（整理）b型流感嗜血杆菌结合疫苗
b型流感嗜血杆菌结合疫苗
b Xing Liuganshixueganjun Jiehe Yimiao
Haemophilus Influenzae Type b Conjugate Vaccine
本品系用纯化的b型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜多糖（Capsular polysaccharide，CPS）抗原，通过己二酰肼（ADH）与破伤风类毒素（Tetanus toxoid，TT）蛋白共价结合制成。用于预防b型流感嗜血杆菌引起儿童的感染性疾病，如脑膜炎、肺炎等。
1 基本要求
生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2 制造
2.1 菌种
生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。
2.1.1 菌种名称及来源
采用b型流感嗜血杆菌CMCC58547或CMCC58534菌株，来源于中国药品生物制品检定所。
2.1.2 种子批的建立
应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。
2.1.3 种子批的传代
主种子批启开后传代次数不超过5代，工作种子批启开后至接种发酵罐培养传代次数不得超过5代。
2.1.4 种子批菌种的检定
检定菌种可用含羊血的巧克力培养基或Hib综合培养基。
2.1.4.1培养特性
b型流感嗜血杆菌菌种在普通营养琼脂培养基上不生长，在含羊血的巧克力培养基或在Hib综合琼脂培养基上生长，生长需要X因子（氯化血红素）、V因子（β辅酶A）；卫星试验阳性，菌落形状灰白色、半透明、光滑凸起，湿润，边缘规则。
2.1.4.2染色镜检
应为革兰氏阴性短小杆菌、有荚膜，有时连成线状，亦可有单个阴性球菌。
2.1.4.3 生化反应
发酵葡萄糖、木糖、半乳糖，产酸不产气。不发酵蔗糖、乳糖和果糖。赖氨酸脱羧酶反应呈阴性。
2.1.4.4血清学试验
将在35～37℃培养的菌苔，与Hib免疫血清进行玻片凝集试验，应有强凝集反应。
2.1.5 种子批的保存
种子批应冻干后保存于8℃以下。
2.2 原液
2.2.1 生产用种子
启开工作种子批菌种，接种在液体或固体Hib综合培养基上，制备数量适宜的生产用种子。
2.2.2生产用培养基
采用Hib综合培养基。不得含有对人体有害或其他过敏原物质。
2.2.3培养
采用培养罐液体培养，在培养过程中取样进行纯菌试验、涂片革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。
2.2.4收获及杀菌
于对数生长的后期或静止期的前期终止培养，取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，然后于
培养物中加入适宜浓度的甲醛溶液或脱氧胆酸钠溶液杀菌，以确保杀菌完全及不损伤Hib 荚膜多糖为宜。
2.2.5 多糖提取和纯化
2.2.5.1将已杀菌的培养物，离心去菌体后收集上清液，采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）沉淀收集复合多糖，乙醇沉淀收集粗制多糖，或超滤浓缩后乙醇沉淀，取上清，然后加入适宜浓度的乙醇溶液沉淀多糖，并依次用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀物，干燥后即为粗制多糖，-20℃或以下保存。
将粗制多糖溶解于1/10饱和醋酸钠溶液中，然后按适当比例用冷酚溶液重复抽提数次。收集上清液，并透析或超滤脱酚，再加乙醇至最终浓度为60%-80%，离心后收集沉淀物，或超滤浓缩后乙醇沉淀，取上清，然后加入60%-80%的乙醇溶液沉淀多糖，依次用无水乙醇、丙酮于离心洗涤，真空干燥，所得固体即为精制多糖。
2.2.5.2 多糖检定
按3.1项进行。
2.2.5.3 保存及有效期
保存于 -20℃或以下，保存时间按批准的执行。
2.2.6多糖衍生
2.2.6.1将精制多糖溶解后，按适宜比例加入溴化氰进行活化，然后向反应液中加入适宜浓度的己二酰肼溶液，反应过夜。再将反应液超滤或透析。可冻干收集固体衍生物。
