珊瑚羟基磷灰石表面改性的工艺
常加贺 1），李 靖 2），苏 军 2），和丽佳 2），陈庆华 3），张文云 2）
（1）长治医学院附属和平医院，山西 长治 046000；2）中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院，
云南 昆明 650032；3）昆明理工大学材料与工程学院，云南 昆明 650500）
[ 摘要 ] 目的 探究纳米氧化锌（nmZnO ）在不同条件下改性珊瑚羟基磷灰石（CHA ）的工艺研究。方法 在弱酸环境内，温度70 ℃条件下，采用硝酸锌溶胶-凝胶法改性珊瑚羟基磷灰石，通过超声、旋转搅拌、干燥、煅烧获得白色颗粒状多孔复合材料，应用扫描电子显微镜观察改性后材料表面特征。结果 在不同原料配比条件下，nmZnO 颗粒在CHA 表面的分布及粒径大小存在差异。热处理过程中，保温温度及保温时间的改变会导致材料的除碳效果及结构完整性发生变化。结论 利用硝酸锌溶胶-凝胶法可以对珊瑚羟基磷灰石进行表面改性，纳米氧化锌粒径小于100纳米，纳米粒子的团聚问题得以解决。
[ 关键词 ] 珊瑚羟基磷灰石； 氧化锌； 改性； 抗菌性能
[ 中图分类号 ] R318.08 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] 2095 − 610X （2021）01 − 0017 − 06
Process Studies on the Surface Modification of
Coral Hydroxyapatite
CHANG Jia-he 1），LI Jing 2），SU Jun 2），HE Li-jia 2），CHEN Qing-hua 3），ZHANG Wen-yun 2）（1） Heping Hospital Affiliated to Changzhi Medical College ，Changzhi Shanxi 046000; 2） Dept. of Stomatology ，No.920 Hospital of PLA ，Kunming Medical University ，Kunming Yunnan 650032;
3） Faculty of Materials and Engineering ，Kunming University of Science and
Technology ，Kunming Yunnan 650500，China ）
［Abstract ］ Objective To explore the process of modifying coral hydroxyapatite by nmZnO under the different conditions. Methods Coral hydroxyapatite was modified by zinc nitrate sol-gel method at 70 ℃ in weak acid environment. White granular porous composite materials were obtained by ultrasonic，rotary stirring，drying and calcination. The surface characteristics of the modified materials were obrved by scanning electron microscope.Results The results showed that the distribution and size of nmzno particles on the coral hydroxyapatite surface were different under the different raw material ratios. In the process of heat treatment，different holding temperature and holding time would lead to the change of carbon removal effect and structural integrity of m
aterials.Conclusion Coral hydroxyapatite surface can be modified by zinc nitrate sol-gel method. The particle size of nano zinc oxide is less than 100 nanometers. The agglomeration problem of nano-particles is solved.
［Key words ］ Coral hydroxyapatite；Zinc oxide；Modification；Antibacterial property
