ）

3、电转杯清洁处理:一般先冲洗，洗净；然后浸泡在75%的乙醇中；使用前我们都是放在超净台上，开启紫外，边吹风晾干，边进行紫外照射。电转杯的新包装或重复使用可能对转化率有一定的影响。

4、电击的时候，电压数以及电击时间可以摸索一下，适当增加电压或者延长电击时间都可以。电击条件比如1.5kv，放电4.8～5.5ms。电击所有过程都要尽量在冰上进行，电击时间可以减少一点，设置为5ms左右，电击之后马上加入预冷的山梨醇溶液，转移至EP管，30度静止培养1h。如果菌体悬液浓度比较大的时候，在制备感受态的时候要留心一下操作中的问题了。

5、电击之后，加入1ml的山梨醇，吸入1.5ml的ep管中，置于30度摇床低速培养1h，再涂板。

6、注意的是处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。

7、转化后1ml用sorbitol重悬的细胞悬液不能全部涂在一块板子上，按标准程序制作的感受态一般3块左右可能比较合适，以干燥后看见一薄层淡淡的白色为宜。转化子会在白色的薄层上长出圆韵、饱满的大菌落的。

五、转化试剂和培养基的正确准备方法

1、MD板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候吸收效果会好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。

2、YNB42度水浴一会，然后过滤除菌，YNB是加到培养基里面的，去离子水pH偏低，建议直接用蒸馏水就可以（关系不是太大）。

3、山梨醇，以及无菌去离子水均是冰冻，存放在4度冰箱中

4、一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul ddH2O重溶。转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。有人用LiCl和DTT处理细胞，转化效率很高，可以试试。建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。

5个电转化方案

方法一：高效

1.收集菌体

取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中，4℃、10000g 离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。

2.菌体处理

加入1ml处理液，室温下放置20min。

处理液：

10mM LiAc

10mM DTT

0.6M sorbitol

10mM TrisHCl(pH7.5)

3.离心，弃上清，加入1ml 1M sorbitol ，离心，弃上清，

4.用1M sorbitol洗涤二次，到最终体积约为80μl.（菌体太多可适当弃去部分）

5.加入10μl.经过BglⅡ酶切处理的工程质粒，混匀后转入 电击杯中，冰浴5min.

6.电转. 1.5kv，25μF，200Ω条件下进行电转。

7.电击后立刻加入1mL 1M sorbitol，吸出后于30℃培养2h。

8.取一定量涂平板(YPDS + Zeocin，涂布的量分别为100、200微升，剩余的经离心处理后全部涂在一个平板上)

有一点要注意的是处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。

方法二：按下面步骤转化,开始每个板子只长了一二十菌落;小细节修改后,每个板长了约100个.

步骤如下：

1、目的DNA（pPIC9K)，经电泳检测已经线性化（SalI酶切）；

2、DNA纯化方法是经酚仿－氯仿两步抽提后，无水乙醇沉淀的，目测定量应足够；

3、GS115甘油菌经新鲜平板复苏后，5ML培养过夜，16h左右后，取菌1：100稀释，接种于70ml菌液扩大培养，14h后测得OD600约1.3左右。 4、将sorbital、水和菌液均冰浴；

5、菌液离心5min－100ml冰水洗涤－50ml冰水洗涤－4ml sorbital洗涤，然后溶解于300ul冰sorbital；

6、加入约5～10ug的DNA，枪吹匀，置0.2CM电转杯静置5min；

7、电击，1,5KV.

8、立即加入1ml冰浴的sorbital，静止10min。

9、取100ul转化液，涂布10cm的MD平板。

做了一点修改每块板子大概能长100来个菌落（一般需要2天左右）：

1、菌液收集时间：以前可能是OD值测得不太准确，我然后把菌液分别做了1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系。1、菌液测OD值时，建议将菌液稀释不同浓度测定，这样才准确些。菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能就是你的OD稀释倍数不够！你分别稀释2倍、4倍、8倍、10倍等，每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！

2、我开始是先挑单克隆于5mlYPD中，过夜16h后，转接于50ml YPD中，培养大概18个小时吧。OD值是否测准可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。[测OD，用什么作空白对照呢？菌体稀释液，我一般使用PBS]

3、电击条件等上面帖子上都有，1.5kv，放电4.8～5.5ms。

2、其它做法相同，就是感受态做好后，最后一次吸出sorbital时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。

3、最后用毛细管取出100ul出来，加入质粒，混匀！（我以前怕量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。 ）

4、MD板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候吸收效果会好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。

5、你说的YNB，我用的是成品，只需要直接配制。42度水浴一会，然后过滤除菌。我没有加硫酸铵。YNB是加到培养基里面的，去离子水pH偏低哦，我建议直接用蒸馏水就可以了（关系不是太大）。

方法三：简便独特

在筛选高表达菌种中，与大多数人和说明书有区别(成功做出几个基因):

每次转化前，均用多种酶BlgII/salI/sacI同时切，转化时，用GS115/KM71/KM71H同时转化，转化的条件也和大家一样，即1.5/25/200,但是我用的是0.1的杯子，不是0.2的，转化后涂MM及YPD+0.25G，长出菌落后，即进行大规模的表达试验，直接用YPD表达的，一般48h后即进行大量的SDS-PAGE鉴定，鉴定时，样品不用浓缩，直接上样，看到目的带后再做PCR，测序。

方法四：没有转化子（无aa的YNB和硫酸铵称好后，去离子水溶解，然后高压灭菌）

1.挑取酵母单菌落，接种至含有50ml YPD培养基的三角瓶中，30℃、250-300rpm培养过夜约14h，OD600约1.3

2.菌液离心5min－50ml冰水洗涤－25ml冰水洗涤－2ml sorbital洗涤，然后溶解于200ul冰sorbital；两管分装，每管100ul

3.加入约5～10ug的线性化的DNA20ul，枪吹匀，置0.2CM电转杯冰浴5min；

4.电击，1,5KV.使用的是 Eppendorf 2510，用于转化细菌及酵母。

5.立即加入1ml冰浴的sorbital，静止1h。

将菌体悬液涂布于MD平板上，每300µl涂布一块平板；

方法五: 和Invitrogen公司说明书差不多的方法

X33菌株于100ml YPD摇到OD600约1.1-1.3，太高影响感受态效率

(1) 1500－1700g离心5min，将离心管倒置在吸水纸上轻轻控几下，充分弃上清

(2) 加入100ml 冰浴的超纯水ddH2O，可在振荡器上振荡混匀，可静置3－5分钟

(3) 离心，弃上清，再加100ml ddH2O洗一遍

(4) 离心，弃上清，加20ml 冰浴1M Sorbitol洗一遍

(5) 离心，弃上清，菌体置于冰浴中，加入约100－200ul Sorbitol混匀

加入Sorbitol量需自己调整，这时菌液很浓，只要能够用200ul黄枪头吸出来就可以了，一般共有约400－500ul，够做几管感受态了。

(7) 吸取100－150ul感受态到线性化的DNA中，用枪头打匀或手指弹匀

静置5min，于2mm电转化杯中，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400），一般放电时间在4.5-4.9ms之间，小于4说明你的DNA盐浓度太高

