第49卷第8期2021年4月
广州化工
Guangzhou Chemical Industry
Vol. 49 No. 8
Apr. 2021
永州丹参中丹参酮n a 含量测定及提取工艺优化*
*基金项目：科技特派员创新创业项目（No. 2019NK4153） o
通讯作者：陈小明，男，硕士，副教授，研究方向：药物新技术、新工艺、新制剂。
马欣然打苏伟康打靳琦打何勇辉打陈小明®
（1湖南科技学院化学与生物工程学院，湖南 永州425100 ； 2湖南科技学院湖南省银杏工程技术研究中心，
湖南永州425100 ； 3湖南恒伟药业股份彳限公司，湖南永州425100）
摘 要：用乙醇回流提取法以丹参中丹参酮UA 含量为指标优化提取工艺。在单因素实验的基础上，对温度、料液比、浸 泡时间、回流时间4个因素按照1^（3"）正交表进行正交试验。再将所得供试品用高效液相色谱进行测定。研究发现，丹参中丹参
酮HA 的最佳提取条件为温度70 °C 、料液比1:8、浸泡时间0. 5 h 、回流时间2 h，且根据峰面积得出丹参酮HA 含量2.010 mg/g 。结 果表明，高效液相色谱是测定丹参中丹参酮HA 含量科学、简洁、准确、有效的检测方法。
关键词：丹参；丹参酮HA ；乙醇回流提取法；正交实验法；HPLC 中图分类号：R284.2
文献标志码：B
文章编号：1001 -9677（2021）08-089-04
Determination and Optimization of Tanshinone U A Content of
Salvia Miltiorrhiza in Yongzhou *
MA Xin-ran 1, SU Wei-kang 1, JIN Qi 1, HE Yong-hui 1, CHEN Xiao-ming®
（1 School of Chemistry and Bioengineering , Hunan University of Science and Engineering , Hunan Yongzhou 425100;2 Hunan Provincial Engineering Rearch Center for Ginkgo Folium , Hunan University of Science and Engineering ,Hunan Yongzhou 425100 ； 3 Hunan HENGWEI Pharmaceutical Co. , Ltd. , Hunan Yongzhou 425100, China ）Abstract : The optimum extraction process of tanshinone H A in Salvia miltiorrhiza by ethanol reflux extraction was studied. On the basis of single factor experiment , the orthogonal test was carried out according to the orthogonal table of four factors : temperature , ratio of material to liquid , soaking time and reflux time , according to the orthogonal table of four factors and three levels. The desired sample was determined by high performance liquid chromatography ( HPLC ). The results showed that the optimum extraction conditions of tanshinone R A in Salvia miltiorrhiza were as follows : temperature was 70 °C , material-liquid ratio was 1 ： 8, soaking time was 1 h , reflux time was 2 h. According to the peak area , the content of tanshinone U A was obtained 2.010 mg/g. This experiment showed that high performance liquid chromatography was a scientific , simple , accurate and effective method for the determination of tanshinone in Salvia miltiorrhiza.
