中国组织工程研究与临床康复 第15卷 第12期 2011–03–19出版
Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Rearch March 19, 2011 Vol.15, No.12
ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH
2095Third Department of Orthopaedics, Third Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022, Anhui Province, China
Tang Jian, Chief physician, Third Department of
Orthopaedics, Third Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022, Anhui Province, China tangjian_ayfy@ 163
Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No.
30772440*; Scientific and Technological Project of Anhui Province, No. 08010302196*
Received: 2010-09-20
Accepted: 2010-10-20
安徽医科大学附属第三医院骨三科，安徽省合肥市 230022
汤健，男，1958年生，安徽省巢湖市人，汉族，1982年安徽医科大学毕业，主任医师，主要从事骨科
临床及骨修复材料研究。
tangjian_ayfy@ 163
中图分类号:R318 文献标识码:B
文章编号:1673-8225 (2011)12-02095-05
收稿日期：2010-09-20 修回日期：2010-10-20
(20100920015/D•Y)
肝素-壳聚糖复合体-羟基磷灰石-米诺环素新型仿生纳米复合材料 修复兔胫骨缺损**
汤 健，李全利，周 剑，窦晓晨
New bionic composite of heparin-chitosan-hydroxyapatite-minocycline repairs rabbit tibial defects
T ang Jian, Li Quan-li, Zhou Jian, Dou Xiao-chen Abstract
Tang J, Li QL, Zhou J, Dou XC.New bionic composite of heparin-chitosan-hydroxyapatite-minocyclin
e repairs rabbit tibial defects. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(12):2095-2099. [ en.zglckf]
摘要
汤健，李全利，周剑，窦晓晨.肝素-壳聚糖复合体-羟基磷灰石-米诺环素新型仿生纳米复合材料修复兔胫骨缺损[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15(12):2095-2099. [ cn.zglckf]
0 引言
由于创伤、感染、肿瘤等形成骨缺损，当缺损超过人体自修复能力仅以纤维组织充填导致骨缺损不愈合，形成骨不连。骨缺损的治疗是骨科的难题之一。目前临床上的植骨主要有自体骨、异体骨、人工骨等。自体骨移植包括游离骨移植和带血管骨移植，从修复质量，免疫排斥，
疾病传播等多方面综合评定，是临床治疗骨缺损的金标准。但自体骨移植存在着取骨量有限，对患者有二次创伤，增加患者痛苦，影响供骨区生物力学强度和功能等缺点[1]。异体骨分为同种异体骨和异种异体骨，虽然具有自体骨的组织学特点，并可以减少手术次数，但存在着一定的免疫排斥反应以及潜在感染的病毒感染风险，且由于目前工艺水平及来源限制，制样、处理、存储的成本很高，价格昂贵，应用受到限制，无法在临
汤健，等. 肝素-壳聚糖复合体-羟基磷灰石-米诺环素新型仿生纳米复合材料修复兔胫骨缺损
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床大规模使用。为了克服自体骨移植和异体骨移植的缺点，利用人工修复材料进行骨缺损修复开始成为治疗骨缺损研究中的热点。