(9) 立即加入1ml Sorbitol，转入10ml 离心管，30度静置1小时，然后加入1ml YPD，30度，200rpm摇1小时，取50－200ul菌液涂100ul/ml YPDS板

(10) 一般转化效率可以达到：200个以上转化子每200ul菌液，足够筛选表达菌株了。

方法六:酵母感受态细胞的制备

⑪ 接种Pichia pastoris GS115于5 ml YPD液体培养基，30℃，250~300250 rpm ，过夜。

⑫ 取200µl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的三角摇瓶中，28~30℃、250~300r/min培养过夜，一般12小时左右。

⑬ 将细胞培养物于4℃，5000g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；

⑭ 按步骤3离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬； ⑮ 按步骤3离心，用20ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；

⑯ 按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为2ml；

⑰ NOTE：可将其分装为200µl一份的包装冷冻起来，但如果保存时间过长会影响其转化效率。

酵母PCR的6种基因组提取方法

1、简易微波炉加热/-20℃冷冻法提取基因组

在微波炉中档加热1min，-20℃2min，(如果你怕之前效果不够，加热骤冷这两步可以重复一次)加入20ul水，振荡1min，离心30s，上清作为PCR模板。

附：

1.挑选克隆培养过夜；

2.取1ml（或500ul）离心，收集菌体，蒸馏水洗一次，1ml山梨醇洗一次，（轻轻吹打），离心，收集菌体；

3.溶于100ul蒸馏水，80‘C/10min,可在PCR仪中完成；

4.离心，收集上清

，引物可以用5‘AOX, 3‘AOX引物

或这个方案：

1.取1ml菌液2500rpm离心5min，弃上清

2.用500ulPBS悬浮沉淀，2500rpm离心3min，弃上清

3.100ulTE融解沉淀，沸水浴10min，－70‗C冷冻40min，1500rpm离心，

4.再次沸水浴10min，1500rpm离心，

5.取上清为模板，以5‘AOX1和3‗AOX1引物进行反应

2、手册的溶壁酶法： ―毕赤酵母基因组的提取‖方法完整的步骤

⑪ 接种重组和空质粒转化子于5ml YPDZ培养基， GS115菌于YPD培养基作对照，30℃，培养16～18小时。

⑫ 室温下，1500 g离心5-10min收集菌体

⑬ 100 ulTE（pH 7.0）重悬，加入300 ul EDTA（pH 8.0），0.07M Tris－HCl，3 ulβ-巯基乙醇，1ul Lytica ，37℃水浴30 min。

⑭ 10000g离心5~10min，取沉淀，加90ul TE重悬。 ⑮加入1 ul 100x proteinK ，10ul 10xSDS，56℃作用30min。

⑯ 200ul 饱和酚，200ul氯仿，混匀，离心30s ，取上层水相。

⑰ 加入两倍体积无水乙醇以及1/10体积的NaAC，-20℃放置30min；

⑱ 10000g离心20min，弃上清；75%乙醇漂洗沉淀一次；

⑲ 干燥后，加入15 µl的TE或H2O溶解，-20℃备用。

手册中酵母基因组的提取的方法，称之为―溶壁酶法‖，还有其他的一些方法，例如―酸性玻璃珠法‖，还有一些试剂盒的提取等途径，等等。

―溶壁酶法‖法的主要原理是在EDTA存在的情况下，用proteinK（蛋白酶K）消化真核细胞，用SDS溶解细胞膜并使蛋白质变性。核酸通过有机溶剂（如氯仿，饱和酚等）抽提进行纯化。这种方法可以产生十微克至数百微克的DNA。{利用Lytica（sigma公司）打破细胞，释放重组质粒，需要通过离心收集质粒，以备下一步利用蛋白酶K和SDS作用于质粒，提取整合有外源基因的DNA。}

3、参考―精编分子生物学‖上的方法，省去玻璃珠这一步，PCR扩出目的基因，效果还不错。

（1） YPD 培养基的配制：15gYPD粉末,来自Clontech公司,溶于300ml水中，6分钟121℃高压灭菌后，加入4.5 ml Adenine 溶液（Adenine，Sigma,200ug溶于10ml 0.5M HCl中 ）。

（2） 取YPD培养液3ml 到15ml 离心管中，挑AH109 酵母单克隆到培养液中，30℃，200RPM，4小时培养。

（3） 用10ml YPD培养液培养次级AH109，过夜。

（4） 3000RPM，10分钟离心。用0.5ml水重悬。移液于新的1.5ml EP 管中，在室温下离心，倒掉上清，快速振荡。

（5） 取少量酵母菌沉淀，加1 ml消化缓冲液（见《精编分子生物学》,包括：100mmol/L,NaCl;

10mmol/L, ; 25mmol/L EDTA; 0.5% W/V,SDS ）及蛋白酶K（20 mg/ml）,使终浓度达到0.1 mg/ml，65℃水浴使充分消化。

（6） 取出200ul, 加200ul酚/氯仿（1：1）高速震荡3分钟。加TE 200ul, 高速震荡，高速离心13000RPM，5分钟。

（7） 加1/2体积 7.5mol/L (NH3)Ac 及两倍体积无水乙醇,颠倒混匀,室温下13000RPM,3分钟离心。冰70%乙醇洗涤。

（8） 去上清,干燥沉淀, 30ul 无菌水溶解。测OD，-20℃保存。

4、参考细菌总DNA提取方法，简化摸索得到，提取酿酒酵母和毕赤酵母完全可行。产物足以用来做N多次PCR模板。如果使用试剂盒提取的话会非常的纯。 （1）、菌体培养：出发菌先培养18-36小时，获得足够的菌体。

