介孔羟基磷灰石纳米粒子的制备及作为蛋白类缓释药物载体的应用
何晓梅;古莉娜
【摘 要】Mesoporous hydroxyapatite (HA ) nanoparticles were synthesized via gas‐liquid chemical precipitation combining with hydrothermal method .And the structure ,morphology and pore size distribution of HA were obrved and measured using the X‐ray powder diffraction (XRD ) , transmission electron microscopy (TEM ) , Brunauer‐Emmett‐Teller ( BET ) , Barret‐Joyner‐Halenda scheme ( BJH ) and Fourier transform infrared spectrophotometer (FT‐IR) .The adsorption isotherms of bovine rum albumin (BSA) on as‐prepared HA at various temperatures were obtained and the corresponding equilibrium data fitted better the Langmuir model better .Meanwhile ,the BSA cumulative relea rate of the BSA‐loaded HA was investigated .The relea rate was different at different pH values due to the effect of charge repulsion .Furthermore ,the vitro relea was in accordance with the Korsmeyer‐Peppas equation and the relea mechanism fitted the non‐Fickian diffusion .%利用气液沉淀和水热法相结合制备介孔羟基磷灰石（HA）纳米粒子，并采用X射线衍射（
XRD）、透射电子显微镜（TEM）、比表面分析（BET）、孔径计算（BJH）、傅里叶红外（FT‐IR）对其进行表征。研究牛血清白蛋白在羟基磷灰石上的等温吸附，通过对等温吸附曲线的拟合，发现该吸附符合Langmuir模型。同时测定了羟基磷灰石‐牛血清白蛋白复合物在不同pH磷酸缓冲液下的体外释放行为，结果表明不同pH下释放率的不同是电荷相斥效应造成的，且体外释放行为符合 Korsmeyer‐Peppas 释放动力学方程，其释放机制符合非Fickian扩散。
【期刊名称】《安徽大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2015(000)002
【总页数】8页(P89-96)
【关键词】纳米材料;羟基磷灰石;牛血清白蛋白;缓释药物
【作 者】何晓梅;古莉娜
【作者单位】安徽大学化学化工学院，安徽合肥 230601;安徽大学化学化工学院，安徽合肥 230601
【正文语种】中 文
【中图分类】O647.31
羟基磷灰石，又称羟磷灰石，是钙磷灰石（Ca5（PO4）3（OH））的自然矿物化.其经常被写成（Ca10（PO4）6（OH）2）的形式以突出它是由两部分组成的：羟基与磷灰石.羟基磷灰石是脊椎动物骨骼和牙齿的主要组成，人的牙釉质中羟基磷灰石的含量在96%以上.羟基磷灰石，由于其独特的性质，从普通的羟基磷灰石到纳米羟基磷灰石一直都是人们研究的热点.纳米羟基磷灰石具有溶解度高、生物相容性好、比表面积大等特点.近年来，制备纳米羟基磷灰石的方法有很多，例如：水热法［1－3］、微乳液法［4－5］、模拟体液法［6－7］、模板法［8－10］、溶胶凝胶法［11－12］、化学沉淀法［13］.其中，水热法具有制备晶粒的尺寸可控、颗粒团聚现象少或无团聚、纯度高、结晶完整等优点，是一种低能耗、低污染的方法，而且粉体质量好，产量也较高.
Ijntema等［14］最先采用共沉淀法将蛋白类药物包裹于纳米晶粒中，成功获得了具有缓释功能的药物释放体系，并进一步研究证明了该体系可有效地控制药物的释放速率.由于纳米HA与蛋白质分子之间具有极好的生物相容性和极高的亲和力，其已被广泛用于蛋白类缓释
药物的缓释载体［15－18］.在药剂学领域，药物缓释系统是重要的研究方向之一；作为药物制剂的前沿领域，药物缓释系统引起了制药工业的广泛关注.
作者结合气液沉淀法和水热法，成功地合成了棒状的介孔HA纳米粒子.以牛血清白蛋白（BSA）为模式蛋白药物，考察了BSA在HA上的吸附行为以及HA－BSA复合物的体外释放行为.结果表明，介孔纳米HA可以作为蛋白药物载体且能实现药物的可控制释放.
1 试验材料和试验方法
1.1 试验材料
牛血清白蛋白（BSA，分子量67 000，等电点4.8）购于上海源聚生物科技有限公司，硝酸钙购于天津市光复精细化工研究所，无水乙醇购于上海振兴化工一厂，磷酸氢二氨购于西陇化工股份有限公司，氨水购于上海博河精细化学品有限公司.上述化学试剂均为分析纯.
1.2 羟基磷灰石的合成
称取2.951 9g四水合硝酸钙和0.990 5g磷酸氢二氨分别溶于50mL无水乙醇及50mL蒸馏水
中.将盛有硝酸钙溶液的小烧杯置于装有100mL氨水的密封大烧杯中，在氨气的作用下，硝酸钙溶液的pH被调节到10.5左右.在这种碱性环境下，边搅拌边缓慢滴加磷酸氢二铵水溶液.滴加完毕后，继续搅拌2h，然后将浑浊液倒入反应釜中，120℃条件下水热24h.用超纯水和无水乙醇多次洗涤产物，60℃下干燥12h，研磨，即得样品.
1.3 羟基磷灰石纳米粒子的表征
采用X射线衍射（XRD，XD－3，CuKα＝1.541 8，北京普析通用仪器有限责任公司）、透射电镜（TEM，JEM－2100，Japan）、比表面分析（BET，ASAP 2020M＋C，U.S.A）、傅立叶红外光谱（FT－IR，NEXUS－870，U.S.A）确定 HA的结构.