近20年来，应用分子仿生方法构建有机-无机复合的骨组织修复材料是人体硬组织修复材料研究的热点之一[2-3]。生物矿化组织的无机相具有种类的特异性，但是都是从有机大分子产生、合成、并受大分子的控制，既“生物矿化有机基质调控理论”，其不是以组织替代为目的，而是促进组织的再生；具有生物活性以及促进组织自我修复的能力；一旦植入体内，就能在分子水平激活基因表达，刺激特异性的细胞反应，帮助机体进行自我修复[4]
。
合作单位四川大学华西口腔实验室以肝素-壳聚糖复合物为大分子模板，调控羟基磷灰石的生长，同时装载抗菌药物米诺环素合成新型抗菌纳米复合骨修复材料。实验通过制作兔胫骨临界性骨缺损动物模型来评价这种新型硬组织修复材料促进骨缺损修复的效果。
1 材料和方法
设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2009-10/2010-03在安徽医科大学动物实验中心完成。
材料：
实验动物：健康新西兰大白兔20只，兔龄五六个月。
体质量2.5~3.5 kg ，雌雄不拘，购于安徽医科大学动物实验中心(合格
证号：皖医实动准字02号)。
实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。
主要试剂及仪器：
方法：
材料的制备：合作单位四川大学华西口腔实验室以肝
素-壳聚糖复合体为大分子模板，调控羟基磷灰石的生长，同时装载抗菌药物米诺环素合成新型抗菌纳米复合骨修复材料。
动物模型制备及分组处理：制备兔的胫骨上端腔隙
性骨缺损模型[5]。3%戊巴比妥钠按1 mg/kg 行耳缘静脉
注射麻醉，固定四肢，剪除双膝以下小腿的兔毛。碘伏消毒，铺洞巾。以膝关节以下胫骨内髁的平台为基点，做一纵行切口，约3 cm 。分离软组织，仔细剪除内髁平台周围骨膜，用口腔科磨钻切除胫骨内髁的平台关节面以近皮质骨约1.5 cm×0.8 cm 大小，刮匙刮除骨髓及松质骨。冲洗后，仔细止血。20只大白兔随机数字表法分为实验组(n =16)和空白对照组(n =4)。实验组填塞实验材料，压紧填实；空白对照组只造骨缺损模型，未做处理。全层缝合皮肤，外用手术切口敷料包裹切口。术后未予以固定，笼养，常规饲养。
主要观察指标：
X 射线平片检查：于术后2，4，8，12 周拍片，摄片
后处死。观察骨缺损愈合情况，骨痂密度等，条件为 0.4 s ，50 mA ，40 kV 。
病理切片：取下来的骨缺损样本甲醛固定：①甲酸常
规脱钙石蜡包埋，切片苏木精-伊红染色。②制作硬组织学切片，Masson 染色，Olympus 光学显微镜观察观察骨缺损区组织形态学变化。
大体观察：观察实验动物的一般表现，上肢术后切口
愈合情况，肢体活动，处死后观察骨折端与材料界面及软组织界面的情况，植入区的材料颜色以及体积变化，缺损区骨质生长情况，炎症反应情况等。
2 结果
2.1 实验动物数量分析 在实验之前做过多次预实验，对兔的习性，麻醉剂量，术中操作，手术时间，术中补液，术后护理，等均做出了精细安排，有效减少了动物的出血量和麻醉时间，因此在后期的手术过程中均无动物的非实验要求死亡。
术后20 min ，实验动物完全苏醒，能自由活动。
术后前3 d 进食较少，活动逐渐好转，术后1 d 观察切开周围组织轻微肿胀，淤血。切开无红肿、渗液、流脓等炎症反应。皮肤无脓肿形成。通过改进实验条件和术后饲养水平，以及合理改进实验时间，家兔均成活至实验要求时间。 2.2 大体观察
试剂及仪器
来源
溶液沉淀合成、非烧结 羟基磷灰石粉末(微米级) 四川大学口腔医学院
材料研究室 壳聚糖，肝素 Sigma 公司 盐酸米诺环素(纯度99%) 武汉远城科技发展有限公司显微镜 Olympus bx51 pixellink 微型直流高速调速电钻套装 Revolution XR/d X 光机 韩国STRONG 204系列 美国GE 公司 Leica 病理组织包埋机，Leica SP1600硬组织切片机 德国Leica 公司
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空白对照组12周：软组织增生充填覆盖骨缺损，未形
成骨性愈合。标本剖面见骨缺损髓腔形成空腔，髓腔两端封闭，未有新生骨长入。 2.3 修复后X 射线平片检查
两组修复后X 射线检查结果：
