细胞和角质形成细胞同时分离法及其在超细颗粒物毒性效应评价中的应

生态毒理学报

AsianJournalofEcotoxicology

DOI:10.7524/AJE.1673-5897.2

第15卷第6期2020年12月

Vol.15,No.6Dec.2020

程战文,殷诺雅,郑卫,等.皮肤中原代黑色素细胞和角质形成细胞同时分离法及其在超细颗粒物毒性效应评价中的应用[J].生态毒理学报,

2020,15(6):158-166

ChengZW,YinNY,ZhengW,etal.Isolationofprimaryhumanforeskinmelanocytes/keratinocytesforultrafineparticles’toxicityevaluations[J].Asi-

anJournalofEcotoxicology,2020,15(6):158-166(inChine)

皮肤中原代黑色素细胞和角质形成细胞同时分离法及

其在超细颗粒物毒性效应评价中的应用

程战文

1,21,231,2,*

,殷诺雅,郑卫,FrancescoFaiola

1.中国科学院生态环境研究中心,环境化学与生态毒理学国家重点实验室,北京100085

2.中国科学院大学资源与环境学院,北京100049

3.重庆医科大学附属第三医院泌尿外科,重庆401120

收稿日期2019-05-05 录用日期2019-05-18

::

摘要:大气污染及大气中的超细颗粒物,会对人体健康造成一定的危害。皮肤作为人体最大的器官,是保护人体不受外源性

物质损害的第一道防线。为探究超细颗粒物对人体皮肤特别是表皮的潜在风险,从人体皮肤中分离得到了原代黑色素细胞

和角质形成细胞,使用1~10000μg·L商业化超细碳颗粒物模拟大气中的超细颗粒物,探究了其潜在的皮肤毒性。研究结

-

1

果表明,从皮肤中分离的原代黑色素细胞和角质形成细胞能在体外扩增,具有相应的功能。超细碳颗粒物粒径<100nm,处于

纳米尺度,且72h急性暴露不会影响黑色素细胞的细胞活性。qRT-PCR结果显示,超细碳颗粒物暴露会上调黑色素细胞功能

基因、-、-、、、、和的表达,干扰其基因表达。以上研究结果为大气颗粒物的毒

MITFMITFMcKITSILVPAX3SLUGTYRTYRP1

性评价,提供了重要的数据和模型。

关键词:超细碳颗粒物;超细颗粒物;黑色素细胞;角质形成细胞;急性毒性;功能基因;表皮

文章编号:1673-5897(2020)6-158-09 中图分类号:X171.5 文献标识码:A

IsolationofPrimaryHumanForeskinMelanocytes/KeratinocytesforUl-

trafineParticles’ToxicityEvaluations

ChengZhanwen,YinNuoya,ZhengWei,FrancescoFaiola

1,21,231,2,*

1.StateKeyLaboratoryofEnvironmentalChemistryandEcotoxicology,RearchCenterforEco-EnvironmentalSciences,ChineA-

cademyofSciences,Beijing100085,China

2.CollegeofResourcesandEnvironment,UniversityofChineAcademyofSciences,Beijing100049,China

3.DepartmentofUrology&Nephrology,TheThirdAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing401120,China

Received5May2019 accepted18May2019

Abstract:Airpollutionandambientultrafineparticulatematterhavebeenprovedtoaffecthumanhealth.Asthe

largestorganofthehumanbody,theskinisthefirstlineofdefentoprotectthebodyfromexogenoussubstances.

基金项目:国家自然科学基金创新研究群体项目(22021003);中国科学院战略性先导科技专项(B类)(XDB14040300);国家自然科学基金面

上项目(21577166);国家自然科学基金青年科学基金资助项目(21707160)

第一作者:程战文(1993—),男,硕士研究生,研究方向为纳米毒理学,E-mail:****************

*通讯作者(Correspondingauthor),E-mail:***************

第6期程战文等:皮肤中原代黑色素细胞和角质形成细胞同时分离法及其在超细颗粒物毒性效应评价中的应用 159

Toevaluatethepotentialtoxiceffectsofultrafineparticulatematteronhumanskin,especiallyontheepidermis,we

simultaneouslyisolatedprimarykeratinocytesandmelanocytesfromforeskinatfirst.Thocellscouldproliferate

invitro

,andmaintaintheirfunctions.Then,wetreatedtheprimarymelanocyteswith1~10000μg·Lcommer-

