1 磷酸钙生物材料骨诱导性
1. 1 磷酸钙骨诱导现象发现和确证磷酸钙(Calcium pho sphate) 为钙与磷酸根离子形成的化合物, 因晶体结构及钙磷组成比(CaöP )不同性能有差异。CaöP 比小于115 的磷酸盐很不稳定, 其溶解速率比新骨组织形成高很多, 故它们不适于作骨代材料。临床最常应用的磷酸钙是羟基磷灰石(Hydroxyapat ite, HA ) 和磷酸三钙(T ricalciumpho sphate, TCP)。HA 与组成人体骨骼和牙体硬组织的无机成分相同, 且晶体微观结构类似。大量的实验及临床应用证明, HA 具有优良的生物相容性, 可与骨组织发生化学性结合, 具有骨引导性 (O steoconduct ion) , 即材料植入骨环境中, 骨组织能沿着植入体表面或内部孔隙攀附生长。多数文献报道HA 无骨诱导性(O steo induct ion) , 即诱导间充质细胞向成骨分化的能力。HA 早在1871 年由RW aroneton 制得, 20 世纪70 年代始用于临床, 成为最常用的骨替代材料。TCP 分子式Ca3 (PO 4) 2, CaöP原子比为115, 化学组成与HA 相似, 但不是机体骨组织的矿物成分。TCP 因烧结温度不同分为A2和B2两相, 相转变温度为1 120～ 1 180℃, 以下为B2TCP,以上为A2TCP。在模拟体液(SBF) 中, A2TCP 比B2TCP 易解, 比HA 更易降解, 在体内易被降解吸收。M erten 和W ilfarg[ 2 ]将B2TCP 和A2TCP 植入微型猪 (Goet t inger m in iatu re p igs, GM P s) 人工胫骨缺损区考察降解性, 结果表明B2TCP 比A2TCP 更易降解, 降解产生的钙及磷酸根离子被周
围巨噬细胞吞噬, 也可被周围新生骨组织利用, 刺激和促进更多新骨生成。对HA öT CP 双相陶瓷, TCP 的降解将利于在陶瓷表面再形成类似针状或片状的、相对稳定和活化的HA 晶粒, 产生优良的生物学效应[ 3 ]。
磷酸钙作为最常用的骨代材料, 对其研究较为深入。早在1911 年,W ells 在A ch ives of In ternalM edical 一书中就提到: 钙盐对骨发生具有促进作用。但关于磷酸钙陶瓷的大量研究, 如Aok i、Hench等的工作都集中在HA 的制备及应用领域的拓广、评价方面, 并一直认为磷酸钙陶瓷是一类仅具有骨引导性, 而无骨诱导性的生物活性材料。1988 年Heughebeart 等[ 4 ] 研究发现, 没有添加任何生长因子或活体细胞的磷酸钙陶瓷植入动物非骨部位后,其表面形成骨样沉积物。1990 年Yam asak i[ 5 ]报道植入狗皮下的多孔HA , 其中有骨形成。1991 年, 张兴栋等[ 6 ]和R ipamon t i[ 7 ]分别报道植入狗2 月和狒狒3、6、9 月非骨部位的多孔HA 中有新骨形成。1992 年, To th 和Klein 均报道了磷酸钙陶瓷具有骨诱导性。之后, 张兴栋研究组在中国国家自然科学基金重大项目和国家重点基础研究规划项目(973) 资助下, 对磷酸钙陶瓷骨诱导现象的确证, 及其机理探讨作了大量深入系统的工作[ 8, 9 ] , 并在2000 年5 月[ 10 ]美国夏威夷举行的第六届世界生物材料大会上, 主持了生物材料固有骨诱导性的专题讨论, 使磷酸钙陶瓷具有骨诱导性的科学理论在国际上逐渐得到公认,同时为具有骨诱
导性的磷酸钙生物材料的临床应用提供充分的依据, 引导该领域的研究方向, 并为研制出拥有自主知识产权的骨诱导性骨修复材料奠定基础。
1. 2 磷酸钙骨诱导过程和机制