近年来因创伤和不良生活习惯等原因所导致的口腔颌面部骨折、骨肿瘤等疾病越来越多[1−4]，造成严重的骨缺损问题，给人们带来生理功能障碍和精神创伤。目前临床工作中使用的骨移植材料通常不具备抗菌性能，骨移植术后感染发生率较高，导致植骨术失败。因此，研制出一种兼具良好生物相容性、成骨活性、长效广谱抗菌性和不产生耐药性的多孔骨修复材料非常必要。
[收稿日期] 2020 − 07 − 12
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目（81260272）
[作者简介] 常加贺（1994～），男，山西长治人，医学硕士，住院医师，主要从事口腔材料学研究工作。[通信作者] 张文云，E-mail ：******************
昆明医科大学学报 2021，42 （1 ） ：17~22Journal of Kunming Medical University
DOI: 10.12259/j.issn.2095-610X.S2*******
CN 53 − 1221/R
在抗菌生物材料中，纳米氧化锌由于其原材料资源丰富、价格较低、对环境无毒害，且具有宽禁带、紫外吸收、抗菌性能优异等特点受到研究者的广泛关注[5−6]。课题组前期通过溶胶-凝胶法成功制备出羟基磷灰石晶须/纳米氧化锌-纳米氧化钙（HAPw/nmZnO-nmCaO）复合材料[7]。通过相关实验得出纳米粒子表面改性的理想条件，即在弱酸环境下，反应的理想温度为70 ℃等关键改性步骤；同时研究得出HAPw/nmZnO-nmCaO 复合材料具备良好的抗菌及成骨性能。因羟基磷灰石晶须（HAPw）无多孔结构，本实验拟利用珊瑚羟基磷灰石为原材料，研制出一种兼具多孔、抗菌及成骨性能的珊瑚羟基磷灰石/纳米氧化锌（CHA/nmZnO）复合材料，为后期探究CHA/nmZnO 复合材料的抗菌及成骨性能奠定基础，为研制新型抗菌人工骨修复材料提供相关理论基础及实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
珊瑚羟基磷灰石（CHA，昆明理工大学生物工程材料实验室自制）；磷酸氢二铵（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）；硝酸锌（分析纯，国药集团试剂有限公司）；聚乙二醇-6000（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；无水乙醇（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）；氨水（分析纯，天津市化学试剂厂）；冰乙酸（分析纯，重庆化工集团有限公司）。
1.2 仪器与设备
S&B电子天平（FA2004，上海海康电子仪表厂）；超声波清洗机（CQ250，中船七院七二六所）；磁力搅拌机（CJ78-1，杭州富华仪器公司）；恒温水浴锅（B-220，上海亚荣生化仪表厂）：旋转蒸发仪（RE-52CS，上海亚荣生化仪表厂）；数显恒流泵（HL-BB，上海泸西分析仪器厂）；箱式电阻炉（sRJX-1-2，沪南实验仪器厂）；数显鼓风干燥箱（101A-1，上海市实验仪器总厂）。
1.3 实验方法
1.3.1 制备CHA/nmZnO复合材料 将天然珊瑚清洗消毒及研磨过筛后得到珊瑚颗粒，根据水热反应原理，利用特殊高温高压反应釜制备CHA 颗粒。
将硝酸锌和聚乙二醇-6000（PEG-6000）经70 ℃水浴条件下溶于0.25 L无水乙醇中，得到澄清液。将CHA颗粒置于0.25 L无水乙醇中，在搅拌条件下，将澄清液通过数显恒流泵逐滴加入CHA浸泡液中。利用氨水、冰醋酸调节溶液pH至弱酸环境，经70 ℃恒温水浴反应后进行超声分散，继续升温至溶剂蒸干，随后放置于干燥箱内完全干燥，将所得材料进行热处理，得到CHA/nmZnO 复合材料。
1.3.2 实验分组 以场发射扫描电子显微镜检测结果作为试验指标，采用全面实验设计逐步调整原料配比，最终确定CHA表面抗菌改性的原料配比、热处理温度、热处理保温时间等工艺条件。
将样品按照原料质量配比比例的不同共分为五组，分别为：CHA、硝酸锌和PEG-6 000质量比为：4∶2∶1（G1：第1组）、24∶8∶5（G2：第2组）、24∶4∶5（G3：第3组）、48∶4∶5（G4：第4组）、24∶2∶5（G5：第5组）。
根据同步热分析仪检测结果，对复合材料进行热处理，分别设置保温温度为560 ℃、580 ℃、600 ℃；保温时间分别为1 h、3 h、5 h，共9组。
1.4 测试方法
1.4.1 X-射线衍射仪检测（XRD） 利用X射线衍射仪对被测样品进行检测分析，探究样品改性前后的物相组成变化情况。
1.4.2 扫描电镜仪检测（SEM） 利用SEM对CHA/ nmZnO复合材料进行检测，分析其表面形貌、孔径大小、纳米颗粒粒径、分布等结构特征。
1.4.3 电子能谱分析（EDX） 在SEM检测下，运用X射线光电子能谱仪（K-Alpha+，赛默飞世尔科技有限公司）分析指定区域内样品的元素类别及相对含量。