-

1

cialultrafinecarbonparticles,lessthan100nmindiameter,whichmimicambientultrafineparticulatematter.The

ultrafinecarbonparticleshadnoeffectsoncellviabilityafter72hexposure.However,qRT-PCRassaysrevealed

thatultrafinecarboncouldpromotetheexpressionofthemelanocytefunctionalgenes,-,-,

MITFMITFMcKIT

SILVPAX3SLUGTYRTYRP1

,,,and.Theresultsprovideimportantmodelsanddatatoasssthetoxicityofat-

mosphericultrafineparticulatematter.

Keywords:ultrafinecarbonparticles;atmosphericultrafineparticulatematter;melanocytes;keratinocytes;acute

toxicity;functionalgene;epidermis

近年来,随着工业技术的逐渐发展,大气污染日

益严重,越来越多的国家和地区开始关注大气污染发,探讨了纳米尺度颗粒物的潜在皮肤暴露风险。

问题。已有流行病学研究表明,大气污染物的暴露

会导致人群中呼吸系统和心血管系统疾病发致皮肤中的角质形成细胞内出现明显的活性氧(re-

[1][23]

-

病率的增加,以及人群中死亡率的上升

[45]

-

,存在一

定的健康风险。除此之外,皮肤作为人体最大的器

官,流行病学研究同样证实大气污染会引起内源性

的皮肤老化及湿疹等皮肤疾

[67][89][10]

--

、过敏性皮炎

病发病率的增加,同时还伴随着黑色素在皮肤中的

累积和老年雀斑比例的上升

[7,11]

,对人体皮肤具有潜

染物危害的第一道防线,且目前关于污染物是如何

影响人体皮肤的病因,也并未阐明。因此,从皮肤

细胞角度出发衡量大气污染物潜在的危害效应,

将有助于大气污染毒性的评估以及污染物排放标

准的制定。

大气中的各种颗粒物成分,组成了大气气溶胶

的悬浮体系。而粒径<100nm的超细颗粒物,虽然

在质量上只占大气总颗粒物的很少一部分,但却是

大气中数量最多的颗粒物以及PM

[12]

。与PM

2.510

相比,超细颗粒物具有更小的粒径,不仅能透过呼吸

系统的各种屏障,还能直接透过肺泡细胞,进入人体

血液循环,在人体内造成严重的炎症反应并伴随氧

是雾霾期间儿童若干疾病如收缩压升高

[15]

、哮喘发

病率上升的元凶。虽然,超细颗粒物对人体存在

[16]

着潜在的健康风险,但目前对超细颗粒物的风险评

估还处于较早的阶段,美国环境保护局(USEPA)以

及欧盟(EU)对超细碳颗粒物的排放还未制定规范标

准。因此,从超细颗粒物角度解释大气污染潜在毒少。鉴于以上原因,使用原代细胞分离的方法,从人

性效应特别是皮肤毒性效应,将有助于大气污染风

险的评估。用商业化的超细碳颗粒物模拟了大气中的超细颗粒

化应激的产生

[1314]

-

。事实上,超细颗粒物已被证实

在的毒性效应。考虑到皮肤是保护人体免受外界污

目前,已有许多实验数据,从纳米毒理学角度出

作为常见的碳纳米材料的代表,单壁碳纳米管能导

activeoxygenspecies,ROS)蓄积

[17]

,诱导细胞内胁迫

相关基因的过量表达。除此之外,纳米颗粒物的暴

露,还会导致细胞内炎症因子的高表达。例如24h

内20、50和80nm纳米银暴露会导致角质形成细胞

分泌的IL-1β、IL-6、IL-8以及TNF-α的浓度显著升

高,并伴随着纳米银作用位点出现明显的局灶性炎

症现象使用硫辛酸、聚

[18][19]