菌体收集：取1.5ml培养液于1.5ml离心管中，12000rpm离心20秒，弃上清，收集菌体（注意吸干多余的水分）。

（2）、消化：每管加入200mg/ml的蜗牛酶50μl，RNa 5μl，处理30-60min。

（3）、裂解：向每管加入200μl裂解缓冲液（40mMTris-乙酸，pH 8.0 20mM乙酸钠，1mM

EDTA,1%SDS，其实就是加了SDS的TAE（50倍TAE母液和SDS母液）,用吸管头迅速强烈抽吸以悬浮和裂解细菌细胞。

（4）、沉淀蛋白：向每管加入66μl5M NaCl，充分混匀后，12000rpm离心10分钟，除去蛋白质复合物及细胞壁等残查。

（5）、得到上清液后

A:

将上清转移到新离心管中，加入等体积的氯仿，充分混匀后，12000rpm离心3分钟，进一步沉淀蛋白质。

沉淀DNA：小心取出上清用两倍的无水乙醇沉淀，离心弃上清。

洗涤DNA：用400μl 70%的乙醇洗涤两次。

室温或真空干燥后，50μlTE或超纯水溶解DNA，-20℃冰箱放置备用。

B:

使用DNA快速纯化试剂盒（其实胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒都可以灵活使用）

5、军科院的方法：

（1）、用酵母细胞裂解液重悬酵母菌

（2）、加酚－氯仿

（3）、加玻璃珠

（4）、振荡半小时

（5）、乙醇沉淀

（6）、电转大肠杆菌

Detailed:

Plasmid Isolation from Yeast

Reagents and Materials Required

The YEASTMAKER Yeast Plasmid Isolation Kit (#K1611-1) provides the SDS and lytica

solutions, CHROMA SPIN-

1000 DEPC-H2O Columns, and 2-ml centrifuge tubes for u with the columns.

• Appropriate SD liquid or agar medium to keep lection on the plasmids (Appendix C.A; Appendix E).

• Sterile, 1.5-ml microcentrifuge tubes (or a 96-tube microtiter array, multichannel pipettors, and

centrifuge adaptor for multiwell plates).

• 20% SDS

• Lytica Solution (5 units/ml in TE buffer; store at 4°C for up to 2 months or at –20°C for up to

6 months. If colloidal material precipitates, mix the solution by inversion before using.)

• Recommended: CHROMA SPIN-1000 DEPC-H2O Columns (#K1334-1) and 2-ml centrifuge

tubes for u with the columns

• If you do not u CHROMA SPIN Columns, you will need materials to perform

phenol:chloroform

extraction and ethanol precipitation:

• Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1; See Sambrook et al., 1989, for information on

preparing neutralized phenol solutions)

• 10 M ammonium acetate

• 95–100% ethanol

e yeast cultures for lysis (Step a, b, or c below).

a. From a solid patch of growth:

i. Spread a thin film of yeast cells (~2-cm2 patch) onto the appropriate SD agar medium.

ii. Incubate plate at 30°C for 3–4 days. (The patch should show abundant yeast growth.)

iii. Scrape up a portion of the patch (~10 mm2) and resuspend the cells in 50 ml of sterile

H2O or TE in a 1.5-ml microcentrifuge tube.

b. From a liquid culture:

i. Inoculate a large (2–4-mm), fresh (2–4-day-old) yeast colony into 0.5 ml of the

appropriate SD liquid medium. Vortex tube vigorously to completely break up the colony

and resuspend the cells.

ii. Incubate at 30°C overnight with shaking at 230–250 rpm.

iii. Spin down the cells by centrifuging at 14,000 rpm for 5 min.

iv. Carefully pour off the supernatant and resuspend pellets in the residual liquid (total

volume ~50 ml).

c. For mi-automated handling of a large number of samples:

i. Place a large (2–4-mm), fresh (2–4-day-old) yeast colony into 0.5 ml of the appropriate

SD liquid medium in parate wells of a 96-tube microtiter array. Vortex each tube

vigorously to resuspend the cells. (Alternatively, u 0.5 ml of an overnight SD liquid culture instead of a yeast colony.)

ii. Using a centrifuge adapted for multiwell plates, centrifuge the entire array at 1,000 x g

for 5 min to pellet the cells.

iii. Carefully pour (or draw) off supernatants and resuspend pellets in the residual medium

(~50 ml) by vortexing or pipetting up and down.

2. Add 10 ml of lytica solution to each tube. Thoroughly resuspend the cells by vortexing

or repeatedly pipetting up and down.

3. Incubate tubes at 37°C for 30–60 min with shaking at 200-250 rpm.

[Optional] Check a drop of the cell suspension under a pha contrast microscope (400X) for the

progress of

cell lysis by adding a drop of 20% SDS to the side of the coverslip. As they come into contact

with the SDS, most

cells should lo their refractile appearance and appear as "ghost-like" spheroplasts. If there are

still many intact

cells prent, incubate the samples for another 30 min.

4. Add 10 ml of 20% SDS to each tube and vortex vigorously for 1 min to mix.

5. Put the samples through one freeze/thaw cycle (at –20°C) and vortex again to ensure

complete lysis of the cells.

6. If necessary, samples can be stored frozen at –20°C. If samples have been frozen, vortex

them again before using them.

7. Pour the entire contents of the tube from Step 5 above onto a prespun CHROMA SPIN-

1000 Column and purify the plasmid DNA according to the CHROMA SPIN Ur Manual.

Purified plasmid DNA will elute from the column.

If you do not u CHROMA SPIN Columns, clean up the prep as follows:

a. Bring the volume of the sample up to 200 ml in TE buffer (pH 7.0).

b. Add 200 ml of phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1).

c. Vortex at highest speed for 5 min.

d. Centrifuge at 14,000 rpm for 10 min.

e. Transfer the aqueous (upper) pha to a fresh tube.

f. Add 8 ml of 10 M ammonium acetate and 500 ml of 95–100% Ethanol.

h. Place at –70°C or in a dry-ice/ethanol bath for 1 hr.

i. Centrifuge at 14,000 rpm for 10 min.

j. Discard supernatant and dry the pellet.

k. Resuspend pellet in 20 ml of H2O. Note: The amount of plasmid DNA recovered is small relative to the contaminating genomic DNA;

therefore, it cannot be measured by A260 or en on an agaro gel.