结合U rist 关于骨诱导发生的三个条件: (1) 有骨诱导因子; (2) 存在骨形成的前体细胞, 即诱导因子作用的靶细胞; (3) 适当的成骨环境; 并在大量前期研究的基础上, 张兴栋对磷酸钙(Ca2P) 陶瓷诱导骨发生过程及机制提出假说。大量实验[ 11, 12 ] 观察到: ①材料植入区血凝块形成, ②血管长入及肉芽组织形成, ③多形性细胞聚集, ④成骨细胞分化及骨形成。骨诱导机制可能为: ①材料对骨生长因子的吸附, 提高局部浓度, 诱导间充质细胞向骨前体细胞的分化, ②材料提供骨形成的支架及空间, ③材料降解为骨成熟提供所需的Ca、P 离子。材料植入机体后,与体液中的各种物质相互识别, 吸附水、离子、蛋白等生物分子, 发生系列的物理化学、生物学反应, 并形成一个特殊的“生物修饰表面”及局部微环境, 对细胞外基质、各种细胞因子、离子等生物分子的质、量进行再分配和重组, 它们包含了生物材料的全部信息, 并介导材料与细胞的作用。Ca2P 陶瓷诱导骨发生过程: Ca2P 植入机体非骨部位, 吸附内源性骨生长因子, 如BM P s 等, 诱使间充质细胞向材料内趋化、迁移——骨生长因子
作用于间充质细胞相应受体—— 经细胞信号转导系统, 引起级联放大效应——相关基因表达, 间充质细胞骨向分化为骨母细胞——分泌骨细胞间特异性的粘连分子(骨粘连素等) ——骨母细胞将具有类似自然骨特定化学组成和三维多孔结构的Ca2P 陶瓷错位识别为自然骨, 停泊、黏附于其内表面——骨母细胞自分泌BM P 等生长因子, 引起自身及相应细胞分化、增殖、成熟为骨。骨诱导过程及机制的提出有一定的理论基础, 随后的研究也对各过程进行了一些确证。内源性BM P s存在, 骨骼、肾脏、肺等器官正常状态下均具有分泌BM P s 的功能, 在血液中BM P s 的含量为数ngöm l,一般对间充质细胞不产生效应, 只有在一定的部位BM P s 达到一定浓度时, 才引起间充质细胞的骨向分化。邹萍等[ 13 ]经体外实验认为HA öT CP 可强有力吸附BM P。Q u 等[ 14 ]通过免疫组织化学方法发现, 靠近Ca2P 陶瓷的细胞基质中有BM P22 和BM P24 的聚集, 说明磷酸钙陶瓷对BM P 的吸附在骨诱导发生中发挥重要作用。骨诱导发生后, 推测是自分泌BM P促进新骨的继续发生, 但此研究尚在进行中。W ang等[ 15 ]采用不同组成的HA öTCP 双相陶瓷与成骨细胞培养, 考察与骨改建相关Rank 基因的表达, 说明不同理化性能磷酸钙陶瓷通过信号转导途径对骨形成和改建产生不同的效应。
磷酸钙陶瓷骨诱导现象确证的研究从形态学向分子生物学水平深入, 大量研究已从光镜(LM )
水平, 也有通过透射电镜(TEM ) 从形态学上确证磷酸钙陶瓷具有骨诱导性[ 16 ]。借助于现代分子生物学技术, 有研究[ 14 ] 对骨特征蛋白如É 型胶原(Co llagentypeÉ ) 、BM P、骨涎蛋白(O steo sialop ro tein) 等表征, 更早期地确证骨诱导的发生。
关于磷酸钙陶瓷诱导成骨的形式, 多数研究报道为膜内成骨; Bao 等[ 17 ]观察到材料内长入组织的形态、成分与材料的骨诱导活性相关; 骨诱导活性好的, 细胞直接骨向分化; 骨诱导活性差的, 则先形成纤维组织, 并见炎细胞浸润, 再膜内或纤维化生形式成骨。外加BM P 或成骨细胞的成骨过程为软骨化骨[ 18, 19 ]。有资料称骨形成过程中, 血供不足则形成软骨, 而血供充分则直接成骨。
1. 3 磷酸钙陶瓷骨诱导相关因素的研究
1. 3. 1 材料学因素 用于骨诱导性研究的材料包括HA、A2TCP、B2TCP、A2TCPöHA、B2TCPöHA、(A+ B) 2TCPöHA 等磷酸钙陶瓷, 以及磷酸钙骨水泥、T iO 2 陶瓷和高分子材料PEOöP ET。这些材料均为多孔的, 磷酸钙陶瓷烧结温度1 100℃～ 1 250℃, 由湿合成Ca、P 粉料经H2O 2 发泡烧结而成。研究表明,化学组成、材料结晶度等对骨诱导性影响显著。磷酸钙陶瓷骨诱导性顺序由高到低为: HAöB2TCP >HAöA2TCP> H
A > B2TCP> A2TCP。物理形貌如材料的孔隙率、孔径、孔隙分布及其是否贯通等以及机械性能, 对骨诱导性影响也很大。Yuan 等[ 9, 20 ]选择不同体系的磷酸钙陶瓷进行动物实验, 认为具有相互贯通的大孔, 并在大孔上有丰富的数微米至数十微米的微孔的陶瓷骨诱导性好。同时, 植入体内后,易于在孔壁表面形成类骨磷灰石(Bone likeapat ite, BLA ) , 或预先在动态SBF 中形成BLA 的磷
