土壤微生物数量测定
（一）培养基的制备：
Ⅰ测定微生物总量培养基：
1. 细菌培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基）
牛肉膏Beefextract 5.0g
蛋白胨Peptone 10.0g
NaCI 5.0g
蒸馏水H20 1000m1
PH 7.2~7.4
2. 放线菌培养基 （高氏1号琼脂培养基）
可溶性淀粉 20g
KNO3 1g
K2HPO4 0.5g
MgSO4• 7H2O 0.5g
NaCl 0.05g
FeSO4• 7H2O 0.01g
pH 7.2-7.4
注：配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调pH。
另：倒平板之前，在溶化的培养基中加重铬酸钾溶液，每300mL培养基加3%重铬酸钾1mL(l00ppm)。
3. 真菌培养基（马丁（Martin）-孟加拉红琼脂培养基）
葡萄糖 10.0g
MgSO4.7H2O O.5g
蛋白胨 5.0g
孟加拉红 33.4mg （或者每升加1%溶液3.3mL）
K2HPO4 1g
蒸馏水H20 1000m1
PH 自然(4~5)
注：⑴灭菌前加卡那霉素20μg/ml，或者倒平板之前加链霉素。
⑵倒平板之前加乳酸，每100mL培养基加0.lmL。
以上培养基皆加琼脂15g/L。
Ⅱ测定功能菌所用培养基：
1.亚硝酸细菌培养基（改良的斯蒂芬逊（Stephenson）培养基A）
(NH4)2SO4 2.0g
NaH2PO4 0.25g
MnSO4·4H2O 0.01g
MgSO4·7H2O 0.03g
K2HPO4 0.75g
CaCO3 5.0g
蒸馏水 1000ml
PH 7.2
注：CaCO3最后加，不需要溶解，直接调PH，培养基中有这个成分是为了缓冲pH。因为硝化细菌的生长会产生酸化效应，使得氢离子过剩，到了一定程度硝化作用将无法继续，
所以要碱性物质平衡酸碱。下同。
2.硝酸细菌培养基（改良的斯蒂芬逊（Stephenson）培养基B）
NaH2PO4 0.25g
K2HPO4 0.75g
MgSO4·7H2O 0.03g
MnSO4·4H2O 0.01g
CaCO3 1.0g
Na2CO3 1.0g
NaNO2 1.0g
蒸馏水 1000ml
PH 7.2
3. 反硝化细菌培养基
柠檬酸钠 5.0 g
KNO3 2.0 g
KH2PO4 1.0 g,
K2HPO4 1.0 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
蒸馏水 1000 ml
pH值 7.2~7.5
4.好气性自生固氮菌培养基（改良阿须贝(Ashby)无氮培养基）
苯甲酸钠 1.5 g
K2HPO4 0.2 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
NaCl 0.2 g
CaSO4·2H2O 0.1 g
PH 7.4—7.6
注：在培养基分装入试管时，每管加入一1cm滤纸长条，要露出液面。
5.氨氧化细菌培养基（蛋白胨氨化培养基）
K2HPO4 0.5 g
KH2PO4 0.5 g,
MgSO4·7H2O 0.5 g
蛋白胨 5.0 g
蒸馏水 1000ml
PH 7.0~7.2
6. 好气性纤维素分解菌培养基（依姆歇涅茨基纤维素分解菌培养基）
KH2PO4 1.0 g
FeCl3·6 H2O 0.1 g
MgSO4·7H2O 0.3 g
CaCl2·6H2O 0.1 g
NaCl 0. 1 g
NaNO3 2.5 g
pH 7.2～7．4
注：在培养基分装入试管时，每管加入一1cm滤纸长条，需露出液面。
(二)试剂的配制
1.格里斯试剂（Griess Reagent）第一、第二液：
第一液：将0.5g的对氨基苯磺酸（Sulfanilic Acid）溶于150ml的20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。
第二液：将0.5gα-萘胺（α-naphthylamine）加入50ml蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入150ml的20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。