2.2.6.2 多糖衍生物检定
按3.2项检定。
2.2.6.3 保存及有效期
保存于－20℃或以下，保存时间不超过30天。
2.2.7 载体蛋白
载体蛋白为破伤风类毒素。破伤风类毒素原液制造和检定应符合“吸附破伤风疫苗”
2.1-2.2项规定。
可采用柱色谱或其他经批准的方法对破伤风类毒素原液进一步纯化，并配制至适宜浓度。
2.2.8 多糖蛋白结合物的制备
2.2.8.1结合
多糖衍生物与破伤风类毒素蛋白等量混合，加入碳二亚胺(EDAC)进行反应。然后透析或超滤透析。
2.2.8.2结合物纯化
结合物用柱色谱纯化,收集Vo附近的洗脱液，合并各次层析收获的洗脱液即为纯化的结合物，除菌过滤后,即为结合物原液。
2.2.9 原液检定
按3.3项检定。
2.2.10 保存及有效期
保存于2～8℃，保存时间不超过6个月。
2.3 半成品
2.3.1 配制
用氯化钠注射液稀释多糖结合物原液，每1毫升疫苗溶液含Hib荚膜多糖应不低于20μg。
2.3.2 半成品检定
按3.4项进行。
2.4 成品
2.4.1 分批
应符合“生物制品分批规程”规定。
2.4.2 分装
应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。
2.4.3 规格
每瓶0.5ml，每1次人用剂量0.5ml，含纯化b型流感嗜血杆菌荚膜多糖10μg。
2.4.4 包装
应符合“生物制品包装规程”规定。
3 检定
3.1 多糖检定
3.1.1 鉴别试验
采用免疫双扩散法（附录VIII Ｃ），应与b型流感嗜血杆菌免疫血清形成明显沉淀线。
3.1.2 化学检定
3.1.2.1 固体总量
依法测定（附录VII M）。
3.1.2.2 核糖含量
以D-核糖为对照，应为320-410mg/g（附录XXXX）。
3.1.2.3 磷含量
应为68-90mg/g （附录VII A ）。
3.1.2.4 蛋白质含量
应小于10mg/g（附录VI B 第二法）。
3.1.2.5 核酸含量
应小于10 mg/g，核酸在波长260nm处的吸收系数(E1%1cm)为200 （附录II A）。
3.1.2.6 多糖分子大小测定
采用Sepharo CL-4B凝胶柱（1.6×100cm）测定， K D≤0.5的多糖回收率应不低于50%。（附录XXX）。
3.1.3 细菌内毒素检查
应不高于25EU/μg（附录XII E）。
3.2 多糖衍生物检定
3.2.1 己二酰肼含量
应为16–45μg/mg（附录XXXX）。
3.2.2 残余氰化物含量
应不高于10ng/mg（附录XXXX）。
3.3 结合物原液检定
3.3.1 鉴别试验
采用免疫双扩散法（附录VIII Ｃ），应与b型流感嗜血杆菌免疫血清及破伤风类毒素免疫血清形成明显沉淀线。
3.3.2 化学检定
3.3.2.1多糖含量
以D-核糖为对照，按核糖含量计算结合物中多糖含量，应不低于28μg/ml（附录XXXX）。
3.3.2.2 蛋白质含量
应不低于48μg/ml（附录VI B 第二法）。
3.3.2.3 多糖与蛋白质的比值
按3.3.2.1和3.3.2.2测定结果计算，应为0.30-0.59。
3.3.2.4 高分子结合物含量
高分子结合物应为80%-100%或游离多糖≤20%（附录XXXX）。
3.3.2.5 分子大小测定
采用Sepharo CL-4B凝胶柱（1.6×100cm）测定，K D值应不高于0.20， K D值小于0.20的洗脱液回收率应不低于60%。（附录VIII G）
3.3.2.6 EDAC残留量
采用N.wilchek方法测定，EDAC残留量应低于10μmol/L（附录XXXX）。
3.3.3 无菌检查
依法检查（附录XII A），应符合规定。
3.3.4 细菌内毒素检查
应不高于5EU/μg（附录XII E）。
3.4 半成品检定
无菌试验
依法检查（附录XII A），应符合规定。
3.5 成品检定
3.5.1 鉴别试验
采用免疫双扩散法（附录VIII Ｃ），应与b型流感嗜血杆菌免疫血清及破伤风类毒素免疫血清形成明显沉淀线。
3.5.2 物理检查
3.5.2.1 外观检查
应为无色透明液体，无异物。
3.5.2.2 装量
按附录ＩＡ中装量项进行检查，应不低于标示量。
3.5.3 化学检定
3.5.3.1 pH值
应为5.0～7.0（附录V A）。