。Li和Monteiro-Riviere

乙二醇以及聚乙烯亚胺修饰过的纳米金颗粒,研究

了人表皮角质形成细胞对不同粒径纳米金颗粒的摄

取和内吞效应,研究发现不同材料修饰的纳米金颗

粒均会促进促炎症因子IL-1α、IL-1β和趋化因子

IL-8的表达和分泌。相同的炎症效应,同时也出现

于纳米碳管以及纳米二氧化钛暴露

[20][21][22]

、纳米锌

后的角质形成细胞中。

值得注意的是,以上研究大多基于人体角质形

成细胞。虽然,角质形成细胞占表皮细胞的90%,

但对于表皮中具有黑色素分泌功能,同时能调节皮

肤颜色并保护皮肤免受紫外线干扰的黑色素细胞而

言,研究还较少。只有少量研究表明,大气污染中的

某些持久性有机污染物如二噁英会通过AhR受体

介导的形式,上调黑色素细胞内与黑色素产生相关

的、以及基因的表达,促进黑色

TYRTYRP1TYRP2

素产生

[2324]

-

。此外,目前的研究多是从氧化应激和

炎症反应2个方面揭示纳米颗粒物的毒性,从细胞

功能角度阐明纳米尺度颗粒物毒性效应的研究还较

体皮肤中同时分离了角质形成细胞和黑色素细胞,

160生态毒理学报第15卷

物,探究了大气颗粒物的潜在皮肤毒性。考虑到目止消化,并使用40μm细胞过滤器(Corning,431750)

前已有若干基于原代角质形成细胞的研究,此处重去除未消化的残渣,最后在200g离心5min。离心

点探讨了超细碳颗粒物对黑色素功能基因表达的影完成之后,使用D-KSFM培养基重新悬浮,并按照1

响。以上研究将有助于大气颗粒物风险评价,解释浓度将细胞接种于胶原蛋白(Gibco,

超细颗粒物的皮肤致毒机制。

1 材料与方法(Materialsandmethods)

1.1 实验材料

实验室中分离的黑色素细胞和角质形成细胞来

×

10

8

cells·L

-

1

R011K)修饰过的培养皿中,用于角质形成细胞的培

养。使用含有HMGS-2(Gibco,S0165)的m254培养

基(Gibco,M254500)(黑色素细胞培养基)重悬细胞

并将其接种于纤连蛋白(Corning,354008)修饰过的

培养皿中,用于黑色素细胞的培养。分离的原代细

胞在一周后能逐渐长满整个培养皿,在2~3次传代

1.3 超细碳颗粒物表征

后能逐渐被分离纯化(图1)。

将纳米碳颗粒粉末均匀分布在样品台的导电胶

源于医院健康男性包皮环切术(已告知样品用途并

获得口头许可)。手术结束后的皮肤样品迅速保存

至含有5mg·L庆大霉素(Gibco,R01510)的D-KS-

FM培养基(Gibco,10744019)中,并置于冰中转移至

实验室进行细胞分离。

实验使用的超细碳颗粒物为商业化的碳颗粒物

(Sigma,633100),使用二甲基亚砜(DMSO)(Amresco,

0231)为分散剂并置于37℃恒温水浴锅(Elma,

P60H)中超声30min,获得浓度为10g·L

的超细碳

颗粒物母液,再次梯度稀释为1mg·L

1.2 原代细胞的分离

储备液。

--

11

-

1

-

1

上,使用洗耳球从不同角度吹拂样品台上的纳米碳

颗粒样品,使粉末牢固、均匀地粘在导电胶上。使用

场发射高分辨率扫描电镜(field-emissionscanninge-

lectronmicroscopy,FE-SEM)(Hitachi,SU-8020)拍摄

超细碳颗粒物照片,并使用其元素分析模块(energy

dispersiveX-rayspectroscopy,EDS)分析其元素组成

和含量。

将1g·L碳颗粒物储备液用DMEM/F12(Gib-

-

1

~10g·L

使用含有20mg·L庆大霉素的杜氏磷酸缓冲

-

1

3

液(DPBS)(Gibco,14190250)清洗包皮样品5次,每

次5min,并将包皮样品剪成2cm左右的片状,充

分清洗去除其中的血渍。将清洗过后的包皮样品转

移至含有25000units·L蛋白酶(Gibco,17105041)

