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博士学位论文
微纳米结构羟基磷灰石对骨髓间充质干细胞成骨分化
的调控研究
作者姓名：赵灿灿 __________________
指导教师: 常江研究员博士__________
中国科学院上海硅酸盐研究所_______
学位类别: 工学博士_________________ 学科专业: 材料学__________________ 培养单位: 中国科学院上海硅酸盐研究所_______
2018年6 月
Regulation of osteogenic differentiation of bone marrow menchymal stem cells by Hydroxyapatite Bioceramics with Micropattern and Nanostructure
A disrtation submitted to
University of Chine Academy of Sciences
in partial fulfillment of the requirement
for the degree of
Doctor of Engineering
in Materialogy
By
Zhao Cancan
Supervisor: Professor Chang Jiang
Shanghai Institute of Ceramics, Chine Academy of Sciences
June 2018
中国科学院大学
研究生学位论文原创性声明
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作者签名：
日期：
中国科学院大学
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本学位论文属于：
□保密，在年解密后适用本授权书。
不保密。
作者签名：导师签名：
日期：日期：
摘要
摘要
骨是人体中最坚硬的组织，这种优异的力学性能与它本身的微纳米多级有序结构密不可分。人工合成
的羟基磷灰石（Ca10(PO4)6(OH)2，HA）因与骨的无机成分相似、具有良好的生物相容性和骨引导性，被广泛应用在骨组织工程中，但是传统烧结制备的HA缺少骨诱导性能。前期初步的研究显示，羟基磷灰石陶瓷表面微米结构和纳米结构都能够影响成骨细胞的粘附、增殖、分化，植入体内能够促进成骨。但是关于微米和纳米结构在促进成骨中如何起作用，特别是羟基磷灰石生物陶瓷的微米和纳米结构的促成骨效应是否有区别还不清楚。而微米、纳米两种结构组合是否会产生出更加优异的促成骨性能，是设计优化生物活性骨修复材料的关键。然而由于陶瓷本身的脆性，直接在羟基磷灰石陶瓷表面构造图案化结构具有很大的挑战。值得注意的是，作为临床应用的骨修复材料，在植入体内后会伴随着相应的降解，那么结构在因降解发生变化前是否能对细胞产生足够的活性刺激以促进成骨，也是骨植入材料设计需要考虑的因素。因此，本论文分别在HA陶瓷表面构建了微、纳米结构，并分别研究了其对成骨性能的影响；进一步研究了微纳米组合结构的作用，并比较了微米和纳米结构在成骨分化中起到的作用以及组合结构协同促进成骨分化的机制；最后探讨了材料降解前微纳米结构对成骨分化激活作用的时效性问题。具体研究内容和结果如下：采用有序尼龙网筛为模板，干压成型制备得到具有有序微米图案化结构的HA生物陶瓷。选择不同目数的尼龙网筛，来实现对微米图案化尺寸的调控。体外细胞实验发现，微米图案化结构能够促进细胞的粘附、增殖和成骨分化。并且随着微米图案化尺寸的减小，细胞的成骨分化能力增强。尤其是图案化尺寸与细胞直径最为接近的样品，具有最优的促成骨分化能力。这表明图案化尺寸对细胞生物学功能有调控作用。有序微米图案化结构有望成为植入体表面结构设计的有效途径。
为了寻找能够与有序微米图案化结构复合、且生物学性能较优、结构较为精细的纳米结构，我们首先以光滑表面的HA为基底，简易调控去离子水的pH值分别为3、7和11，水热制备表面具有不规则纳米粗糙度和纳米棒的HA陶瓷。体外细胞实验表明，表面结构能够促进细胞的粘附、增殖和分化，但相比不规则
微纳米结构羟基磷灰石对骨髓间充质干细胞成骨分化的调控研究
纳米粗糙度，纳米棒结构具有更明显的促成骨能力。因此，我们将选择纳米棒结构作为下步与有序微米图案化结构复合的结构。此外，我们采用乙二胺四乙酸二钠钙（EDTANa2Ca）作为钙源对纳米棒结构进行优化，并将优化后的纳米棒作为次级结构引入到有序微米图案化上。这部分将为在有序微米图案化结构上引入次级纳米棒结构奠定了基础。
在前面两部分的基础上，采用模板法和水热法结合，制备出微纳米组合结构的HA。研究发现微、纳米结构以及组合结构，能够促进蛋白的选择性吸附，尤其是组合结构的效果最为明显，这一结果与材料对整合素的作用密切相关。体外细胞实验发现，微、纳米结构以及组合结构，能够促进细胞的粘附、增殖和分化，并且与单级微、纳米结构相比，组合结构具有协同促生物学性能的作用。有趣的是，在诱导成骨分化过程中，微、纳米结构在整合素、BMP2信号通路以及细胞间相互作用的激活中均起到了不同的作用，这可能是导致微纳米组合结构具有协同促成骨效应的机制。另外，微纳米结构对整合
素激活和成骨分化上的协同效应，不仅来源于微纳米结构与细胞接触起到的直接激活作用，还包括表面结构通过促进蛋白质选择性吸附进而促进生物活性的间接作用。其中，直接作用机制可以总结为：当细胞种植在材料表面时，表面结构首先激活整合素，然后进而激活BMP2信号通路和细胞-细胞间相互作用，而被激活的BMP2反过来也会继续激活整合素和细胞-细胞间相互作用。
结合前面三部分内容，我们采用微米、纳米、组合结构的HA作为研究对象，探究微纳米结构对细胞刺激多长时间，可以使细胞产生持续性的成骨分化；以及通过移除材料来结束结构刺激后，多长时间内这种激活效应仍然会调控细胞的成骨分化。研究发现，微纳米结构对细胞的成骨分化具有早期激活效应，并且当结构刺激结束后，成骨效应仍然具有持续效果。此外，我们的研究还发现，当材料表面的结构对细胞前期刺激作用时间越长，刺激结束后这种激活效应在后期表达越明显。并且，与单级结构相比，细胞在受到组合结构的前期刺激后，后期的持续性成骨分化效应表达也最为明显，并且微米和纳米结构差异性不大。因此，我们在今后设计具有表面结构的材料时，需要考虑结构的稳定性。
关键词：羟基磷灰石，微米图案化结构，微纳米组合结构，协同作用，激活效应