1.4 蛋白吸附试验
准确称取20mg羟基磷灰石纳米粒子置于10mL不同浓度的BSA溶液中，在恒温气浴振荡器上振荡10h.高速离心（10 000rpm，18min）后，移出一定量的上清液，用紫外分光光度法（UV－Vis，UVU－4100，Japan）测定上清液中蛋白的含量（选取波长为280nm），从而确定蛋白的吸附量.
1.5 HA－BSA复合物体外释放试验
精密称取30mg羟基磷灰石纳米粒子－牛血清白蛋白复合物，置于37℃不同pH的10mL磷酸缓冲液中振荡.在设定时间下停止振荡，高速离心后取出5mL上清液，用紫外分光光度法测定其蛋白质释放量.同时，向反应容器中补充5mL新鲜的磷酸缓冲液.
2 结果与讨论
2.1 HA的表征
图1为所制备HA的X射线衍射图.
图1 HA粒子X射线衍射图Fig.1 X－ray diffraction（XRD）pattern of HA
从图1可以看出，各衍射峰峰形尖锐，位置和强度均与标准PDF卡片（JCPDS 09－0432）上的HA特征衍射峰吻合，表明该法合成的HA结晶程度很好，产物纯度很高.
样品的透射电镜照片如图2所示.
图2 HA粒子的透射电镜照片Fig.2 Transmission electron microscope（TEM）image of HA
由图2可见，所制得的产物为分散性良好的棒状颗粒，颗粒尺寸比较均匀，长度为100～150nm，宽度约为40nm.另外，HA颗粒上具有明显的介孔结构，介孔的孔径约为4nm.
图3为HA的氮气吸附／脱附等温曲线（a）和BJH孔径分布图（b）.
从HA的氮气吸附／脱附等温曲线中可以看出，曲线具有明显的滞后环，属于典型的IV类等温线，表明样品具有介孔结构.由孔径分布图可以看出HA中的孔主要分布在4nm左右和20～50nm之间.结合电镜照片可以判断出4nm左右的介孔属于颗粒内孔，而20～50nm左右的孔可能是颗粒间孔.根据BET计算，HA的比表面积为87.3m2·g－1，孔体积为0.338cm3·g－1.BET分析结果表明，该样品比表面积较大，具有介孔结构，因此能够用作药物载体，且药物能够进入介孔内，可以有效减少药物突释，延长释放周期.
图3 HA氮气吸附／脱附等温曲线（a）和BJH孔径分布图（b）Fig.3 Nitrogen adsorption／desorption isotherm（a）and the distribution of pore diameters（b）for HA by BJH model
图4是BSA、HA及HA－BSA复合物的红外光谱图.
图4 BSA（a）、HA（b）、HA－BSA（c）复合物的红外光谱Fig.4 Fourier transform infrared spectra of BSA（a），HA（b），HA－BSA（c）composite
图4中曲线a为牛血清蛋白的红外图谱，其中1 660～1 650cm－1归属于N—H特征峰，而1 670 cm－1属于特征峰；曲线b为羟基磷灰石的红外图谱，其中3 571cm－1和1 634cm－1属于OH－1特征峰，而565、603、1 039、1 099cm－1归属于PO43－特征峰；曲线c中同时出现了牛血清蛋白和羟基磷灰石的特征峰，因此可以确定牛血清蛋白确实吸附在羟基磷灰石上，形成了HA－BSA复合物.
2.2 等温吸附曲线和吸附机理
图5为BSA在HA上的等温吸附曲线，BSA在HA上的吸附量可通过吸附前后的BSA浓度变化来获得.
在图5的等温吸附线上，吸附量逐渐趋向于一个极值，说明HA和BSA之间存在着吸附平衡.300、305、310K条件下的饱和吸附量分别为120、130、140mg·g－1.其吸附量大于Nagata等［19］水热合成的HA纳米颗粒（最大比表面积为120.8m2·g－1，对BSA的最大
吸附量为1mg·m－2，吸附量可换算成120.8m2·g－1）；小于Zhao等［20］合成的由纳米片（＜50nm）组成的具有立体、分层纳米结构的花瓣状微米级 HA（尺寸在1～3μm，比表面积为54.4m2·g－1，对BSA的吸附量为165mg·g－1）.
图5 BSA在HA上的等温吸附曲线Fig.5 Adsorption isotherms of BSA on HA
由于固体在溶液中的吸附是一个复杂的过程，受到固体与溶质、固体与溶剂、溶质与溶剂等相互作用的影响，因此固体吸附理论并不完整，固体在溶液中的吸附经常使用气体吸附模型进行表征，其中最常用的是Langmuir模型和Freundlich模型.公式（1）、（2）分别是Langmuir模型和Freundlich模型的线性表达形式.
Langmuir模型
Freundlich模型
其中：qe为 HA对BSA的平衡吸附量：μg·mg－1；ce为BSA溶液的平衡浓度：mg·mL－1；qmax为 HA对BSA的饱和吸附量：μg·mg－1；k为吸附系数；n为常数.分别用Langmuir模型和Freundlich模型对上述吸附数据进行拟合，结果如图6、7所示.由两图中的拟合结果
可知，HA对BSA的吸附更符合Langmuir吸附模型，这也与吸附等温线的变化趋势一致.