-

1

和5mg·L庆大霉素的DPBS溶液中,4℃条件下

-

1

消化24h。消化完成后,使用镊子将表皮从样品中

剥离出来,并使用0.05%Trypsin-EDTA(Gibco,

12605010)在37℃条件下消化15min,消化过程中使

用巴氏吸管吹打样品使表皮更加充分的消化。消化接种于纤连蛋白修饰后的96孔板中。将1

完成后,使用10倍体积的DPBS溶液稀释消化液终超细碳颗粒储备液用黑色素细胞

co,11320082)稀释至1mg·L

-

1

,用以模拟其在培养

基中的条件,并将其滴加至碳膜覆盖的铜网(Elec-

tronMicroscopyChina,BZ11032a)上,使用红外灯烘

干1h,使铜网完全干燥后,即可置于透射电子显微

镜(transmissionelectronmicroscopy,TEM)(Hitachi,

1.4 细胞活性检测

H7500)中在80kV下拍摄TEM照片。

将传代3代之后原代黑色素细胞使用TrypLE

消化液(Gibco,12604013)消化并重悬浮,并按110

×

8

cell·L

-

1

mg·L

--

11

~10g·L

图1 表皮分离过程

Fig.1 Theprocedureofepidermisisolation

第6期程战文等:皮肤中原代黑色素细胞和角质形成细胞同时分离法及其在超细颗粒物毒性效应评价中的应用 161

培养基稀释1000倍(DMSO浓度为0.1%),使超细

10000μg·L

-

1

,阴性对照为0.1%DMSO处理组,每1.6 免疫荧光染色

孔100μL,共持续暴露72h。暴露过程中每天更换将样品使用DPBS清洗3次,加入4%福尔马

培养基。暴露结束使用AlamarBlue(Thermo,林试剂在室温条件下固定20min后再次使用DPBS

DAL1025)试剂,在酶标仪(Thermo,VarioskanLUX)

上检测(激发波长530nm,发射波长590nm)细胞存和5%山羊血清(Solarbio,SL038)的DPBS试剂作为

treatedgroupbackground

-

A

590590

A

×

100%

细胞存活率(Cellviability)=

control

A

590

1.5 超细碳颗粒物对黑色素基因表达分析

将黑色素细胞按照相同浓度接种于纤连蛋白修

饰后的培养皿中并暴露于含有1~10000μg·L超

-

1

细碳颗粒的黑色素细胞培养基中。待细胞长满整个

培养皿时,加入1mLTrizol试剂(Invitrogen,

15596018)按照其说明提取样品中的RNA,并使用

NanoDrop紫外可见分光光度计(Thermo,NanoDrop

2000)测量RNA溶液浓度和260、280及230nm的

吸光值,进行RNA定量。使用FastKingRTKit试

剂(TIANGEN,KR116)将RNA逆转录成cDNA,加

入SYBRGreen试剂(Takara,RR420L)后按照以下步

骤测量基因表达水平:预变性(95℃,30s),PCR(95

碳颗粒物暴露浓度分别为1、10、100、1000和

活率。细胞存活率计算方法如下:封闭液室温条件下孵育1h。加入一抗4℃过夜孵

DH

作为内参基因,引物以及其序列如表1所示。

清洗。加入含有0.1%TritonX-100(Amresco,0694)

育,使用DPBS清洗后加入二抗4℃孵育2h即可。

本部分抗体使用信息如表2所示。

2 结果(Results)

2.1 原代黑色素细胞和角质形成细胞分离

℃,3s;60℃,30s;40个循环)。基因表达以-

GAP

原代细胞分离过程如图1所示,由于表皮中大

多数细胞为角质形成细胞,黑色素细胞只占很少一

部分,因此,在细胞分离过程中使用黑色素细胞培养

基(在m254培养基中添加HMGS-2)以及以纤连蛋

白为基质,对黑色素细胞进行分离和筛选。结果表

明,经过2~3次传代后,黑色素细胞能逐渐被纯化

并表现出较高的纯度。在体外分离出来的黑色素细

胞胞质透明可见,细胞核较小,每个细胞具有多个树

突状结构。同时,分离出的黑色素细胞能在离体条

表1 qRT-PCR引物及其序列

Table1 qRT-PCRprimerquences

基因正向引物(5’~3’)反向引物(5’~3’)