另外：酵母菌落PCR方法

Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法

模板的处理：

1.平板上的菌落长到肉眼可见时（约12小时）；

2.将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好，并分装。引物最好使用Kit中已有的检测专用的引物，或者一条使用载体上的引物，一条使用基因的特异性引物（这样做可以鉴定非定向克隆的方向）；

3.用半根灭菌的牙签（节约，而且好用）挑取菌落，在PCR管中涮以下，放入一个灭菌的1.5毫升离心管，对PCR管和1.5毫升离心管编号；

扩增，1％ 琼脂糖凝胶电泳；

5.对于PCR扩增显现特异性条带的克隆，把置于1.5毫升离心管中的半截牙签扔到5毫升YPDZ培养基中，30度培养，8－12小时后提质粒，酶切鉴定确认。

PCR反应体系：

以TaKaRa Taq DNA聚合酶反应为例，引物为5´ AOX1 primer，3´AOX primer：

组分 20μl体系

10xReaction Buffer 2.0μl

dNTP 1.6μl

Primer 1（20pmol/L） 0.5μl

Primer 2（20pmol/L） 0.5μl

ddH2O 15.2μl

Taq DNA聚合酶 0.2μl

TOTAL 20.0μl

PCR反应条件：

初始变性 94℃ 4min 1

变性 94℃ 30s 30个循环

退火 50~54℃ 30s

延伸 72℃ 30s

结束延伸 72℃ 10min 1

保存 4℃ 1

如果筛选的是Mut+，将会出现两条带，一个是目的基因，另一个是2.2kb的AOX1基因，空质粒会出现以下条带（pPICZαA 588 bp)，将两者的大小加在一起来解释出现的实验结果。

我的结果是空载体的有大约580多的条带，但重组子的PCR只有将近1000bp的条带（我的目的基因是400bp），没有2.2kb的条带。

6其它一法：

er 1.5 ml of liquid culture of yeast grown for 20 – 24 h at 30°C in YPD (1% yeast extract,

2% peptone, 2% dextro) into a microcentrifuge tube. Pellet cells by centrifugation at 20,000 × g

for 5 minutes.

2. Add 200 μl of lysis buffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH

8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0).

3. Immer tubes in a dry ice-ethanol bath for 2 minutes, transfer to in a 95°C water bath for 1

minute. Repeat; vortex 30 conds.

4. Add 200 μl of chloroform; vortex 2 minutes.

5. Centrifuge 3 minutes, room temperature, 20,000 × g.

6. Transfer the upper aqueous pha to a microcentrifuge tube containing 400 μl ice-cold 100%

ethanol. Mix by inversion or gentle vortexing.

7. Incubate at room temperature, 5 minutes. Alternatively, precipitate at -20°C to increa yield.

8. Centrifuge 5 minutes, room temperature, 20,000 × g. Remove supernatant with a pulled Pasteur

pipette by vacuum aspiration.

9. Wash the pellet with 0.5 ml 70% ethanol, spin down as described in step 8 above. Remove

supernatant.

10. Air-dry the pellets at room temperature or for 5 minutes at 60°C in a vacuum dryer.

11. Resuspend in 25–50 μl TE [10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0)] or water. Samples

obtained directly from plates should be resuspended in a 10 μl volume。 酵母表达外源蛋白的注意点和相关检测

1、 菌株

用GS115表达不出蛋白，换KM71H后，大部分克隆能表达。

2、温度：

在28度和室温下诱导表达，表达水平可能都不低。

3、pH

手册上用6.0，pH提高到6.8，不表达的蛋白可能就表达出来。BMMY的pH7.0-7.5比较合适。国内外做的最好的rHSA，最适pH大概5-6左右。pH3的时候yeast和peptone好像会沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氢钾调，具体比例自己去试试。

4、偏爱密码子

codon bias一般不是主要的问题，你要表达的蛋白特性才是主要问题，酵母对分子量大（30KD以上），结构复杂（如一些蛋白酶），二硫键含量多的蛋白往往不能有效表达，尤其是分泌表达。密码子改造对一些较小的而且结构简单的蛋白表达量的提高可能有一些作用。比如一位战友用Pichia酵母表达一个单链抗体，29KD，含有2对二硫键，表达量约几毫克每升，选用酵母偏好密码子全基因合成后，表达量没有什么提高。

5、表达时间与空质粒转化对照

诱导时间长了以后，是会有很多蛋白分泌出来的，时间越长杂蛋白就越多，且分子量都比较大。最好做一个空质粒转化的对照，这样就会比较肯定到底是不是自身的蛋白分泌的结果。

6、污染

每个样品从G418板上挑10个左右单克隆于2ml BMGY摇菌（30ml玻璃管，比LB管大一点），纱布一般用8层，一天左右看着比较浑离心，留样1ml，余1ml换2ml BMMY诱导表达，3,4层纱布足够了。

污染一般都是跟瓶口覆盖有关的原因造成的，只盖纱布肯定会污染。加盖报纸后，就再没遇到过污染。如果只用6层纱布，污染的可能当然很大，100ml三角瓶，装量10ml培养液，用橡筋把8层纱布和2层报纸拴紧封口，空气浴摇床。

7、不表达

蛋白有没有表达就要看你的运气了，一般重复2－3次实验都没有表达菌株，这个蛋白就放弃表达了。 8、表达量

30KD,10mg/L表达量已经很高，最直接的方法是发酵，一般提高5－10倍。大肠杆菌一样出现大团的超表达蛋白。

9、糖基化

酵母分泌表达的N糖基化是可以预测的，有如下序列：N X S/T就是潜在的糖基化位点，X为任意氨基酸，1个糖基化位点会加上1－3KD左右的糖基。另外可能还有O糖基化话，但是无法预测其位点，不过很少听说表达蛋白有O糖基化的。如果胞内表达，不存在糖基化的问题 。

10、表型与表达

重组SalI和BglII酶切产生单交换和双交换，结果就是产生Mut+和Muts表型的菌株；前者在甲醇诱导表达时生长快，消耗的甲醇多，后者生长慢，消耗的甲醇少，所以诱导表达时Muts表型要求更高的菌体浓度。一般用Mut+表型的较多，但是对某些蛋白Muts菌株可能表达的更好，只有试试才知道你的蛋白用那种菌株表达较好。