1.4.4 同步热分析仪检测（TGA） 利用热重分析结果研究该复合材料的分解温度等特征，探究复合材料热处理时保温温度及保温时间等关键工艺条件。
2 结果
2.1 XRD检测结果
通过XRD检测得出样品相关数据，利用Jade 6.5软件分析被测材料的元素组成成分，通过Origin 8.0对分析结果进行绘制图形，得到样品XRD图谱见图1。
由XRD检测图谱可以得出：复合材料主要由碳酸钙构成。氢氧化钙特征峰可能由于复合材料经过热处理后，部分碳酸钙变性形成氧化钙，与
18昆明医科大学学报第 42 卷
空气中的水分发生化学反应所致。同时样品存在HAP 特征峰，表明天然珊瑚经过水热反应后，表面珊瑚碳酸盐成分转化为羟基磷灰石。样品中还存在ZnO 特征峰，证明利用溶胶-凝胶法对CHA 进行表面改性后得到的复合材料中含有ZnO 成分。
2.2 SEM 检测结果
各组材料的SEM 检测结果见图2，根据SEM 检测结果可知，G4（第四组）中复合材料表面的nmZnO 颗粒分布均匀，粒径理想，材料的多孔结构未被破坏，纳米颗粒熔附的情况较理想。
2.3 EDX 检测结果
对照组与G3-G5组的EDX 检测结果见图3，EDX 测试结果表明CHA/nmZnO 复合材料是由Zn、Ca、O、P、C 五种元素构成，结果证实复合材料表面的纳米颗粒为nmZnO 颗粒。Pt 元素的出现可能由于材料表面进行喷铂处理后所致。2.4 TGA 检测结果
CHA 颗粒样品在空气气氛内以10 ℃/min 的升温速率升温至900 ℃后，得到测试样品的热失重曲线（TG 曲线）、差示扫描量热曲线（DSC 曲线）和热失重微分曲线（DTG 曲线）见图4。
由TG 曲线可得出，CHA 颗粒在632.15 ℃时开始产生重量变化，样品在780.26 ℃时失重最明显，807.65 ℃时完成失重反应过程，总失重率为40.22%，DTG 曲线结果与TG 曲线结果一致。由此得出复合材料的热处理温度应控制在632.15 ℃以下进行。
2.5 CHA/nmZnO 热处理后结果
将混合凝胶材料进行热处理实验，设置电阻炉工作程序为：升温速率2 ℃/min，按照实验设计设置保温温度及保温时间，热处理后大体观察材料表面颜色、质地情况见表1。
根据实验结果可知：随着保温温度及保温时间的增加，除碳效果越理想，但材料的强度越差，最终导致材料的多孔结构被破坏。CHA/nmZnO 复合材料的最优热处理条件为：升温速率以2 ℃/min 升温至5
80 ℃，保温时间为5 h 时，材料的除碳效果及机械强度均较为理想，原有结构未发生破坏。
3 讨论
在传统的感染性骨缺损治疗中，通常采用清创术结合抗生素来进行治疗，但由于创伤部位血
CaCO 3HAP Ca(OH)2ZnO
10008006004002000
20
40
6080
2θ (degree)
图 1 CHA/nmZnO 复合材料的XRD 图谱Fig. 1 XRD patterns of the CHA/nmZnO
G0
G1
2 μm
G2
G3
G4
G5
图 2 G0-G5组SEM 图片Fig. 2 SEM images of G0-G5 group
G0：未经改性的CHA，SEM 图片（×20 000）；G1：SEM 图片（×10 000）；G2：SEM 图片（×20 000）；G3：SEM 图片（×30 000）；G4：SEM 图片（×30 000）；G5：SEM 图片（×40 000）。
第 1 期
常加贺， 等．珊瑚羟基磷灰石表面改性的工艺
19
供条件差，口服或静脉注射抗生素等方式在感染部位难以维持有效的抗菌浓度[8]，愈后效果往往不佳。目前，常见的抗菌性骨修复材料是将抗生
素加载于人工骨材料上，从而具备抗菌效果[9−10]，但近几年超级细菌的报道也愈发频繁[11]，因此限制了该材料的发展。耐药菌株的形成有诸多原
Cursor=
Vert=574Window .005−40.955=17 999 cnt
Cursor=
Vert=446Window .005−40.955=19 398 cnt
5101520 keV
Cursor=
Vert=239Window .005−40.955=13 329 cnt
5101520 keV
5101520 keV
Cursor=
Vert=807Window .005−40.955=37 281 cnt
5101520 keV
A
C B
D
图 3 EDX 分析结果Fig. 3 EDX analysis results
A：G0组（CHA 对照组）EDX 测试结果；B：G3组EDX 测试结果；C：G4组EDX 测试结果；D：G5组EDX 测试结果。
m g
m w
m g ·m i n −1
89765
TG curve
Sample name: CHA, 10.09.2019 04:26:05Sample weight: 8.9601 mg
Method:25.0..900 °C , 10 K/min, Air 50 ml/min Sample holder: alumina 70 ul
Step −1.89 % −0.17 mg
Step −38.32 %
