25601207_野生动物源肠杆菌科细菌鉴定及同源性分析

2023年12月3日发(作者：家国情怀是什么意思)

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浙江畜牧兽医２０２１年第５期野生动物源肠杆菌科细菌鉴定及同源性分析刘龙海，黄淑芳，应志豪，张秀秀，陈玎玎，龚利洋，郑应婕（杭州动物园，浙江杭州３１０００８）摘要：本文主要对２０２０－２０２１年间分离自杭州动物园患病动物、死亡动物的肠杆菌科细菌进行鉴定和６ＳｒＤＮＡ技术鉴定细菌种类、通过ＭＡＧＡ６．０方法对１６ＳｒＤＮＡ扩增序列构建系统发生同源性分析。通过１树，并结合ＥＲＩＣＰＣＲ指纹图谱技术来分析分离的肠杆菌科细菌的同源性。结果共分离保存菌株３８株，经１６ＳｒＤＮＡ鉴定，其中克雷伯氏菌４株，埃希氏菌２７株，摩氏摩根菌２株，沙门氏菌１株，弗氏柠檬酸杆菌１株，哈夫尼氏菌２株，勒克氏菌１株；对埃希氏菌属构建系统发生树显示，置信度在９０％可分为２３个亚群，其中Ｅ１和Ｅ２６，Ｅ５、Ｅ６、Ｅ１７和Ｅ１８，从进化关系上看更接近，通过ＮＴＳＹＳｐｃ２．０软件对ＥＲＩＣＰＣＲ指纹图谱分析，在相似系数为０．８７时，埃希氏菌属可分为１８个亚群。该研究通过对杭州动物园野生动物源肠杆科细菌鉴定，以及采用ＥＲＩＣＰＣＲ对埃希氏细菌的同源鉴定，结果表明临床埃希氏菌属细菌感染非同株菌感染引发，这对临床疾病预防和肠杆菌科细菌快速分类有一定的指导意义。关键词：肠杆菌科细菌；鉴定；同源分析中图分类号：　文章编号：Ｓ８５５．１＋２　文献标识码：Ａ１００５－７３０７（２０２１）０５－０００４－００４　　肠杆菌科细菌广泛存在于人、动物和自然环境中，肠杆菌科细菌的致病性差异很大，大多数种类为条件性致病菌，可附殖于健康动物的体表和消化道，也有部分细菌为致病性菌，如沙门杆菌属、志贺杆菌属［１］ＥＲＩＣＰＣＲ分析，结果发现空气分离菌来自于粪９］便［；Ｓｏｌｔａｎｉ等通过凝胶电泳从９５个样本中识别出６５个不同的禽大肠杆菌菌株，其中有２３２～２６９０ｂｐ条带，并在廉价和简单的分子工具中证实ＥＲＩＣ１０］ＰＣＲ是一种很好的细菌基因分型技术［。在其他。革兰氏阴性杆菌，特别是大肠埃希氏属是引起园内感染最常见细菌之一，常引发泌尿道感染、肠２］炎、脑膜炎、败血症等［。在野生动物上，肠杆菌科细菌的基因分型中，也有研究验证了ＥＲＩＣＰＣＲ的可行性，李鹏等根据副猪嗜血杆菌１５种血清型的特异性ＥＲＩＣ指纹图谱，对中国东南部不同猪场的１１１株副猪嗜血杆菌样品进行鉴定，验证了ＥＲＩＣ１１］ＰＣＲ在其他细菌基因型分型的应用［。细菌极易感染哺乳动物和禽类，特别是幼龄动物，且３］。死亡率较高［基于生化反应和抗原构造的分类方法，可将肠杆菌科细菌分为５个族１２个属，而通过生化反应和ＤＮＡ数据分析，分类更加准确细化，可将其分为２５个属［４］１　材料与方法１．１　材料１．１．１　菌株　从患病野生动物的患处脓液、死亡动物内脏、野生动物生活环境中经分离的细菌，经生化鉴定的肠杆菌科细菌３８株。１．１．２　培养基及试剂　生化鉴定试剂盒、营养肉汤培养基、麦康凯培养基、营养琼脂培养基、细菌ＤＮＡ提取试剂盒、细菌１６ＳｒＤＮＡ扩增试剂盒（大连宝生物工程有限公司）、超纯水、５０×ＴＡＥ缓冲液（北京索莱宝科技有限公司）、ＰｒｅｍｉｘＴａｑ（大连宝生物有限公司）。１．１．３　仪器设备　恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、ＰＣＲ仪（赛默飞世尔科技）、电泳仪（北京六一有限公司）凝胶成像仪（北京科锐创新科技有限公司）、微量移液枪（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）。。１６ＳｒＤＮＡ聚合酶链式反应是目前细菌鉴ＣＢＩ基因数据定中最为准确、高效的手段，通过与Ｎ库中的已知菌株数据作对比，可快速确定细菌种类［５－６］。同种肠杆菌的亚型分类对肠杆菌遗传进化和溯源有重要意义，主要的方法有血清型分型法、基因重复序列聚合酶链式反应（ＥＲＩＣＰＣＲ）、脉冲场凝胶电泳（ＰＦＧＥ）、多位点序列分型（ＭＬＳＴ）、基质辅助激光解吸飞行时间质谱（ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ）等［７］。