11、培养基

YPD：最基本的培养用；BMGY：诱导表达前培养用；BMMY：诱导表达用；MD：电转化后筛选his＋用。

YEPD是不能代替BMGY的，因为有葡萄糖，这样残留的葡萄糖会影响下一步的诱导表达。不过有一种方法是可行的，就是用YPG培养基代替，只是把YEPD中的葡萄糖用3%的甘油代替，也可以降低成本。摇瓶毕竟不能和发酵罐比，甘油残余会抑制甲醇利用。

BMGY、BMMY灭菌后才能加甲醇、磷酸钾、生物素。配制BMMY时也没必要用5%过滤除菌的甲醇，在灭菌后使用前加100%甲醇至你要的浓度。

YNB可以高压灭菌，没问题的，也可以0.22um过滤处理，天冬氨酸和苏氨酸要待培养基高压灭菌后加入；配YPD时可以加入YPD一起灭菌，但时间不能太长，温度不能太高，一般121-125度12-15分钟足够了。若时间过长，温度过高，可能导致YPD焦化。gluco和含氮化合物在一起容易产生美拉德反应，这是配制培养基中的禁忌。颜色很深的话，基本不能使用了。或者含有葡萄糖和/或YNB的培养基108度35min高压灭菌。

小量发酵其实可以把培养基成分中的YNB和生物素去除，培养基价格便宜，操作又方便，可以直接灭菌，效果也很好（效果不比含YNB的差）。

如果是用自己配置的培养基，如玉米浸提液、麦芽浸提液、麦麸浸提液等等，可以不用换液，采取添料来维持酵母对培养基的营养需要。 用无机盐进行大规模发酵，更省钱。

大规模发酵时，甲醇的流加速度增加不要太快。另外使用纯氧并不昂贵，在武汉买个钢瓶600元左右，一瓶纯氧20元。一个批次100h左右估计3－4瓶氧气。

关于Tryptone和Peptone的选择：

1）用培养的Tryptone替代Peptone对有些酵母菌可以,例如一般的表达酵母.但是对有酵母菌些绝对不行.例如做双杂交的AH109,Y187之类表达酵母，根本就长不好．

2）Tryptone和Peptone虽然都是营养胨，但营养成分不一样．即使是一般的表达酵母可以在Tryptone生长，生长状态也没有在Peptone中好．但tryptone和peptone就是含量上有点不同外，其他没什么区别，用peptone的目的不是为了提供氮源，提供氮源的是培养基里面的YNB。

3）如果要求不高，一般使用也还凑合．尽可能的用Peptone，difco公司的，晶美公司代理的，甚至是其它国产的蛋白胨都可以很正常的培养绝大多数酵母菌．

4）用含Peptone的培养基颜色很深，纯化表达蛋白时颜色要去掉，所以还要进行麻烦的后续处理。而改用Tryptone后，培养基颜色变得很浅，和LB（液体）颜色差不多，后续处理要简单些。invitrogen说明书说 peptone的作用是防止目的蛋白被一些酶类水解，加入peptone的目的就是竞争性抑制目的蛋白的水解，因为peptone是一些小的短肽，是一些酶作用的底物。

培养毕赤酵母,书上说BIOTIN储液是水溶液,但事实上BIOTIN很难溶于水, 可以稍稍水浴加热一下。配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：

1）、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；

2）、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；

3）、水浴加热，温度不能高于50度。

D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。MD、MM属于基础培养基，没有哪种成分会含有微量生长因子（如生物素）。所以肯定要加的。

附：无机培养基配方

BSM无机培养基：

85% H3PO4 26.7ml/L

CaSO4 •2H2O 0.93g/L

K2SO4 18.2g/L

MgSO4•2H2O 14.9g/L

KOH 4.13g/L 甘油 40g/L

PMT1 4.0ml/L

100%氨水调pH5.0(1瓶50ml加800ul氨水)或10g/L硫酸铵调pH5.0，氨水用于上罐调pH（便宜，方便）。诱导表达前调pH6.0。pH5.0是为了防止BSM形成磷酸钙沉淀，pH6.0是表达HSA融合蛋白的最适pH。

BSM高压灭菌后再加4.0ml/L 过滤除菌的PTM1(微量元素)4.0ml/L 。100%的500ml甲醇加6ml PMT1，用于补加甲醇诱导表达目的融合蛋白。

PMT1（1L）配方：

CuSO4•5H2O 6.0g/L

KI 0.088g/L

MnSO4•H2O 3.0g/L

Na2MoO4•2H2O 0.2g/L

H3BO3 0.02g/L

CoCl2•6H2O 0.5g/L

ZnCl2 20.0g/L

FeSO4•7H2O 65.0g/L

Biotin 0.2g/L

浓H2SO4 5.0ml

12、蛋白降解

分泌表达的目标蛋白比胞内蛋白确实容易被降解。可以尝试以下几种办法：1、尽可能降低培养液的pH值减少酶活，酵母生长pH值比较广，4～7都可以试一下；2、多试几种蛋白添加剂，充当酶解底物（比如酵母酸）；3、摸索最适下罐（摇瓶也一样），宁可少表达点也别给降解光了。实在没办法，只好换菌株或做pcr突变酶切位点（当然不能影响表达和蛋白活性）。

Several strategies have been reported as effective in minimizing the proteolytic instability of

specific foreign proteins creted into the is culture medium.

1）、The first is adding to the culture medium of amino-acid rich supplement such as peptone or

casamino acid, which reduce product degradation possibly by acting as execess substrates for one

or more problem proteas.

2）、The cond strategy to minimize proteolytic degradation is to optimize the culture pH between

pH 3.0 and pH7.0.

3）、The third strategy involves elevating the level ofammonium in the culture broth adequately, which is explained by the hypothesis that portea activity is induced under nitrogen starvation.

The forth strategy is let the culture temperature 28 deg instead of 30 deg.

连续两个或两个以上的碱性氨基酸相邻的结构，如果有的话，在这一位点是很容易被蛋白酶切断，产生偏小的多肽。

13、换液

通常用BMGY和BMMY是要换液的，但也可以不用换液。培养到菌液浑浊后，直接向BMGY里加甲醇诱导就行了。GS115在第4天达到了最高表达量。换液不是必要的，适量甘油的存在有时反而会使表达量提高，

10ml生长培养后，等体积换液。我用250三角瓶，装量25mlBMGY发酵2天，再取0.5ml加入BMMY（250三角瓶，装量25ml)中诱导发酵.