2. 纳氏试剂
甲液：将20.0g碘化汞和10.0g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。
乙液：将20.0g氢氧化钾溶于100ml水中。
分别配制甲、乙二液，待冷却后混合，放置2天后使用。保存于棕色瓶中。取上清液使用，保存期三周，随着沉淀增加会影响测定结果。
3.二苯胺试剂：
溶1.0g无色的二苯胺（Diphenylamine）于20ml蒸馏水中，然后徐徐加入100ml浓硫酸（相对密度1.84）中，保存于棕色瓶中。
（三）实验器材：
1.仪器设备
4℃冰箱、立式自动电热压力蒸汽灭菌器、恒温培养箱、电子天平、电热恒温水浴锅、超净工作台、微量移液器、全温空气摇床、旋涡混合器、磁力搅拌器、微波炉等。
2.器材准备
⑴将90ml水装入250ml三角瓶中，并装有15-20个玻璃珠，灭菌。
⑵将9ml水装入试管，灭菌。
⑶试管架，1ml无菌吸管，记号笔，白瓷比色板，接种环，酒精灯等。
（四）实验方法：
1.样品采集
在靠近植株根系部, 去除表层0-5cm的表土，采集5~20 cm土壤剖面,多点采集, 混匀后四分法取1 kg, 装无菌塑料袋带回，4℃冰箱保存。
2.悬液制备
称取10g土壤样品，放入盛有90ml无菌水的三角瓶中，置于摇床上室温振荡20min，
使土样与水充分混合，将土壤中的微生物细胞充分分散，从土壤中分离出来。此为10-1土壤悬液，吸取lml此土壤悬液于9ml无菌水中，另用无菌吸管吹吸3次混匀，制成10-2土壤悬液。以此类推依次制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8不同稀释度的土壤悬液。
3.土壤悬液稀释度选择
⑴细菌:10-4~10-6
⑵放线菌：10-3~10-5
⑶真菌：10-2~10-4
以上采用稀释平板法，分别设置三个浓度梯度，二次重复。
⑷亚硝酸细菌：10-3~10-6
⑸硝酸细菌：10-3~10-6
⑹反硝化细菌：10-4~10-7
⑺好气性自生固氮菌：10-3~10-6
⑻氨氧化细菌：10-5~10-8
⑼好气性纤维素分解菌：10-2~10-5
以上采用最大或然法（MPN），分别设置四个浓度梯度，三次重复。
4.接种
⑴液体培养基
将六种功能菌培养基分装于试管中，每管5ml，每个菌需培养基12支试管。按照纵3横4的方阵排列于试管架上，标签示之。
用1ml无菌吸管依次从低浓度到高浓度吸取土壤稀释液，放入各自对应编号的管中。
另取一管培养基接种1ml无菌水作为对照。
⑵琼脂培养基
将细菌、放线菌、真菌琼脂培养基采用混菌法进行接种，每个培养皿接种lml土壤稀释液，二次重复。接种后，倒入15-20ml培养基迅速混匀。
5.培养
将所有试管和平板置于25-28℃黑暗条件下避光培养。培养时间由短到长分别为：
⑴真菌：2～3d；
⑵细菌：3～4d；
⑶放线菌：5～7d。
⑷氨氧化细菌：7～8d；
⑸好气性自生固氮菌：7～8d；
⑹亚硝酸细菌：10～14d；
⑺硝酸细菌：10～14d；
⑻反硝化细菌：10～14d；
⑼好气性纤维素分解菌：10～14d；
6.结果观察
⑴亚硝酸细菌：取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（Griess Reagent）第一、第二液各两滴，如有亚硝酸盐存在，则呈红色。
⑵硝酸细菌：取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（Griess Reagent）第一、第二液各两滴，如不呈红色，表示亚硝酸均已经完全消失。此时，另取培养液5滴于白瓷比色板上，加二苯胺试剂2滴，如呈蓝色，则表示亚硝酸已经被氧化成硝酸，说明有硝酸细菌的存在。
⑶反硝化细菌：加入格利斯亚硝酸试剂，观察颜色变化，确定正负反应。
⑷好气性自生固氮菌：观察试管培养液表面与滤纸接触处有无褐色或黏液状菌膜生成，或有无圆晕混浊出现。
⑸氨氧化细菌：取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入纳氏试剂两滴，如有氨氧化细菌存在，则呈棕色或褐色。
⑹好气性纤维素分解菌：观察滤纸条是否成团，有无黄色或橘黄色菌斑出现及滤纸断裂情况。