其中，ＥＲＩＣＰＣＲ技术以其操作简单、试验重［８］复性高和分辨力强等优点而被广泛利用，常用于肠道菌群和细菌的同源性分析。ＨｕｉｙｏｎｇＤｕａｎ等对猪场空气和粪便分离的１２０株大肠埃希菌进行收稿日期：２０２１０７２０２０２１年第５期１．２　方法浙江畜牧兽医计，上游引物为：５′ＡＴＧＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＡＴＴＣＡＣ；下游引物为：５′ＡＡＧＴＡＡＧＴＧＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＧ３′。反应条件为９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性ＣＧ３′４５ｓ，５５℃复性４５ｓ，７２℃延伸３ｍｉｎ，３０个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ。对扩增产物使用１％的琼脂糖凝胶进行电泳。２　结果２．１　肠杆菌科细菌１６ＳｒＤＮＡ鉴定结果　３８株肠杆菌科细菌的１６ＳｒＤＮＡ扩增片段（部分）琼脂糖凝胶电泳图如图１所示。１．２．１　细菌ＤＮＡ的提取　使用Ｔａｋａｒａ公司，细菌ＮＡ。提取试剂盒提取保存细菌的Ｄ１．２．２　１６ＳｒＤＮＡ和ＥＲＩＣＰＣＲ扩增　使用Ｔａｋａｒａ公司的细菌１６ＳｒＤＮＡ的鉴定试剂盒，扩增保存肠ＮＡ的１６ＳｒＤＮＡ序列，对扩增ＰＣＲ产物使用杆菌Ｄ１％的琼脂糖凝胶进行电泳，检验是否扩增成功。将扩增产物送华大基因（北京）测序，并将结果在ＮＣＢＩ数据库中比对。用于ＥＲＩＣＰＣＲ扩增的引物序列参照文献设图１　３８株肠杆菌科细菌的１６ＳｒＤＮＡ扩增片段（部分）琼脂糖凝胶电泳图注：Ｍ：２０００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１－２４：肠杆菌科细菌１６ＳｒＤＮＡ扩增片段　　扩增片段经华大基因公司（杭州）测序后，将测序结果与ＮＣＢＩ数据库已有序列比对，结果发现克雷伯氏菌４株，埃希氏菌２７株，摩氏摩根菌２株，沙门氏菌１株，弗氏柠檬酸杆菌１株，哈夫尼氏菌２株，勒克氏菌１株，如表１所示。使用ＭＥＧＡ６．０软件，对２７株埃希氏菌１６Ｓ结果如图２ｒＤＮＡ序列使用临近法构建系统发生树，所示。表１　肠杆菌科细菌１６ＳｒＤＮＡ鉴定结果菌株种类克雷伯氏菌埃希氏菌摩氏摩根菌沙门氏菌弗氏柠檬酸杆菌哈夫尼氏菌勒克氏菌数量（ｎ＝３８）４２７２１１２１比例／％１４．８７１．１５．３２．６２．６５．３２．６图２　２７株埃希氏菌１６ＳｒＤＮＡ序列系统发生树浙江畜牧兽医２０２１年第５期　　从构建的系统发生树中发现，置信度在９０％可３个亚群，其中Ｅ１和Ｅ２６，Ｅ５、Ｅ６、Ｅ１７和分为２Ｅ１８，进化关系较近。２．２　埃希氏菌ＥＲＩＣＰＣＲ指纹图谱　对ＥＲＩＣＰＣＲ扩增产物，使用１％的琼脂糖凝胶进行电泳，部分结果如图３所示。图３　埃希氏菌ＥＲＩＣＰＣＲ扩增产物（部分）注：Ｍ：２０００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ；Ｅ１－Ｅ２０：埃希氏菌ＥＲＩＣＰＣＲ扩增产物　　通过对电泳条带统计，每株埃希氏杆菌扩增出０－８条条带，共扩增出不同条带１１种，其中Ｅ５、Ｅ１４、Ｅ１６未扩增出条带，使用ＮＴＳＹＳｐｃ２．０软件，对扩增条带进行遗传相似度分析，结果如图４所示。图４　埃希氏菌ＥＲＩＣＰＣＲ指纹图谱遗传相似度分析　　通过对ＥＲＩＣＰＣＲ指纹图谱分析，在相似系数为０．８７时，埃希氏菌属可分为１８个亚群，其中Ｅ１和Ｅ２２，Ｅ６和Ｅ７，Ｅ８和Ｅ２３，Ｅ２６和Ｅ２７，Ｅ１７和Ｅ１８遗传相似度较高。３　讨论１６ＳｒＤＮＡ基因是原核生物核糖体小亚基ｒＤＮＡ（１６ＳｒＤＮＡ）的基因，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”，全长序列包含１０个可变区，可精确指示细菌之间的亲缘关系，所含信息能反应生物界进化关系，易操作，适用于各级分类单元。