BMGY和BMMY的换液方式有2种：

1）一种是离心换液，即在生长培养结束后，转移到灭菌大离心管中，4000rpm室温离心5分钟后，用BMMY洗下菌体，再转移到摇瓶，整个过程均用灭菌移液管操作。另外2）一种是静止换液，即在生长培养结束后，将摇瓶在无菌室静止4小时后，直接在酒精灯旁倾倒培养液，再加入诱导培养基，此种方法的缺点有少量生长培养基残留。

是离心换液或者静止换液，到底那个好，只有根据自己的实验结果来考量。如果只是从防治污染的角度来说，静止换液也好一些，因为操作毕竟少一些，速度也快。

总之，无论是取样还是补料、加甲醇，尽量用灭菌的移液管（因为比较长，不容易引起污染）。当然，微量的如200ul，还是用移液器加（快而准确），可以在瓶口处往瓶内加入100％甲醇等。用新开启的分析纯甲醇，我们都没有过滤或者其他处理，一直放在无菌室里面，每次直接用灭菌TIP吸取加入摇瓶就可以了。实验室里也有人试过用膜过滤，结果膜都溶解了。

14、上罐表达

放罐时OD能达到400左右，生长过程最高OD500左右，重组蛋白发酵水平大约300-400mg/L。30g/L甘油初始培养OD约40左右，流加约420g/L甘油后，菌体密度达到最高约500。开始诱导后，起初3－5h之内流加的甲醇很少，发酵体积变化小，但是菌体的OD值是快速下降的，一般是原来的90%左右，每次都是这样，确切原因我们也还不清楚，估计是酵母从高速生长转向营养饥饿过程中，菌体形态发生很大变化，比如大小、含水量、折光率等。随酵母逐渐适应利用甲醇为碳源，mut＋型酵母的诱导可以将甲醇的流速逐步提高，此时仍然能发现OD值下降，我们认为这主要是发酵体积增加的原因造成的。我们诱导过程一般增加约40%的体积7L到10L，最终OD值约为最高OD值的80%左右，简单换算一下，应该知道菌体生物量增加约1/7。其实，这和毕赤酵母代谢甲醇途径也是一致的，甲醇首先被氧化成甲醛，一部分继续氧化成甲酸进而生成CO2，产生菌体所需的能量，另一部分可以被菌体同化，进入小分子碳架的合成途径，提供菌体生长所需的碳源。

15、菌体密度：

菌体是在BMMY中培养的，可以不用BMMY做对照，在600nm处测OD值，培养基和PBS光吸收都很低，PBS更方便。

麦芽浸提液培养酵母（不换液，补料），生长阶段结束后，密度可达到10-12，诱导培养结束后，密度可达到18左右。

如果用1体积的BMGY，在生长阶段结束后，换液时，加入1/10——1/2体积的BMMY进行诱导培养（即浓缩培养），细胞密度也可达到20以上。

通常，真正的高密度发酵只有在发酵罐里才能实现，OD600可达到40-60及以上。摇瓶很难达到那样的密度，不过可以采取浓缩培养的方式实现高密度。

摇瓶不能像发酵罐那样保证通气量，但可以通过装量来暂时替代这个指标。

17、菌种保存

用15%甘油做保护剂，-70度长期保存，-20度短期保存使用。不过要注意冻存前一定充分混匀，酵母菌体很容易沉降到EP管底部，保存效果大打折扣。

一般OD2-6的YPD过夜菌吸取300ul菌液到灭菌的ＥＰ管然后加等体积的甘油，混匀，放于－２０度．保存长的话最好放－８０度冰箱。

重组菌株传代次数太多，确实可能存在菌株退化的现象。这在用动物细胞表达系统如CHO，NS0系统更为明显，所以一定要保存好最原始的重组菌株，每次从中划板，挑单克隆表达，尽量减少菌株传代次数。不行的话再用相同的方法重新转化筛选高表达菌株。

GS115的鉴定方法

接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布 YPD平板，30℃培养48 小时，用 YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。GS115的his4基因突变了，不能在组胺酸缺陷型培养基上生长，一般的YPD培养基营养丰富，什么都有了，而YNB却只含基本氮源，GS115应该在上面不长，就是从YPD上挑菌落，在YNB和补充了HIS的平板上对应的点一下，在HIS上长而YNB上不长的是GS115，这样能挑到纯的，以防突变。

酵母知识归纳10

"用is进行胞内表达时，外源蛋白都是储存在过氧化物酶体里吗，一点也不会泄漏到胞浆中？

酿酒酵母和其它酵母都是这样？ 如果我想让表达的外源蛋白分布在胞浆中，我该怎样做。 "

自问自答：

用is进行胞内表达时，外源蛋白是在胞浆里而不是在过氧化物酶体里，只有给外源蛋白连上定位于过氧化物酶体里的信号肽才能将蛋白定位于过氧化物酶里

如何判断何时使用含有硫酸铵的YNB,何时用不含硫酸铵的YNB?我是用PIC9载体在GS115中表达膜蛋白.

说明书没有看的太明白.见笑了.

谢谢

10×YNB （100ml）

13.4g的YNB（含有硫酸铵）

3.4g YNB（不含硫酸铵） 和 10 g 硫酸铵

看了毕赤酵母表达系统的说明书，还是不明白a因子信号肽＼XhoI的两个酶切位点以及Kex2裂解位点之间的关系．我想用pPICZaA分泌表达蛋白，打算用XhoI和XbaI两个酶切位点，说明书里讲用XhoI可使蛋白具有天然Ｎ端，但这样会不会破坏信号肽，蛋白还能分泌表达吗？对表达蛋白的结构有没有影响？另外，还想请教一下如何确定是否有读码框移位？紧急求助，希望各位高手能帮助解答，谢谢．

用XhoI可使蛋白具有天然Ｎ端，不会破坏信号肽，这需要你在以xho1为酶切位点时，在引物上－－－补齐它之后的部分信号肽序列后－－－再直接缀上你的目的基因。而不是直接从XhoI位点就直接加入你的目的基因。你可以从相关文献上看看其它基因的具体做法。

