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一种对羟基磷灰石进行荧光标记的方法[发明专利]

更新时间:2023-06-10 23:25:43 阅读：评论：0

[19]

中华人民共和国国家知识产权局

[12]发明专利申请公布说明书

[11]公开号CN 101419140A [43]公开日2009年4月29日

[21]申请号200810162190.1[22]申请日2008.11.18

[21]申请号200810162190.1

[71]申请人浙江理工大学

地址310018浙江省杭州市江干区经济技术开发

区白杨街道2号大街5号

[72]发明人蔡玉荣姚菊明李恭楚王秀华 [74]专利代理机构杭州求是专利事务所有限公司代理人林怀禹

[51]Int.CI.G01N 1/28 (2006.01)G01N 21/64 (2006.01)A61B 5/00 (2006.01)

权利要求书 1 页说明书 6 页附图 3 页

[54]发明名称

一种对羟基磷灰石进行荧光标记的方法

[57]摘要

本发明公开了一种对羟基磷灰石进行荧光标记

的方法。该方法是将生物荧光素-异硫氰酸荧光素

通过吸附或共价键等方法连接到羟基磷灰石颗粒上，

使羟基磷灰石颗粒被标记上荧光。本发明采用的标

记物异硫氰酸荧光素，是一种生物荧光素，具有较

好的生物相容性；经过长时间反应和充分洗涤之后，

异硫氰酸荧光素可以与羟基磷灰石颗粒实现牢固结

合，使用过程中不会从羟基磷灰石表面脱离下来对

试验结果造成负面影响；所得到的荧光物质吸收峰

范围较窄，为480～510纳米之间，适用于多种荧光

同时存在的环境中。本发明可应用于材料和生物医

学研究领域，尤其适用于羟基磷灰石颗粒与细胞相

互作用时的界面、过程及机理研究。

200810162190.1权利要求书第1/1页 1.一种对羟基磷灰石进行荧光标记的方法，其特征在于：配制重量百分比为1.5～3％的重碳酸钠缓冲溶液，将异硫氰酸荧光素溶解在该缓冲溶液中，控制异硫氰酸荧光素在缓冲溶液中的浓度为0.02～0.1克每升；再将羟基磷灰石颗粒分散在上述溶液中，颗粒浓度为0.5～1.5克每升，搅拌0.5～2小时；利用羟基磷灰石的强吸附作用将异硫氰酸荧光素吸附到颗粒表面，再将该悬浊液避光环境保存在1～8℃下继续作用10～20小时后，通过离心、透析和过滤作用除去颗粒表面未吸附的荧光素；将标记好的羟基磷灰石颗粒在35～45℃避光环境中真空干燥，得到干燥的荧光标记的羟基磷灰石颗粒。

2.根据权利要求1所述一种对羟基磷灰石进行荧光标记的方法，其特征在于：所述荧光标记的羟基磷灰石颗粒在温度为110～125℃，压力为104-108kPa，在15～20min下进行灭菌。

3.根据权利要求1所述一种对羟基磷灰石进行荧光标记的方法，其特征在于：所述荧光标记的羟基磷灰石的最大吸收波长为490纳米，最大发射波长为503纳米。

200810162190.1说明书第1/6页

一种对羟基磷灰石进行荧光标记的方法

技术领域

本发明涉及一种对羟基磷灰石进行荧光标记的方法。

背景技术

自然界中，脊椎动物硬组织的主要生物矿物相是羟基磷灰石。研究发现，人工合成的羟基磷灰石具有与矿物相羟基磷灰石相同的成分、结构和优秀的生物相容性，因此被认为是最理想的骨组织修复替代材料之一，在临床上已被广泛用于骨组织缺失和缺损的修复和替代。

近年来，随着分析检测方法和技术的飞速发展，人们发现构成人体硬组织的羟基磷灰石颗粒的基本构成单元都保持在纳米尺度—有序的羟基磷灰石颗粒镶嵌在胶原蛋白中，赋予了骨组织优秀的生物学和力学性能“G a o H.，J i B.，J a g e r I. L.，A r z t E.，F r a t z P.，P N A S，2003，100，5597；C u r r y J.D.，P r o c.R.S o c.L o n d. B，1997，196，443”。生物矿化及仿生材料研究使得人们将目标转向了纳米羟基磷灰石。目前认为人体内钙化过程是在正确时间、正确地点，生成和维持正确量和正确结构的矿化产物“王夔，化学通报，2003，15，428；杨晓达，张天蓝，王夔，化学进展，2004，16，836”，在此过程中，细胞和有机基质起到了重要的调控作用，但是其调控机理却知之甚少。此外，作为一种新型的生物医用材料，人们更多关注的是纳米羟基磷灰石的生物相容性。目前比较一致的结论是纳米羟基磷灰石能够抑制肿瘤细胞和癌细胞的增殖和分化“F u Q，Z h o u N，H u a n g W，W a n g D，Z h a n g L，L i H.，J B i o m e d.M a t e r.R e s.(A)2005，74A 156；W a n g Y.，Yan Y.H.，Li Sh.P.，J Wuhan Univ.Tech.(mater.Scien.Edition)2005，20，184”，但对于普通细胞的影响则具有多样性。相关的研究工作还有很多“T h o m a s J.W.，Celaletdin E.，Robert H.D.，Rochard W.S.，Biomaterials 2000，21，1803；Sun J.，Lin F.，Hung T.，Tsuang Y.，Chang W.，Liu H.，J.Biomed.Mater.Res.1999，311；Welzel T.，Radtke I.，Meyer-Zaika W.，Heumannb R.，Epple M.J Mater.Chem.