本研究，通过扩增肠杆菌的１６ＳｒＤＮＡ的全长序列、测序和比对，确定了临床分离细菌７个属３８株肠杆菌科细菌。利用１６ＳｒＤＮＡ序列信息，进一步通过ＭＥＧＡ６０软件构建２７株埃希氏菌属细菌系统发生树，若把置信度定位在９０％时，则可以分为２３个亚群。在确定遗传关系上，ＥＲＩＣＰＣＲ指纹图谱技术比１６ＳｒＤＮＡ基１２］。本文中７７．８％（ｎ＝２１）因分析更具有鉴别性［埃希氏菌属细菌ＥＲＩＣＰＣＲ电泳结果显示出独特条带，表明菌株之间非相同菌株传播。经遗传聚类分析，在相似系数为０．８７时，埃希氏菌属菌可分为１８个亚群，显示其传播情况为非同株菌的爆发式传播。在本研究中，通过１６ＳｒＤＮＡ序列信息构建的系统发生树中，置信度在９０％时，可分为２３个亚群，其中Ｅ１和Ｅ２６，Ｅ５、Ｅ６、Ｅ１７和Ｅ１８，进化关系较ＲＩＣＰＣＲ指纹图谱分析，在相似系近；而在通过对Ｅ数为０．８７时，埃希氏菌属菌可分为１８个亚群，其中Ｅ１和Ｅ２２，Ｅ６和Ｅ７，Ｅ８和Ｅ２３，Ｅ２６和Ｅ２７，Ｅ１７和Ｅ１８遗传相似度较高。从两种分析结果来看有所差２０２１年第５期浙江畜牧兽医异。然而，在ＥＲＩＣＰＣＲ指纹图谱分析时，在相似系．７５时，可分为１２个亚群，排除未出现条带的数为０Ｅ５、Ｅ１４、Ｅ１６，有１个亚群包含１６ＳｒＤＮＡ序列信息构建的系统发生树中置信度大于９０％的所有菌株。本研究中，通过细菌的１６ＳｒＤＮＡ快速鉴定细ＲＩＣＰＣＲ指纹图谱分析快速分析菌种类，并结合Ｅ出埃希氏菌属细菌的遗传关系，在今后肠杆菌科细菌感染的快速鉴定、分类和遗传溯源上有一定的指导意义。然而，在ＥＲＩＣＰＣＲ指纹图谱分析中，Ｅ５、Ｅ１４、Ｅ１６未出现有效条带，需进一步研究，分析原因。参考文献［１］ＬｅｕｎｇＫＴ，ＭａｃｋｅｒｅｔｈＲ，ＴｉｅｎＹ，ｅｔａｌ．ＡｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＡＦＬＰａｎｄＥＲＩＣＰＣＲａｎａｌｙｓｅｓｆｏｒｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｆｒｏｍｃａｔｔｌｅ，ｐｉｇａｎｄｈｕｍａｎｓｏｕｒｃｅｓ［Ｊ］．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＥｃｏｌｏｇｙ，２００４，４７（１）：１１１－１１９．［２］ＭｏｏｓａｖｉａｎＭ，ＥｍａｍＮ．ＴｈｅｆｉｒｓｔｒｅｐｏｒｔｏｆｅｍｅｒｇｉｎｇｍｏｂｉｌｉｚｅｄｃｏｌｉｓｔｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅｓａｎｄＥＲＩＣＰＣＲｔｙｐｉｎｇｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｃｌｉｎｉｃａｌｉｓｏｌａｔｅｓｉｎｓｏｕｔｈｗｅｓｔＩｒａｎ［Ｊ］．２０１９，１２：１００１－１０１０．［３］那春子．野生动物大肠杆菌病的临床表现及防治［Ｊ］．现代畜牧科技，２０１７（１１）：１１６．［４］ＢｒｅｅｄＲＳ．Ｂｅｒｇｅｙ＇ｓＭａｎｕａｌｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ［Ｍ］．１９５７．［５］方光远，茅慧华，蒋加进，等．不同病例动物源大肠杆菌的分离鉴定及１６ＳｒＤＮＡ同源性分析［Ｊ］．中国畜牧兽医，２０１５，４２（１２）：３１２６－３１３２．［６］蒋增海，邓同炜，徐耀辉，等．猪源绿脓杆菌的分离鉴定６ＳｒＲＮＡ基因同源性分析［Ｊ］．河南农业科学，及１２０１７，４６（４）：１１８－１２０．［７］胡辛兰，陈东杰，吴长生，等．４种不同方法用于院内感染肺炎克雷伯菌菌株同源性分析的价值比较［Ｊ］．临床２０１９，３７（１）：４１－４４．检验杂志，［８］朱佳文，吴永胜，许祯莹，等．ＥＲＩＣＰＣＲ技术在动物流行病学调查中的应用［Ｊ］．四川畜牧兽医，２０１８，４５（１）：３３－３５．［９］ＤｕａｎＨ，ＣｈａｉＴ，ＬｉｕＪ，ｅｔａｌ．ＳｏｕｒｃｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｉｒｂｏｒｎｅＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｏｆｓｗｉｎｅｈｏｕｓｅｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇｓｕｓｉｎｇＥＲＩＣＰＣＲａｎｄＲＥＰＰＣＲ［Ｊ］．