确定是否有读码框移位，是要根据毕赤酵母表达系统的说明书pPICZaA的读码框，结合你目的基因本身的读码框来推导。

点杂交法

挑取单克隆菌落 点与MM板长到菌落明显肉眼可见，用灭菌的硝酸纤维膜贴上再让菌落长过夜，取下膜37度烘干，后面加奶粉封闭 一抗 后封闭 加二抗 后显影 后续同WB步骤一样。

我发现最近以来，又有很多新手开始做毕赤酵母表达的研究了，大多数都在讨论重组，电转化，筛选等问题，其实我也是才从迷惑中走过来一年的，现在觉得这些并不是最难的问题。

难的是阳性菌得到后，发酵证实产物发酵，表达的问题，纯化的问题。

但是这方面的问题和讨论确不多，只做构建是不完整的，表达纯化，得到一个最终的结论才有意义。

我对发酵问题感觉头疼，我的目的产物也很少（或者说还没有确定）， 我开始用的是5ml 的BMMY 在2.5cm口径的大试管中发酵的，曾做过一种基因工程抗原的表达，这对于用elisa检测是足够的，但发酵液直接跑电泳后，用western blot 检测，很难检测到，用硫酸胺浓缩10倍后，跑电泳后，用western blot 检测才能看到。 我还尝试过用100ml的BMMY 在500ml三角瓶中诱导，结果也不理想。

我现在做的是一种蛋白酶(没有太多的创新性，因为类似的从产品到文章，都做成了，而且有的产量和效果还不错) 。实验室没有条件上发酵罐，只能用三角瓶摇，但是这样发酵条件就很不好优化控制，产量也不知道会有多少。

酵母发酵液中有不少其它蛋白酶，所以跟底物作用，必须进行发酵液纯化后才能研究酶活，菌早就OK了，就是诱导培养，纯化不好，酶切了几次，没有明显的正确作用证明，有几次用的阴性对照发酵液上清也把底物降解了。耽误了几个月也没有得到满意的结果。

今天希望的结果终于出来了，用的是新发酵的上清液，也是用5ml 的BMMY 在2.5cm口径的大试管中发酵的，sds－page电泳显示，底物被清晰的切割成了需要的条带了。下面想多做点，纯化一些。

我决定严格按手册来做：

1.首先是依据目的蛋白的特性，选择用MM ，BMM，BMMY 做为诱导培养基。

2.要确定 MUT+ 或MUTs，然后根据不同的条件来诱导发酵，英文操作手册上关于这两种表型的发酵策略是很不相同的。

3.通气一定要好，发酵体积不能超过摇瓶体积的10%，所以我决定用1L三角瓶做。

最近刚开始作Pichia酵母表达一个7ｋＤ的蛋白，遇到一些问题，请各位高手指点。

我想将我的目的蛋白放入pPICZaA，选用了EcoRI和 NotI这两个酶切位点。这里有两个问题请教：

１．在Kex2 和Ste13消化后，我的目的蛋白的N端就会多出两个氨基酸，这多出的两个氨基酸会否影响我所需蛋白的活性？

２．Parental vector的C端有myc epitope and polyhistidine, 有二十多个氨基酸，会否影响我所需蛋白的活性？因此我想去掉myc epitope ，在我的引物中人为加上六个histidine，这样我的引物就太长了，会不会有问题。

多谢各位的参与和指点。

多出两个氨基酸一般不会蛋白的活性，在我的总结里有，大家多看，是个宝库啊。当然还要看你的蛋白质N断氨基酸是否是活性关键位点。你可以在目的基因上游用XhoI再加上KR，避免Ste13酶切，切的更干净，个人观点。

59bp引物都不算太长，但是要看你的目的片断和所用的聚合酶，如果用Pfu酶，建议你扩增的目的片断最好在1000bp以内，如果超过1500bp，可以使用重叠延伸PCR扩出全长片断。

想请教各位高手,我用GS115,pPICAZaA,分泌表达一个小肽,经过SDS-PAGE在相应分子量处出现了目的条带2.7KD.不过奇怪的是,0时刻的对照也就是未更换培养基的BMGY培养中也出现了该条带,只是没有添加甲醇后的颜色深.我在帖子中看到"通常用BMGY和BMMY是要换液的，但也可以不用换液。培养到菌液浑浊后，直接向BMGY里加甲醇诱导就行了。换液不是必要的，适量甘油的存在有时反而会使表达量提高."这样的话,不知道是否不添加甲醇,目的蛋白也可被表达呢?

(1)在0时刻,对照和表达的在同一位置都出现条带,不一定是同一个蛋白,有可能宿主菌在这一位置有表达蛋白质

(2)换溶液的目的一个是为了浓缩生长的酵母菌,另一方面也是为了加入甲醇可以更好的诱导.如果更科学的话,不妨两个方法都做一下比较

(3)一般说来,甲醇在不诱导的时候是不会表达的

(4)可以进一步做Western或Elisa验证

首先谢谢你回复我的帖子!我能确信该位置条带是我的目的蛋白,至于换培养基的目的我早已知道,我只是想知道在添加甲纯诱导的条件下,目的基因是否有可能被表达,因为我在其它文献中也曾经看在未开始诱导的0时刻处,也有条带,只是不很明显罢了,我想知道各位战友是否在做实验过程中出现过同样的现象.

请教一个比较菜的问题：酵母表态时为什么先要接种YPD培养后再BMGY培养基培养24h然后再接种于BMMY，直接接种于BMMY不可以吗？

YPD培养基是种子培养基,BMGY培养基是为了使菌体生长,提高生物量的，因为目的蛋白的表达水平与生物量的高低有很大的关系，而当表达目的蛋白时,为了使表达量尽量的高,因此较高起使生物量较为有利,此外表达目的蛋白的时候多数营养用于合成目的蛋白.因此不利于菌体自身的生长.BMMY培养基中是以甲醇为唯一碳源的，在此诱导条件下，可以诱导AOX1启动,使位于其下游的目的基因开始表达.