2004，14，2213.”。磷酸钙这种特殊的细胞生物相容性以及近来在用作非病毒基因/药物载体以及龋齿

修复和牙小管填充等方面表现出来的潜能使得人们对其在生物医学方面的应用寄予厚望。但是关于磷酸钙与细胞作用的机理研究却刚刚起步，很多疑问还亟待回答，例如磷酸钙是在哪个位置上对细胞产生影响，细胞膜上还是细胞内？它的哪些特征是影响细胞的关键因素？它通过哪些途径实现

对细胞的生物学行为的影响？是否可以通过人为改变磷酸钙的物化性能来调控细胞的行为？这些问题的解决对于我们了解生物矿物矿化机理和设计开发新型医用材料以及制定安全性评价标准都有着深远且现实的意义。

进行纳米羟基磷灰石的生物相容性、矿化机理以及与细胞相互作用的研究时，我们首先遇到的一个问题是如何对该种材料进行示踪。解决这个问题最有效的办法是对该材料进行生物标记。例如，将近红外荧光量子点与羟基磷灰石复合“储茂泉，金鑫，发明专利，近红外荧光量子点标记的羟基磷灰石及其制备方法和应用。公开号：C N1693410A”，或者将铽、铕等“D o a t A.，F a n j u l M.，P e l l i e F.，Hollande E.，Lebugle A.，Biomaterials 2003，24，3365；Riwotzki K.，Meyssamy H.，S c h n a b l e g g e r H.A n g e w C h e m l n t E d.2001，40，573.”稀土离子掺杂到羟基磷灰石中，使其可发出荧光等，但这些材料的制备方法通常比较复杂，而且量子点和稀土元素的生物相容性还有待于考证。

发明内容

为了克服背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种对羟基磷灰石进行荧光标记的方法，所

得材料具有很好的生物相容性，稳定的光学性质，较窄的荧光激发波长范围，适用于需要对羟基磷灰石进行示踪的环境中，尤其适用于羟基磷灰石和细胞间界面及作用机理的研究。

本发明采用的技术方案是：

配制重量百分比为1.5～3％的重碳酸钠缓冲溶液，将异硫氰酸荧光素溶解在该缓冲溶液中，控制异硫氰酸荧光素在缓冲溶液中的浓度为0.02～0.1克每升；再将羟基磷灰石颗粒分散在上述溶液中，颗粒浓度为0.5～1.5克每升，搅拌0.5～2小时；利用羟基磷灰石的强吸附作用将异硫氰酸荧光素吸附到颗粒表面，再将该悬浊液避光环境保存在1～8℃下继续作用10～20小时后，通过离心、透析和过滤作用除去颗粒表面未吸附的荧光素；将标记好的羟基磷灰石颗粒在35～45℃避光环境中真空干燥，得到干燥的荧光标记的羟基磷灰石颗粒。

所述荧光标记的羟基磷灰石颗粒在温度为110～125℃，压力为104-108k P a，在15～20min下进行灭菌。

所述荧光标记的羟基磷灰石的最大吸收波长为490纳米，最大发射波长为503纳米。

本发明具有的有益效果是：

本发明采用的标记物异硫氰酸荧光素是一种生物荧光素，具有较好的生物相容性；经过长时间反应和

充分洗涤之后，异硫氰酸荧光素已经与羟基磷灰石

颗粒实现牢固结合，使用过程中不会从羟基磷灰石表面脱离下来对试验结果造成负面影响；所得到的荧光物质吸收峰范围较窄，为480～510纳米之间，适用于多种荧光同时存在的环境中。本发明可应用于材料和生物医学研究领域，尤其适用于羟基磷灰石颗粒与细胞相互作用时的界面、过程及机理研究。

附图说明

图1是经过异硫氰酸荧光素标记后的羟基磷灰石颗粒的荧光图谱。

图2是经过异硫氰酸荧光素标记后的羟基磷灰石颗粒的共聚焦显微镜图片。图3是经过异硫氰酸荧光素标记后的羟基磷灰石颗粒在细胞中的共聚焦图片。

具体实施方式

本发明中所用到的羟基磷灰石是一种弱碱性磷酸钙盐，包括人工合成的羟基磷灰石或动物体内的羟基磷灰石，可通过固相反应法、水热法、水解法、共沉淀法、溶胶-凝胶法、微乳液法等或者通过煅烧动物骨的方法获得，得到的颗粒是尺寸为10至10微米的羟基磷灰石颗粒，呈针状、棒状、球状、多边形状

或不规则颗粒状。