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９，１０９（５）：５１１－５１７．［１０］ＭｏｌｅｃｕｌａｒｔｙｐｉｎｇｏｆａｖｉａｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｉｓｏｌａｔｅｓｂｙｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｃｏｎｓｅｎｓｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｓｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＥＲＩＣＰＣＲ）［Ｊ］．［１１］曾文斌，刘悦欣，熊亚坤，等．２０１２～２０１４年江西地区副猪嗜血杆菌分离株ＥＲＩＣＰＣＲ指纹图谱分析［Ｊ］．畜牧与兽医，２０１５，４７（６）：３６－４０．［１２］ＡＹｕｎＱ，ＳｕｗａｎｔｏＡ，ＢａｒｕｓＴ．ＧｅｎｅｔｉｃＰｒｏｆｉｌｅｓｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＩｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＩｎｄｏｎｅｓｉａｎＴｅｍｐｅｈＢａｓｅｄｏｎＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌＲｅｐｅｔｉｔｉｖｅＩｎｔｅｒｇｅｎｉｃＣｏｎｓｅｎｓｕｓＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ（ＥＲＩＣＰＣＲ）［Ｊ］．，２０１５，９（２）：５８－６４．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＩｎｄｏｎｅｓｉａ欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍（上接第３２页）倍于平时剂量的维生素Ｄ，持续２～３周后，再恢复步诊断。如钙缺乏的病理变化特征表现为肋骨骨质软易弯曲、骨干内表面出现小米粒大佝偻病串珠，胫骨骺生长板增生且有轻度增宽，干骺端类骨组织和疏松结缔组织轻度增生，成骨细胞和破骨细胞偏多。而磷缺乏症的特征是肋骨和翅部长骨质软易弯曲，胫骨骺生长板肥大有轻度增宽，干骺端肋骨组织轻度增生。若要做出确切诊断，则需对所饲喂的饮水、饲料、脏器组织等进行钙磷含量的测定。４　预防该病的发生主要是由于饲料中钙磷含量不足或缺乏以及钙磷比例不当，也与饲料中维生素Ｄ的含量密切相关。对于该病的预防，如果日粮中缺钙，应补充贝壳粉、石粉，缺磷时应补充磷酸氢钙。钙磷比例不平衡要调整，合理的钙磷比例一般为２∶１，产蛋期一般为５∶１。由于钙磷在机体内的吸收代谢需要维生素Ｄ的协同作用，故饲料中需要足量的维生素Ｄ，如果日粮中已出现维生素Ｄ缺乏现象，应给予３，因此到正常剂量。阳光可促使机体合成维生素Ｄ鹅群要保证一定的舍外运动。在阴雨季节要适当地添加维生素Ｄ制剂或富含维生素Ｄ的青绿饲料。在额外添加钙磷时，还要注意饲料中钙磷的供给，钙磷的比例以及维生素Ｄ的供给，及时发现病鹅，挑出单独饲养，减少损失。在良好的饲养条件下，不仅能满足鹅的生长发育需要，且能有效地预防因钙磷缺乏或比例失调引起的佝偻病。５　治疗对本病的治疗，首先要明确发生原因，是钙缺乏、磷缺乏，还是钙磷比例不当。患病鹅群可添加鱼肝油１０～２０ｍｇ／ｋｇ饲料，同时调整好钙磷比例及用量。病情严重的鹅群可口服鱼肝油胶丸或肌内注射，每羽内服１．５万ＩＵ或维丁胶性钙。或用维生素Ｄ３肌内注射４万ＩＵ。也可用０．５％～１．０％剂量的鱼肝油拌料。若同时服用钙片，则效果更好。需要注意的是，维生素Ｄ不可长时间过量添加，防止中毒。

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