实验四血清总胆固醇的测定（硫磷铁法）
[目的要求]
掌握血清总胆固醇测定原理、方法及其临床意义。
[临床意义]
胆固醇是环戊烷多氢菲的衍生物，主要来自体内合成，一部分直接从食物中摄取。胆固醇在体内不仅参与血浆脂蛋白的合成，而且可转变为胆汁酸盐、维生素D
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及某些类固醇激素(性激素、肾上皮质激素等)。
血液中的胆固醇包括游离胆固醇及其酯两种，二者总称“总胆固醇”，其中胆固醇酯占70～75%。
糖尿病昏迷患者几乎都有血清胆固醇浓度的增加。胆固醇增加还见于动脉粥样硬化、肾病综合症，总胆管阻塞及粘液性水肿。粘液性水肿胆固醇增加的主要原因是甲状腺机能减退而垂体前叶有继发性活动过度所致。其它如肥大性骨关节炎、老年性白内障、牛皮癣等，血清胆固醇浓度间或也有增加。
在恶性贫血、溶血性贫血以及甲状腺机能亢进时，血清胆固醇含量降低。其它如严重肝病、感染、营养不良等情况，胆固醇总量常见降低。近年来大量文献报导表明，血胆固醇含量过高与动脉粥样硬化的发病机制有关，更引起了人们的注意。
[实验原理]
用无水乙醇提取血清中胆固醇同时沉淀蛋白质，向提取液中加入硫磷铁显色剂，胆固醇与浓硫酸及三价铁作用，生成比较稳定的紫红色化合物，与同样处理的标准液进行比色，求得其含量。
[标本]
人或动物血清。
[器材]
1．试管及试管架；
2．刻度吸量管或移液器；
3．离心机；
4．721型分光光度计。
[试剂]
1．胆固醇标准贮存液(1.0ml≈1.Omg)：精确称取干燥重结晶胆固醇lOOmg，溶于无水乙醇内(稍加温助溶)，然后移入lOOml容量瓶中，加无水乙醇至刻度，贮于棕色瓶中，密塞瓶口置4℃冰箱内保存。配制应用液时，应将其预先恢复至室温。
2．胆固醇标准应用液(1ml≈0.05mg)：取上述贮存液5ml于100ml容量瓶中，加无水乙醇至刻度，再加蒸馏水2ml，贮于棕色瓶内，置冰箱中保存，用时将其恢复至室温。
3．铁贮存液：称取三氯化铁(Fecl
3•6H
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O)2.5克溶于87％浓磷酸内，并加至100ml，
贮于棕色瓶中．此液在室温可长期保存。
4．显色剂：取铁贮存液8ml，加浓硫酸至100ml，此液在室温可保存6～8周。
5．浓硫酸(AR)。
6. 无水乙醇(AR)。
[操作步骤]
1.无蛋白提取液的制备
准确吸取血清0.10ml，置入干燥的小试管中，对准血清吹入无水乙醇2.9ml，使蛋白质分散成细小的沉淀，用力振荡约10s，放置5min，再次摇匀沉淀，置2000r／min离心约10min。
2．显色取干燥试管三支，分别标记，按下表操作：
3. 测定
显色剂加毕，立即振摇15～20次，置室温下冷却15min，然后用550nm波长以空白调零点，测出各管吸光度。
[计算]
血清总胆固醇(mg／d1)× 0.02586(或除以38.67)＝ mmol／L
[正常值]
2.9～6.Ommol／L(110～230mg／d1)。
[注意事项]
(1)离心后上清液必须清亮透明，不能混有细微沉淀颗粒，否则要重新离心。
(2)颜色反应与加显色剂后混合时的产热程度有关，因此操作中应注意：①加入显色剂必须与乙醇分成
两层，可后混合，不能边加边摇，否则显色不完全；②显色剂要加—管混和一管，混合的手法也要一致；③混合时试管发热，注意勿使管内液体溅出，以免损伤衣服、皮肤、眼睛。
[思考题]
1. 本实验操作中特别需要注意些什么？为什么？
2. 酯类难溶于水，将它们均匀分散在水中则形成乳浊液，为什么正常人血浆和血清中含有酯类虽多，但却清澈透明？