Key words : Salvia miltiorrhiza Bge ； tanshinone H A ； ethanol reflux extraction ； orthogonal experiment method ； high performance liquid chromatography
丹参主要用于治疗用于胸痹心痛，皖腹胁痛，症痕积聚， 热痹疼痛，心烦不眠，月经不调以及痛经经闭，古有“一味丹 参散，功同四物汤”之说⑷。其有效成分为脂溶性成分和水溶 性成分，而丹参酮HA 在脂溶性成分中占主要成分。丹参的抗
癌活性成分主要为丹参酮nA 和隐丹参酮，其中丹参酮H A 的 抗癌机制具体表现为以下几个方面：（1）抑制癌细胞生长和增 殖；（2）诱导细胞调亡；（3）诱导癌细胞周期阻滞；（4）抑制癌 细胞入侵，迁移和转移a"。丹参酮是一类从丹参及其相关物
种中分离出来的松香烷型二话类化合物，从结构上看，它们均 有四个环组成，包括四氢茶环A 和B，邻或对醞，内酯环C 以 及咲喃环或二氢咲喃环D，目前已经分离出的丹参酮及其类似 物累计多达40余种3〕。丹参中丹参酮提取，传统提取工艺主
要包括浸渍法、渗漉法、水蒸气蒸憎法、有机溶剂回流提取及 连续回流提取法〔45。总体而言，传统提取工艺普遍具有成本
低廉，操作简单，设备要求低，然而杂质含量也相对偏高。超 临界流体CO?萃取技术具有操作便捷，提取效率高，清洁环保 等优点「珂。与常规方法相比，分离效率高，分析时间短，分离 度极高，重复性好，为以后实验以及开发利用提供依据，同时 为丹参提取物质量标准的提高提供参考依据。
1仪器与试剂
Agilent 1200高效液相色谱系统，美国安捷伦科技公司；
RE-201D 旋转蒸发仪，长沙太康仪器设备有限公司；HH-4S
90
广州化工2021年4月
电热恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司；SHB-m 循环水 式多用真空泵，郑州长盛实验仪器有限公司；电热鼓风干燥 箱，上海一恒科学仪器有限公司；分析天平，上海舜宇恒平科 学仪器有限公司。
永州丹参，恒伟药业；丹参酮U A 对照品；乙睛为色谱 纯，0. 02%磷酸；乙醇；其他试剂为分析纯。
2方法与结果
2. 1实验样品的处理
药材丹参来自恒伟药业，丹参经过洗净之后放入电热鼓风 干燥箱，调节温度至60弋（由于丹参酮属热不稳定物质，其大 部分在高温下易分解），烘干取出。然后将其用粉碎机进行粉 碎，3号筛过滤，装入密封袋中放置阴凉处。
2.2实验溶剂的配置
2. 2.1对照品溶液的制备
取丹参酮UA 对照品适量，精密称定，放置棕色量瓶中， 加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，即得。2. 2.2供试品溶液的制备
取本品粉末约0.3 g，精密称定，放置锥形瓶中，精密加 入甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率140 W，频率 42 kHz ）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量， 摇匀，滤过，取上清液，即得。2. 2.3标准待测溶液的配制
标准待测溶液的配制主要是采用定量而变溶剂的体积达到 稀释而不同浓度。具体步骤是用移液管精密量取对照品溶液1. 00 mL, 2. 00 mL 、3. 00 mL, 4. 00 mL, 5. 00 mL，然后用移液 管分别加入一定量的甲醇，经0.45 nm 微孔滤膜过滤，就分别 配制成了 浓度为 0. 20 mg/mL 、0. 40 mg/mL 、0. 60 mg/mL 、 0. 80 mg/mL 、1. 00 mg/mL 的标准品待测溶液。2. 2.4高效液相流动相的配制
本实验以乙睛-0.02%磷酸（61 : 39）为流动相；检测波长 为 270 nm o
2.3标准曲线的绘制
表1加样回收实验结果
Table 1 Experimental results of sample recovery
成分样品量/g
丹参酮UA 含量/mg
加入量/mg
测得量/mg
回收率/%
平均回收率/%
RSD/%
5.00110. 152 1.00011. 12997.7
5.002
10. 354
1.00011.344
99.0
丹参酮n
a
5.0019. 502 1.00010. 4849& 29& 620. 663
5.003
10. 206
1.00011. 19598.95.0059.910
1.000
10. 903
99.3
2.5提取方法