关于酵母分泌表达菌株的高产筛选，如果产物具有可westernblot检测的特性，是最为方便的了(用G418或Zecion也是不错的办法)。

去年表达的一个病毒囊膜糖蛋白的实验就是采用了westernblot的筛选方法，很好。将所有的His＋转化子，先是点对点（不实用影印法，而是用牙签单菌落挑的，工作量很大，一定要做好编号）做好原种，铺有NC膜（用铅笔划有格子）的MM（或BMMY等诱导的都可以）板诱导种平板（倒置平板，每天补甲醇，依靠甲醇挥发上升可使NC膜保持一定适度），培养约4天，揭起NC膜，洗去菌落后做westernblot检测，显色的有无以及深浅可以基本判断出阳性菌 及其产量高低（如图片），对于显色较深的可以再做摇瓶发酵，用96孔板Elisa法精确判断产量高低，或SDS电泳检测。

毕赤酵母表达知识归纳11

husiyi:

你好!象你请教下下,我用的是PPIC9K(ECOR1+NOT1插入我的目的基因,设计自带有6个HIS标签)载体,用SAL1线形化后电转入GS115,当时2天只长出两个菌,挑了做表达,第3天板上又长出许多菌但比前一天的小,这是假阳性的吗???没敢用,仍然用第二天挑的两个菌做筛选,在2mg/ml的G418都能生长，继续作表达,跑SDS-PAGE发现跟未诱导的菌体比诱导后的菌体明显有一个表达带，大小和我的目的蛋白差不多，诱导后上清（冻干浓缩后）有一个非常弱的带位置稍大（可能是电泳没压下去）．然后我扩大４倍体积又做了一次，效果并不明显，上清条带仍较弱（浓缩同前），上柱子后在１５０mM咪唑有个０．４７８的峰，但电泳效果仍不好，不知是上样浓度大还是什么原因，Ｍarker都挤歪了．纯化条带仍较若（需仔细辨认才行），另外，提酵母基因组做ＰＣＲ和提ＭＲＮＡ做ＲＴ－ＰＣＲ均没作出，不知道该怎么办了，望指点！！

我感觉你可能没有筛选到阳性菌株，有几个问题要注意：

1. 电转化只长两个菌（MD板？），转化效率太低，搞不好是假阳性。想办法优化条件提高转化效率比较好。这个我想在所有的步骤中最重要的一步。

2. 没明白你说的PCR是没作出来还是阴性结果？GS115阴性对照怎样？用的什么引物？如果你用5'AOX和3'AOX引物能扩增出2.2Kb酵母菌株本身条带而没有其他条带，才说明是阴性结果。用ＭＲＮＡ做ＲＴ－ＰＣＲ鉴定阳性菌株是―舍本逐末‖的做法，我还没听说用这个方法鉴定阳性菌株的。

3. 没确定目的蛋白有表达之前最好不要做纯化，不然浪费时间。要是纯化后看不到你的目的蛋白，分析原因比较麻烦，很难确定是本来就没有表达，还是表达量太低没有挂柱。

4. 单纯的表达上清电泳不是鉴定目的蛋白表达的好方法，除非你的蛋白表达量超高（100mg/L？)。酵母实际上可以分泌一堆蛋白到表达上清，可以找找前面的帖子，TCA浓缩后的上清可以看到很多条带。另外你的对照也不对，不能拿诱导后的菌体和跟未诱导的菌体比，应该用GS115菌株或者GS115转化了pPIC9K空载体和你的阳性菌株在同样的条件下表达，如果在相应的位置GS115没条带而阳性菌株有条带才有可能是真正的表达条带。

5. 既然你的目的蛋白加了Histag，最好用抗histag的抗体，用Western,Dot blot或ELISA鉴定表达上清。如果有自制的或公司的抗你的蛋白的单抗或者多抗也可以。个人推荐用Qiagen的抗histag单抗，虽然贵点，但性价比超好！好像4000块左右，0.5ml，可以1：1000－1：5000稀释。买好的抗体比浪费时间和其他试剂强。上清ELISA灵敏度在1mg/L左右，Western灵敏度更高。

6. 上柱子后在１５０mM咪唑有个０．４７８的峰，但电泳效果仍不好，这个峰很可能是酵母杂蛋白或者培养基中一些挂柱的小分子的峰。如果表达上清直接挂柱更明显，透析后会好一些，你可以拿点GS115空菌株表达上清试试，估计也有一个峰。

胡哥，感谢您提供的载体和菌株，我已将重组载体转到GS115中，菌落PCR得到目的条带，挑单菌落BMGY培养24(OD600=12)小时后，离心收集菌体，加BMMY洗涤后，用BMMY调OD600=1，诱导4天，每天加甲醇至0.5%并取样，但做SDS-PAGE电泳没有看到目的蛋白。我又重新做，这次用BMMY调OD600=30，诱导4天，每天加甲醇至0.5%并取样，仍然SDS-PAGE电泳没有看到目的蛋白，能帮我分析一下原因吗。

我又取诱导后的菌体涂在载玻片上，做免疫酶反应，在镜下只看到个别的酵母染色，不知是何原因。请指点。

还是同样的问题，表达上清直接电泳根本就不是鉴定蛋白表达的好方法，除非蛋白表达量很高。通常电泳都跑的比较模糊，看不清特异条带。如果是1mg/L表达量，电泳最多上50ul，也就是0.05ug，基本上超过了考染的检测极限。如果大于10mg/L电泳才勉强能看到条带。很不幸，大部分的重组蛋白在普通摇瓶条件根本达不到这个表达量。很多文献讲的高表达都是指发酵条件，并且优化了表达条件的。试试TCA将0.5-1.0ml表达上清浓缩成20ul跑电泳，看能不能检测到目的条带。

你说的酵母免疫酶反应，我没用过。你确定这种方法对毕赤酵母适用？不过你的表达条件有些问题。GS115转化子一般都是Mut+，用BMMY调OD600到30已经是很高的菌体密度了，再诱导4天，表达量不会有太多提高的，估计大部分菌株还没来得及表达目的蛋白都挤死了，空间太小，营养不足，养气太少，代谢废物积累的太快。

另外注意诱导表达的问题，不能超过30度，虽然酵母32度都不死，好像有时候目的蛋白表达对温度很敏感，尤其是高温，我一般都设定27－28度。

您试过每天添加甲醇到2%吗?

试过，表达量第1-2天差不多，第3天后降得厉害，估计是因为甲醇累积得毒性。不过不同蛋白可能不一样。

husiyi:

您好！我用TCA浓缩的上清跑了电泳，条带太多了。看不清楚哪条是表达的，做的WESTERN条带位置在30几KD，而我的片段1257KB,按理说是48KD,同样浓缩的空9K上清没有条带出现。这样算是表达吗？我是做的融合表达，分别用了两个抗体做，都是这样。搞不明白了！

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