2.4 组织学观察 实验组植入2周苏木精-伊红染色，成骨细胞包绕着大量的骨髓基质细胞形成，无明显的炎症反应。成骨活跃。植入材料正在分解。见图3。
修复4周后，新骨形成明显增多。大量的网状编织骨形成。形成骨岛，钙化明显增强，开始早期塑形改变，
可见骨细胞形成的腔隙及新骨周边有破骨细胞，见图4。
第8周，编织样骨组织进一步成熟，趋于有序性。纤维的排列方向表现出负荷的适应性改建，髓腔已经渐渐形成，骨小梁上可见成熟骨细胞，材料已分解，见图5。
在12周时，新生骨组织进一步成熟，表现为松质骨逐渐向密质骨的改建，出现板层骨结构，可见小血管。骨创边缘与原有正常骨组织相接，表现成骨的连续性，见图6。
空白对照组12周时观察见髓腔无明显成骨现象，大量纤维组织及炎症细胞浸润，骨折断端未愈合。 2.5 硬组织学切片 4周时观察骨折断端有新骨骨折断端未融合，接触区材料分解较完全，大量网状编制骨形成，开始早期塑形。高倍镜下见新生骨基质中骨细胞
Figure 1 Bone defects area after experimental group animals were killed
图1 实验组处死后骨缺损区观察
Figure 3 Decalcified
ctions at 2 wk postoperation (Hematoxylin-eosin staining)
图3 苏木精-伊红染色观察材料植入2周脱钙切片 a: Postoperative 2 wk c: Postoperative 8 wk b: Postoperative 4 wk
Figure 2 X ray films of repairing bone defect at different time
in the experimental group
图2 实验组骨缺损不同时期的X 射线平片 Figure 4 Decalcified ctions at 4 wk postoperation
(Hematoxylin-eosin staining)
图4 苏木精-伊红染色观察材料植入4周脱钙切片
Figure 5 Decalcified ctions at 8 wk postoperation (Hematoxylin-eosin staining)
图5 苏木精-伊红染色观察材料植入8周脱钙切片
d: Postoperative 12 wk
a: Postoperative 2 wk c: Postoperative 8 wk b: Postoperative 4 wk d: Postoperative 12 wk a: ×40
b: ×100 OB
NB a: ×40 b: ×100 M NB M
NB OB
NB C NB: new bone; OB: osteoblasts; M: repairing material; C: osteocytes
NB: new bone; OB: osteoblasts; M: repairing material
a: ×40 b: ×100 NB C NB: new bone; C: osteocyte; MC: marrow cavity; F: fibrous connective tissue MC F
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形成，周围有成骨细胞包绕，见图7。
12周时观察显示骨折断端与新生骨融合，边界已难分清，表现出骨的连续性，见图8。
3 讨论
Hollinger 等[6]将临界性骨缺损规定为在动物生命周期内愈合小于10%的骨缺损，如果1年内未达此水平，便可以认为此模型符合CSD 的标准这具有一般的指导性。
李翼等[7]证明了兔的胫骨上端腔隙性骨缺损模型的有效性。本次实验所形成的缺损远超过此临界值的需求，在实验中空白对照组也显示12周时骨缺损区无骨性愈合，表明实验设计的缺损模型是一种骨创不能自行愈合的骨缺损模型。
植入后不同时间点的大体观察摄片证明，随着时间推移，实验组每个时间点植入材料颜色较之前都变
淡，材料分解明显，新生骨痂与周围骨组织界限已经模糊，到12周时缺损已经不能看到，骨缺损区已骨性愈合，外有少量纤维组织包裹，未见纤维组织长入，有血管孔生成。
植入后不同时间点的X 射线平片证明，实验组每个时间点都有骨痂形成，骨缺损区形成毛玻璃样模糊影，且随着时间的推移，骨缺损区的边界越模糊，到12周时缺损已经不能看到，符合大体观察标本所看到的情况。而空白对照组骨缺损区12周时周围骨皮质硬化，缺损清晰，表明未有新生骨形成，骨缺损未得到有效修复。