精确称取丹参粉末10 g，置于圆底烧瓶内，依据实验要求 按照一定料液比加入95%乙醇，进行一定时间的浸泡处理，置 于恒温水浴锅，一定温度下加热回流提取1次，药液经抽滤除 去固态杂质，得到供试品溶液，用高效液相色谱测出峰面积, 通过峰面积计算丹参酮n a 的含量。按下列公式计算丹参酮n
A 含量；
AxcxV
A^mXlO 3
xf
式中：X 代表供试品丹参酮UA 的含量，mg/g ； A 代表供试
用移液管精密量取对照品溶液1.00 mL 、2.00 mL 、3.00 mL 、 4.00mL 、5. 00 mL，然后用移液管分别加入一定量的甲醇，用 0. 45 nm 微孔滤膜过滤，分别配制成浓度为0. 20 mg/mL 、 0. 40 mg/mL 、0. 60 mg/mL 、0. 80 mg/mL 、1. 00 mg/mL 的标准 品，每次进样10 piL，经过液相分析得出峰面积。以丹参酮U A 的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归分析。Y 二 77486X-5716. 3, R 2 = 0. 9999，说明丹参酮U A 的浓度与峰面 积在0. 20〜1. 00 m^mL 范围内呈良好线性关系。
80000
6000040000
彗 20000
°0
0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
丹参酮II A 浓度/（mg/mL ）
图1标准曲线
Fig. 1 Standard curves
2.4精密度实验
精密吸取同一浓度丹参酮U A 对照品（1 mg/mL ），平行进 样分析5次，记录峰面积。结果，丹参酮UA 峰面积的RSD 为 0. 28%（n = 5），表明仪器具有良好的精密度。2. 4.1稳定性实验
选同一批且相同溶度供试品分别于0、1、2、4、8 h 进样 分析3次，记录峰面积。结果，丹参酮UA 峰面积的RSD 为1. 86% （n 二5），表明供试品溶液在室温下放置24 h 内稳定性良 好。
2. 4.2加样回收实验
分别精密称取已知丹参酮UA 含量的丹参粉末分别为5. 01 g 、 5. 02 g 、5. 01 名、5. 03 g 、5. 05 g
的 5 份，分别置于 250 mL 锥形 瓶中，精密加入质量浓度为1 mg/mL 标准品1.00 mL，按照 “2.2.2”中的供试品溶液配制的方法配制供试收率。实验结果 如下表所示，以下列公式计算回收率：
加样回收率二（测定量-丹参酮n A 含量）/加入量X100%
品丹参酮UA 峰面积；c 代表丹参酮UA 标准品的浓度，mg/mL ； V 代表最终定容体积，mL ； Al 代表丹参酮U A 标准品的峰面 积；m 代表试样质量，g; f 代表稀释倍数。
2.6设置单因素
设置单因素实验考察温度、料液比、浸泡时间、回流时间 对乙醇回流提取法从丹参中提取丹参酮n a 的工艺条件。
2. 6.1浸泡时间对含量的影响
称取丹参粉末10 g，加入95%乙醇，按料液比（m 原料: v 溶剂）1 : 10，分别浸泡的时间为0、0.5 h 、1 h 、1.5 h 、2 h, 置于恒温水浴锅，70弋水浴回流1 h，分别计算不同浸泡时间
第49卷第8期马欣然，等：永州丹参中丹参酮UA含量测定及提取工艺优化91
下的丹参中丹参酮U A含量。结果，丹参中丹参酮主要集中在其表皮部分，将其浸泡于乙醇中，粉末状态使其表面积增大，可使其中丹参酮UA于乙醇充分接触，溶解扩散于乙醇中。浸泡时间的增加，丹参酮UA含量逐渐上升，浸泡时间越长，其与乙醇接触越充分，含量也逐渐提高，正交实验选择浸泡时间为1〜2h。浸泡时间对含量的影响见图2O
00.51 1.52
浸泡时间/h
图2浸泡时间对含量的影响
Fig.2Effect of soaking time on the content
2.6.2料液比对含量的影响
称取丹参粉末10g，加入95%乙醇，分别按料液比(ni原料: v溶剂)1：6、1：8、1：10、1：12、1：14，浸泡时间1h，置于恒温水浴锅，70弋水浴回流1h，分别计算在不同料液比下的丹参中丹参酮U A含量。结果，料液比从1：6增加至1：10，丹参中丹参酮UA含量逐渐提高，继续增加料液比，丹参中丹参酮U A含量反而有所下降，增加料液比可以提高有效成分的扩散速度，有助于丹参中丹参酮UA从基质中溶出。其下降可能是因为料液比过大，导致样品中一些非丹参酮类化合物溶解度增大，与丹参
酮UA竞争性溶出，从而干扰丹参酮UA的含量，使其含量下降。考虑到提取浓缩所需能量的消耗，正交实验选择料液比范围为1：8〜1：12。料液比对含量的影响见图3。
2.0
3 1.5
g 1.0
0.5
0.0
1:61:81:101:12 1:14
料液比/(g:mL)
图3料液比对含量的影响
Fig.3Effect of material liquid ratio on the content