酸钙陶瓷具有良好骨诱导性[ 21 ]。所以经特殊处理的T iO 2 陶瓷和高分子材料PEO öP ET 也具有骨诱导性。BLA 层是晶体结构不完善的碳酸化磷灰石, 在表面稳定的材料上不易形成, 该结构层对骨生长因子的吸附, 间充质细胞的趋化、诱导, 骨组织细胞的黏附均起重要作用。研究表明作为骨诱导性材料, 应具有高度活性的内表面和界面, 以利细胞的黏附、停
泊, 骨诱导发生; 同时应具有相对稳定的多孔支架结构, 保证材料内骨组织的发育成熟过程中, 材料不发生塌陷。为优化选择骨诱导性材料, 对影响骨诱导性的材料学因素仍在继续研究中。
1. 3. 2 动物种属 用于骨诱导性研究的动物包括大鼠、兔、山羊、狗、猪、猴、狒狒等, 同样的磷酸钙陶瓷在不同种属动物中骨诱导性不同, 一些研究认为骨诱导现象易在灵长类、
家猪和犬齿类动物中发生,这可能同观察时期长短及评价标准相关, 也可能与材料在不同动物体内物质交换、降解吸收情况不同有关, 但缺乏实验依据。Bao 等[ 17 ]将HA、A2TCPöHA
和B2TCPöHA 三种磷酸钙陶瓷植入大鼠、兔和狗三种动物肌内, 经统计学分析, 进一步确证磷酸钙陶瓷骨诱导性具有材料因素和动物种属依赖性。
1. 3. 3 骨诱导相关间充质细胞的来源 不加任何生长因子或细胞的磷酸钙陶瓷植入动物非骨部位, 1周后材料内就观察到骨样细胞, 1 月后形成骨小梁, 3 月形成成熟骨。经光镜、透射电镜观察到[ 16 ] , 在Ca2P 陶瓷大孔壁周环绕着毛细血管和间充质细胞, 提示诱导成骨的间充质细胞来源可能为长入材料孔隙内的毛细血管周皮细胞(pericyte)。但所来源间充质
细胞可能不只一种, 有研究经免疫组织化学推测来源于骨髓基质干细胞[ 22 ]。关于骨诱导相关间充质细胞的来源目前仍不甚确切。
1. 4 骨诱导性Ca-P 生物材料应用研究自1965 年U rist 发现骨生长因子BM P 以来, 各
国均投入大量的人力、财力对其制备和应用进行研究, 但自今仍无十分可行的方法能有效地
利用和控制BM P 的骨诱导性, 故没有一个国家批准其正式进入临床应用。根据ISO 1099321 对40ö60 的TCPöHA进行生物学评价, 表明其具有良好的骨诱导性及生物相容性, 即通过材料自身组成和结构的优化可赋予其优良的骨诱导性, 因此避免了为获取骨诱导性
材料而加入外源性生长因子可能引起的细胞无限增殖或恶变。20 世纪90 年代末, 张兴栋[ 22 ]在骨诱导性Ca2P 陶瓷材料学特征及生物学机理研究较为成熟的基础上, 结合组织工程发展的现状, 提出体内组织工程的概念。包崇云等[ 23 ] 将体内骨组织工程描述为: 体内骨组织工程是应用不外加生长因子或细胞而固有骨诱导性的生物材料, 直接植入骨缺损区再生新骨, 或在不影响机体功能非骨部位的自身组织内, 构建形成含有活体组织细胞的骨替代物植入骨缺损区诱导骨再生。它与经典组织工程方法构建骨移植物不同在于: (1) 没有使用经体外培养的细胞。 (2) 直接在机体自身环境内非病变区形成含有活体细胞的骨移植物。(3) 可构建足够大的骨修复体, 组织长入骨诱导性Ca2P 陶瓷内部范围是孔径的10倍。(4) 可形成带血管蒂的组织工程化骨移植物, 与显微外科技术结合, 修复缺损骨。
通过体外与成骨细胞复合培养表明, 具有骨诱导性的HA öT CP 较纯HA、生物玻璃或钛合金更能促进细胞分化、增殖和生长。体内较长时期的实验观察表明HA öTCP 诱导所形成骨与
自然骨形态和结构无差异。骨诱导性HA öT CP 直接或经过体内组织工程化骨后, 再辅与一定的骨固定技术可用于负重骨缺损修复[ 24 ]。张聪等[ 25 ]将骨诱导性HA öT CP 用
于临床病例骨缺损治疗, 获得良好的形态恢复和功能重建, X 片复查发现HA öT CP 在体内有一定的降解。
2 展 望