GeneForwardprimer(5’~3’)Reverprimer(5’~3’)

TTGAGGTCAATGAAGGGGTCGAAGGTGAAGGTCGGAGTCA

CATACAGCCCCATCACTGTGCTTGGAGGAGGTGTCAGATG

AGCCGCATCCTGAGAAGTAACTTCATCTGATTGGGGTGCT

GTTCTGCTCCTACTGCTTCGCTAACAGCCTAATCTCGTCGCC-

CAGCCCAGCATCATTCTTCTCGGATTACGCCGTAAAGGTCCCTC

CCTGCGTCTGGAGAAAGACGGATCCCATCAAGTCATCCGTG

CATTCCTCACAAAAGGGAGCGTGACCCTTTCTCCTGTAAG

TGCCCAGGCATGAACACACTGGGAAAAATACACGCTGTGAG

ACCTTCTCTTTGCCAGTCCATCTGGACATGCAAGCTCAGGACT-

GAPDH

SLUG

PAX3

cKIT

TYR

TYRP1

SILV

MITF

MITFM

表2 抗体稀释倍数及使用情况

Table2 Antibodydilutionandusageinformation

名称稀释倍数厂商用途货号

NameDilutionCompanyUsageCat.No

Cytokeratin-14(EPR17350)1∶1000Abcam一抗Primaryantibodyab181595

AlexaFluor488Conjugate

®

1∶1000CellSignalingTechnology二抗Secondaryantibody4412S

162生态毒理学报第15卷

件下进行传代和扩增,并维持均一的细胞形态(图要组成元素为碳,样品具有较高的纯度。

2)。通过将黑色素细胞消化收集并离心,能在试管

底部发现明显的黑色素沉淀,这说明分离的原代黑分散于DMSO的超细碳颗粒物悬液用

色素细胞在体外具有合成黑色素的能力(图2),验证

细胞分离实验的成功。颗粒物能在培养基中被分散成单个球形的颗粒物,

除了黑色素细胞,还获得了皮肤中的角质形成且能在DMEM/F12中均匀分散,此浓度下未见明显

细胞,并在几次传代后实现了细胞分离纯化(图2)。的碳颗粒聚集体。TEM表征结果显示,单个碳颗粒

显微镜下角质形成细胞呈不规则鳞片形,细胞边缘在DMEM/F12中粒径<100nm,为纳米尺度颗粒物,

较为明亮,且相互之间紧密相连。通过荧光免疫染这与SEM结果相符。

色,发现所有的细胞都能表达角质形成细胞特异的

骨架蛋白KRT14。以上结果说明,我们的原代细胞考虑到目前已有许多基于角质形成细胞的实验

分离方法不仅能分离黑色素细胞,也能用于提取皮数据,此处重点关注了黑色素细胞的毒性效应。为

肤中的角质形成细胞,实现了同时分离皮肤中两大了探究超细碳颗粒物暴露对黑色素细胞急性毒性的

2.2 超细碳颗粒物表征

类细胞。影响,使用AlamarBlue测量72h碳颗粒暴露之后黑

1g·L

-

1

DMEM/F12稀释至1mg·L

-

1

,超声分散后,超细碳

2.3 超细碳颗粒物暴露对黑色素细胞的急性毒性

超细碳颗粒的TEM表征结果如图3(c)所示,将

色素细胞的细胞活性。由于氧化型AlamarBlue能

被活细胞摄取进入细胞并被活细胞中的线粒体酶还如图3(a)所示,超细碳颗粒粉末呈聚集的团状,

原成具有荧光效应的还原态,故可通过其特定波段聚集体之间存在较大范围的间隙,同时颗粒与颗粒

的荧光值来测定细胞活性。如图4所示,相比于之间存在明显的团聚。因此,下述准备超细碳颗粒

DMSO对照组,72h超细碳颗粒暴露并不会对黑色

素细胞造成明显的急性细胞毒性。这说明,超细碳

颗粒物在1~10000μg·L浓度范围内,不具有显元素分析结果显示,除去光谱中存在的元素氧信号

-

1

著的细胞毒性效应。外,粉末主要成分都为元素碳,这说明粉末状样品主

悬浮液时,均使用超声水浴使碳颗粒尽量分散。

SEM结果显示,粉末状碳颗粒粒径约50nm。EDS

图2 从皮肤中分离出来的黑色素细胞及角质形成细胞

注:(a)不同时间点的黑色素细胞(400μm);(b)离心后的黑色素沉淀;(c)分离出的角质形成细胞(1000μm);