−3.43 mg Residue 59.78 %
5.36 mg
DTG curve
DSC curve 0
−10−20
−30−0.20−0.4
Integral Normalized Ont Peak Endt
Integral Normalized Ont Peak Endt
−124 mJ −17.19 Jg 298.70 °C 308.69 °C 329.08 °C
−26.20e+03 mJ −2923.75 Jg 632.15 °C 780.26 °C 807.65 °C
50100150200250300350400
450
500
550
600
650
700
750
800
8500
5101520253035
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85°C min
50100150
200
250
300350
400
450500
550600
650
700
750
800
8500
5
10
15
20253035
40455055
60
65
70
75
80
85°C min
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
510152025303540455055606570758085°C min
CHA
图 4 CHA 复合材料TGA 检测结果Fig. 4 TGA analysis results of the CHA
表 1 复合材料热处理后情况
Tab. 1 Changes of composites after heat treatment
保温温度（℃）保温1 h
保温3 h
保温5 h
560色黑，原结构未破坏色灰黑，原结构未破坏色灰白，原结构未破坏580色灰，原结构未破坏色灰白，原结构未破坏色白，原结构未破坏600
色灰白，原结构未破坏
色白黄，原结构未破坏
色白，原结构破坏
20
昆明医科大学学报
第 42 卷
因[12]：如临床工作中滥用抗生素及联合用药不当[13]、细菌自身突变、细菌分泌的蛋白质形成生物膜、耐药质粒的影响及细菌的外排作用等[14]。相比于抗生素，无机抑菌剂的优势更为明显，无机抑菌剂安全性高，抗菌作用广谱且持久，不产生耐药性。无机抗菌剂一般为光催化型半导体抗菌材料与抗菌活性金属及其氧化物[15]，前者因光催化条件限制其应用范围，所以后者得到研究者广泛的关注。其中，纳米氧化锌的原材料来源丰富、价格较低、对生态环境无毒害，其较强的量子尺寸效应、宽禁带、紫外吸收、抗菌性能优异等特点，在抗菌材料领域备受关注。
珊瑚羟基磷灰石是天然珊瑚经过“水热反应”，将表面碳酸钙置换为羟基磷灰石[16]的复合材料，该材料不仅具备羟基磷灰石良好的生物相容性及骨引导性，同时也提升了天然珊瑚的机械强度并保留了珊瑚原有的多孔结构，有利于新生骨组织的生长。有大量文献表明珊瑚羟基磷灰石有助于骨和软组织的长
入及珊瑚内骨重建[17−18]，其降解速率也可通过调整“水热反应”条件，改变羟基磷灰石转化率实现人为控制[19]。珊瑚羟基磷灰石相比于其他骨移植材料有诸多优势。较自体骨移植而言，利用珊瑚羟基磷灰石材料进行骨缺损修复时无需从健康部位取骨，避免开辟第二术区，减少术区出现感染、出血等术后并发症，减轻患者痛苦，同时降低了手术过程中存在的潜在风险，增加植骨手术的成功率。较同种异体骨移植而言，CHA人工骨材料有效的避免了机体产生排异反应和潜在的疫病传播等风险。较人工合成羟基磷灰石而言，羟基磷灰石不具备多孔结构，无法为新生骨组织、血管提供理想的三维生长空间，从而不利于骨组织的生长，并且存在抗力性能不足、机械强度较差等问题。近年来CHA人工骨在口腔颌面部骨缺损的治疗中得到广泛应用[20]。
本实验的关键步骤结论与课题组前期结果一致[21]，制备所得的CHA/nmZnO复合人工骨材料，是将具有多孔结构、生物相容性较好的珊瑚羟基磷灰石与纳米级无机金属氧化物结合的新型抗菌生物材料，使CHA人工骨材料具有抗菌效果。有研究表明纳米氧化锌具有持久且广谱的抗菌性能[22]，是无机抗菌材料中研究的热点。同时CHA人工骨材料在降解的过程中释放的钙离子有利于成骨细胞的生长增殖[23−24]；CHA降解产物中的磷酸根离子不仅有利于生物矿化，而且是成骨细胞分化蛋白生成与基因表达的一种信号分子[25]。课题组下一步将针对CHA/nmZnO复合材料的抗菌及成骨性能进行相关实验探究。
通过利用溶胶-凝胶法对珊瑚骨羟基磷灰石进行表面改性的各项实验条件，可以得出以下结论：（1）
利用溶胶-凝胶法可以对CHA颗粒进行表面改性，扫描电子显微镜下能观察到均匀分布的球状纳米ZnO颗粒；（2）利用溶胶-凝胶法对CHA颗粒改性的最佳条件为：调节pH值至弱酸条件下，反应温度70 ℃，CHA、硝酸锌和PEG-6 000质量比为48∶4∶5；（3）材料热处理的理想工艺条件是以2 ℃/min匀速升温条件下，设置保温温度为580 ℃，保温时间5 h。
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