陶瓷羟基磷灰石（CHT）原理与技术
一、分离机理：羟基磷灰石具有独特的分离机理，是唯一直接用于蛋白质和核酸纯化的无机层析填料，高度耐碱，生
物安全性最高。其中PO43－离子与带正电的蛋白质以离子键结合，具有离子交换特性，可由NaCl浓度梯度或磷酸钠浓度梯度 洗脱，其中的Ca2＋离子与带负电蛋白质的自由羧基以金属螯合方式结合，该结合方式对NaCl不敏感，可由磷酸钠浓度梯度 洗脱。因此该填料既可以用磷酸钠单梯度洗脱，也可以采用NaCl梯度洗脱后以低浓度磷酸钠缓冲液平衡，再以磷酸钠浓度 梯度洗脱的双梯度洗脱模型，以达到更高的分辨率。
二、羟基磷灰石类型选择：羟基磷灰石因陶瓷化工艺不同分为 2 种类型：I 型和 II 型，I 型对蛋白质具有更大的保
留，对普通蛋白质具有更大的动态载量，主要纯化大部分蛋白质（分子量一般在 100kd 一下） 型由于孔径较 I 型大，因 ；II 而对抗体和部分重组疫苗等大分子量蛋白质的动态载量更高，而对 HSA 几乎无保留，因而更适合于抗体的纯化，同时 II 型 对核酸具有更大的保留，能够分辩单、双链、是否超螺旋等各种高级结构的核酸，因而也适合纯化核酸。
三、 羟基磷灰石的分离策略： 由于羟基磷灰石层析的上样对 NaCl 不敏感， 更适合作为中间纯化和精纯的常规步骤，
经第一步离子交换捕获得到的样品不需作任何脱盐处理即可直接上样纯化， 具有更高的分辨率。 因此， 陶瓷羟基磷灰石 （CHT） 更多的是用于蛋白质分离纯化的中间步骤，一般第一步用离子交换或亲和捕获得到的组分即可直接上样到 CHT 层析柱上， 可进行高分辨率的分离，获得高纯度的组分。 层析条件的摸索参数主要有：型号，磷酸盐缓冲液的不同 pH，单梯度，双梯度等等。
双梯度洗脱模型
不同类型 CHT 陶瓷羟基磷灰石在不同 pH 下不同蛋白质的保留时间（min）
四、CHT 羟基磷灰石层析初始条件设定与条件摸索
羟基磷灰石最常用的缓冲液是磷酸钠缓冲液，也可用磷酸钾缓冲液，所有梯度洗脱体积一般为 10－20 个柱床体积，一 般起始条件如下： 1、 单梯度洗脱： 平衡液（A 液） ：5mM PB， pH 条件摸索：6.0、6.5、 7.0、7.5、8.0 或以上 洗脱液（B 液） ：400mM PB，
梯度一般为 0——30％B、50％B、70％B、100％B 等。 可在单梯度缓冲液（A 液和 B 液）中加入低浓度 NaCl 已优化分离效果，主要作用是用 Na 离子封闭 CHT 骨架上 的磷酸根离子， 避免带负电蛋
白质与骨架上的磷酸根离子排斥而影响载量， 所以加入一定浓度的 NaCl 有利于提高 带负电蛋白质在 CHT 上的载量，一般加入到 20－50mM 的 NaCl。 2、双梯度洗脱： 平衡液（A 液） ：5mM PB， pH 7.0、7.5、8.0 洗脱液 I（BI 液） 液含 1M NaCl，梯度可从 0——50％B， ：A 洗脱液 II（BII 液） ：400mM PB，梯度一般为 0——30％B、50％B、70％B、100％B 等 3、CHT 的再生和清洗： CHT 是唯一用于蛋白质纯化的无机填料，所以高度耐碱，一般的再生和清洗方法如下： 再生：500mM 磷酸钠缓冲液或 400mM 磷酸三钠溶液，3－5CV，重新平衡即可。 在位清洗和消毒：1－2M NaOH 或 KOH 溶液，3－5CV 在位清洗。 保存：0.1-1M NaOH 或 20％乙醇，可在位长期保存。
五、应用实例
1、CHT-I 纯化重组 α1-抗胰蛋白酶（α1-AT）
图 1 CHT-I 柱纯化 α1-AT。柱尺寸：7×52mm(10ml)；上样量：5.0ml；Buffer A：10mM 磷酸钠缓冲液（pH7.0） ；Buffer B： 400mM 磷酸钠缓冲液（pH7.0） ；梯度：0-5%B 和 5-30%B 各 5 个柱体积，30-100%B 10 个柱体积；流速：2.5 ml/min。分部收 集组分为 1.5ml，收集如下：收集组分 I-VIII 分别为：运行组分（图上方轴）12-17、23-24、42-49、49-50、51-53、54-58、 69-71 和 74-77。绿条框指示为 α1-AT 洗脱液。
图 2 图 1 中收集组分的 SDS-PAGE 结果。泳道 1：标准（从上到下，203、118、86、51.6、34.1、2
9、19.2、7.5kD） ；泳道 2： 上样液； 泳道 3-10： 分别为图 1 中之收集组分 I-VIII 蛋白迁移位置用标准确定 （未示） 分离胶为 15%丙烯酰胺， ， Coomassie 亮蓝 R-250 染色