(d)原代角质形成细胞KRT14染色(400μm);DAPI表示4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色的细胞核,KRT14表示KRT14蛋白。

Fig.2 Melanocytesandkeratinocytesisolatedfromhumanskin

Note:(a)primarymelanocytesondifferentdays(scalebars,400μm);(b)melaninprecipitationaftercentrifugation;

(c)primarykeratinocytes(scalebar,1000μm);(d)immunofluorescencestainingpictureofKRT14inkeratinocytes(scalebar,400μm);

DAPIreprentsnucleistainedwith4’,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI);KRT14reprentsKRT14protein.

第6期程战文等:皮肤中原代黑色素细胞和角质形成细胞同时分离法及其在超细颗粒物毒性效应评价中的应用 163

图3 超细碳颗粒物的扫描电镜(SEM)、X射线能谱分析(EDS)和透射电镜(TEM)表征

注:(a)SEM表征超细碳颗粒粉末形态;(b)超细碳颗粒粉末的EDS元素分析;(c)TEM表征超细碳颗粒形态(1μm)。

Fig.3 Characterizationofultrafinecarbonparticlesbyscanningelectronmicroscopy(SEM),energy

dispersiveX-rayspectroscopy(EDS)andtransmissionelectronmicroscopy(TEM)

Note:(a)morphologyofultrafinecarbonpowderunderSEM;(b)EDSresultsforultrafinecarbonparticles;

(c)ultrafinecarbonparticlesunderTEM(scalebar,1μm).

3 讨论(Discussion)

本文使用一种商业化的超细碳颗粒物模拟了大

气中的超细颗粒物,研究了其潜在的皮肤毒性。在

日常生活中,该超细碳颗粒物也常被用作轮胎和其

他橡胶制品中的增强剂,以及各种油漆、油墨等染色

材料

[25]

。根据国际癌症研究机构(IARC)发布的研究

报告,超细碳颗粒物被列为2B类致癌物,对人体可

能具有潜在的致癌风险

[26]

。虽然,目前关于超细碳

颗粒物的研究还不是很多,但已有流行病学研究表

图4 超细碳颗粒物72h暴露对黑色素细胞急性毒性的影响

注:DMSO表示0.1%二甲基亚砜溶剂对照组。

明,超细碳颗粒物暴露会影响人体健康。例如,通过

调查报纸印刷行业工作人员的健康状况,发现此类

同时总就业时间越长肾癌发病风险也越高

[28]

,并且

橡胶行业从业人员有更高的心血管疾病、呼吸系统

人群中肺癌风险与在打印板房工作时间正相关

[27]

,

疾病以及高血压发病率

[29]

。与其他纳米材料相同,

超细碳颗粒物暴露同样也会导致细胞内出现ROS,

同时高表达某些炎症相关因子,最终导致机体呼吸

系统、心血管系统以及免疫系统受损

[25]

。本研究发

现,超细碳颗粒物的暴露会对促进人体黑色素细胞

相关功能基因的表达,这说明超细碳颗粒物以及大

气细颗粒物可能具有潜在的皮肤毒性。

障,能保护人体不受外界的危害

[30]

。角质形成细胞

黑色素细胞虽然只占表皮细胞的6%,但是能分泌

黑色素,保护人体免受紫外线的影响。因此,以角质

形成细胞和黑色素细胞为基础的皮肤模型,能在一

定程度上反映外界污染物对皮肤的毒性效应。本课动,特别是当超细碳颗粒物浓度>1000g·L时。

表皮作为皮肤的最外层,构成了人体的外部屏

Fig.4 72hacutetoxicityofultrafinecarbon

particlesonmelanocytes

Note:DMSOreprents0.1%dimethylsulfoxidesolventcontrol.