组织学观察术后不同时期染色切片，随着时间的推移，骨折断端成骨活跃，新生骨基质周围包绕着大量成骨细胞，到4周后骨折端新骨形成明显增多。大量的网状编织骨形成，钙化较强，有成骨细胞包埋在骨陷窝中成为骨细胞，术后8周时实验组显示编织样骨组织进一步成熟，骨小梁趋于有序性，松质骨逐渐向密质骨的改建，出现板层骨结构。可见小血管，骨创边缘与原有正常骨组织相接，表现成骨的连续性，表明新型骨修复材料可以有效修复骨缺损。
实验从大体观察、影像学及组织学三方面证明了新型骨修复材料可以有效修复骨缺损，其机制可能是：骨组织是由24%的有机成分和74%的无机成分组成，无机成分则主要是羟基磷灰石的纳米级晶体。新型复合材料中羟基磷灰石以纳米级纤维填充无机基质，具有天然骨的类似结构。充分发挥纳米羟基磷灰石的生物相容性，而由肝素和壳聚糖复合体组成有机基质模板，调控羟基磷灰石晶体的生长。
壳聚糖是一种天然多糖，具备良好的生物相容性，一定的孔径和孔隙率利于细胞长入，较好的生物机械性，降解性等
[8-11]
。可作为仿生合成人工材料的大分子模板，
已被广泛应用于生物材料和生物制药领域。以壳聚糖制成的纳米载体可延长药物在吸收部位的保留时间，达到缓释控释的效果[12-15]。肝素是一种天然生物活性多糖类化合物，除具有很强的抗凝血性外，肝素分子中含有与多种生长因子结合的位点，能够促进生长因子对细胞增殖、组织或器官修复和再生的作用。研究表明，控释载体肝素化是制备生物载体的有效方法[16-17]。采用壳聚糖结合肝素分子形成的生长因子载体可有效减低生长因子的扩散速率，并可有效保护其活性[18]。装载的抗菌成分米诺环素，是四环素类药物，具有抗菌、抑制胶原酶、抑制骨吸收、易于新骨形成等作用[19-20]。米诺环素本身是一种金属螯合剂，能够与Ca 2+等阳离子络合。因此在反应的过程中，米诺环素
Figure 6 Decalcified ctions at 12 wk postoperation
(Hematoxylin-eosin staining)
图6 苏木精-伊红染色观察材料植入12周脱钙切片
Figure 7 Histological ctions of broken ends at 4 wk postoperation in the experimental group (Masson
staining)
图7 实验组4周断端硬组织学切片(Masson 染色) Figure 8 Histological ctions of broken ends at 12 wk postoperation in the experimental group (Masson staining) 图8 实验组12周断端硬组织学切片(Masson 染色) a: ×40
b: ×100 NB: new bone; OB: osteoblasts; M: repairing material; C: osteocyte; BV: bone vesl
a: ×40 b: ×200 NB: new bone; OB: osteoblasts; M: repairing material; C: osteocyte; B: bone tissue a: ×40 b: ×100 NB: new bone; MC: marrow cavity BV
NB
MC
MC
C
F
MB
MC
NB
B NB OB C
M
NB
汤健，等. 肝素-壳聚糖复合体-羟基磷灰石-米诺环素新型仿生纳米复合材料修复兔胫骨缺损
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与Ca 2+的络合，一方面，影响了磷灰石的晶体结构，使磷灰石晶体含有Cl 等元素
[21-22]
；另一方面，米诺环素分子也
被包裹在羟基磷灰石晶体、壳聚糖及肝素分子中，能够持续、稳定、高效的缓慢释放。体外实验已经证明复合物中，米诺环素可以不断的缓释，发挥抗菌作用。
肝素-壳聚糖复合体-羟基磷灰石-米诺环素仿生纳米复合材料修复兔胫骨缺损的实验研究证明其可以有效促进临界性骨缺损的修复，为此新型材料的临床应用打下了基础。
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