2.6.3回流时间对含量的影响
回流时间/h
图4回流时间对含量的影响
Fig.4Effect of reflux time on the content
称取丹参粉末10g，加入95%乙醇，按料液比(m原料: v溶剂)1:10，分别浸泡时间1h，置于恒温水浴锅，分别进行70乞水浴回流0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，分别计算不同回流时间的丹参中丹参酮n a含量并研究该条件对含量的影响。结果，丹参酮u a的含量与回流时间呈负相关关系。随着回流时间的增加，含量逐渐下降，因为回流时间太长会导致丹参酮UA的部分分解。因此选用合适的回流时间对含量的影响，正交实验选择回流时间0.5〜1.5h。回流时间对含量的影响见图4。
2.6.4反应温度对含量的影响
称取丹参粉末10g，加入95%乙醇，按料液比(in原料: v溶剂)1:10，浸泡时间1h，置于恒温水浴锅，分别进行60弋、65瓦、70弋、75弋、80弋水浴回流1h，分别计算在不同温度下的丹参中丹参酮UA含量的影响。结果，随着反应温度的升高，丹参酮U A含量呈先增加后减少的趋势，反应温度过高，丹参酮UA含量逐渐下降，其一是因为丹参酮U A属于热不稳定物质，大部分在高温下易分解；其二是因为温度过高时接近乙醇沸点，可能乙醇汽化导致含量下降。因此，正交实验选择温度范围为65〜75P。反应温度对含量的影响见图5O
图5反应温度对含量的影响
Fig.5Effect of reaction temperature on the content
2.7正交试验
表2正交试验因素水平表
Table2Factor level table of orthogonal test 水平
因素
料液比温度代浸泡时间/h回流时间/h 11:865 1.00.5
21:1070 1.5 1.0
31:1275 2.0 1.5
表3正交试验设计及结果
Table3Orthogonal experiment design and result
实验序号
(A)
料液比
(B)
温度/*
(C)
浸泡
时间/h
(D)
回流
时间/h
丹参酮n a
含量/(mg/g) 11111 1.831
21222 1.953
31333 2.005
42123 1.782
52231 1.894
62312 1.94
73132 1.682
83213 2.009
93321 1.847
K1 1.93 1.765 1.927 1.857
K2 1.872 1.952 1.861 1.858
K3 1.846 1.931 1.86 1.932
R0.0840.1870.0670.075
为了进一步的得到丹参酮UA的最佳制备工艺，根据单因素考察结果及参考文献，采取三水平四因素的正交试验如表2所示，以丹参酮U A的萃取率为指标，对浸泡时间，料液比,
92广州化工2021年4月
回流时间，反应温度进行进一步分析。得出结果如表3、表4所示。
表4方差分析
Table4Variance analysis
因素离差平方和自由度F比F临界值显著性
A0.0112 1.222 3.110
B0.06327.000 3.110*
C0.0092 1.000 3.110
D0.0112 1.222 3.110
误差0.01
由表4可知，4个因素的极差分析结果为R b>R a>R d>R c，即影响丹参中丹参酮HA含量效果的因素依次为：反应温度〉料液比〉回流时间〉浸泡时间，最佳实验因素组合为
即最佳工艺条件为料液比为1:8、反应温度为70七、浸泡时间为0.5h、回流时间为1.5h0由表4可知，反应温度对实验结果具有显著性影响，而料液比、回流时间、浸泡时间等因素对实验结果影响均不显著。
3结论
经过对丹参酮口A的提取工艺的研究，得出以下结论：
(1)单因素实验：浸泡时间为2h时丹参酮H A的含量最高；料液比为1:10时丹参酮口A的含量最高；回流时间为0.5h时丹参酮n a的含量最高；反应温度为70°c时丹参酮n A的含量最高。
(2)正交试验：当提取条件A1B2C1D3，即料液比为1：8、反应温度为70咒、浸泡时间为0.5h、回流时间为1.5h。丹参酮n A的含量最高，提取含量为2010mg/g。
(3)用乙醇回流提取丹参酮n A是操作比较简单的方法，且成本低，实用。能很好的适用于工业化生产，希望对其工业化扩大提供一定的依据，也能拓展永州丹参市场以及带来一定的经济效应同时为以后生活提供更广泛的利用。
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(上接第48页)
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