2.4 超细碳颗粒物暴露对黑色素细胞功能基因表

达的影响

为了进一步探究超细碳颗粒物对黑色素细胞功

能基因表达的影响,使用qRT-PCR测量了若干黑色

素细胞功能基因的表达。如图5所示,对于黑色素

细胞的标志基因、-以及-,当超细

MITFMITFMcKIT

碳颗粒物浓度>1000g·L时,基因表达水平会显

-

1

著上升。同时,其上游调控基因和的

PAX3SLUG

表达,也能被超细碳颗粒物所促进。对于黑色素形

成过程中的关键酶TYRP1和TYR以及黑色素小体

特异型跨膜糖蛋白SILV而言,超细碳颗粒物暴露

也会使其基因表达出现相同的趋势。以上结果说

明,超细碳颗粒物暴露会显著促进黑色素细胞的活

-

1

是构成表皮的主要细胞,占表皮细胞的90%以上;

164生态毒理学报第15卷

图5 超细碳颗粒物暴露对黑色素细胞基因表达的影响

注:(a)黑色素细胞标志基因、-和-表达水平;(b)黑色素细胞标志基因上游调控基因和表达水平;

MITFMITFMcKITPAX3SLUG

(c)与黑色素产生有关基因、和表达水平。

TYRTYRP1SILV

Fig.5 Theeffectofcarbonexposureonmelanocytegeneexpression

Note:(a)theexpressionofmelanocytemarkergenes,-and-;(b)theupstreamgeneexpressionof

MITFMITFMcKIT

melanocytemarkersand;(c)thegeneexpressionrelatedtomelaninproduction,and.

PAX3SLUGTYRTYRP1SILV

题组前期实验已经证实,超细碳颗粒物的暴露会导相关蛋白1()的转录,从而影响着黑色素的生

致角质形成细胞发育异常,并伴随着发育分化过程成

中炎症反应的出现。同时,考虑目前已有若干基于

原代角质形成细胞的毒性数据,所以此实验中重点

关注了超细颗粒物对黑色素细胞的影响。但是,基

于人体皮肤同时分离原代角质形成细胞和黑色素细

胞的实验方法,在未来能为污染物皮肤毒性评价,提

供新的思路。

本研究发现超细碳颗粒物的暴露会促进黑色素

功能基因、-、、、、

MITFMITFMTYRTYRP1SILV

TYRP1

[3334]

-

,而与黑色素细胞中黑色素小体上的跨

SILV

膜蛋白形成有关

[35]

。此外,的表达会受到其

MITF

上游调控基因和的影响,如

PAX3SLUGPAX3

[36][37]

和通过协同作用以反式作用元件的方式激

SOX10

活启动子,进一步促进的表达

MITFMITF

[36]

。在

此实验中,我们证实超细碳颗粒物暴露会通过高表

达以为核心的功能性基因网络,促进黑色素

MITF

细胞的功能。目前已有研究表明,PM浓度的上升

2.5

以及碳黑颗粒物的暴露会导致皮肤中黑色素的过量

产生以及累积,并伴随着人群中皮肤色素沉积增多

和患老年雀斑比例的增加甚至是黑色素瘤的

[67,11]

-

出现

[38]

,这与我们通过原代黑色素细胞暴露所获得

的结果是相吻合的。因此,我们的研究结果及模型

对于评价大气污染的潜在皮肤毒性,特别是颗粒物

对皮肤色素产生的影响,具有十分重要的借鉴意义。控制黑色素形成过程中酪氨酸酶()和酪氨酸酶

SLUGPAX3cKITMITF

、以及-的高表达。和

MITFM

-作为黑色素细胞最重要的转录因子,调节

着黑色素细胞的发育和黑色素生成酶基因的表

达

[3132]

-

。作为、和的上游调控基

TYRTYRP1SILV

TYR

因,能通过与DNA上的特异性启动子结合,

MITF

第6期程战文等:皮肤中原代黑色素细胞和角质形成细胞同时分离法及其在超细颗粒物毒性效应评价中的应用 165

通讯作者简介:FrancescoFaiola(1970—),男,博士,研究员,

主要研究方向为干细胞毒理学。

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