第十九章 精液冷冻及精子库的管理
中南大学生殖与干细胞工程研究所
中信湘雅生殖与遗传专科医院
朱文兵
第一节 精液冷冻
随着生殖工程技术的兴起及发展，供精人工授精（AID）已经成为治疗某些不可恢复或无法治疗的男性不育症的重要疗法，其中，精液冷冻是其中的重要环节，以下就精液冷冻的原理，影响因素、相关步骤及临床应用进行叙述。
一 精液冷冻基本原理
在一定的低温条件下，以一定的时间作用于生物组织细胞，引起细胞的降温、凝固、非损伤性结冰，使生物体内分子运动的速度减慢、停止，从而使细胞代谢降低，处于休眠状态，达到贮存细胞的目的。细胞生活在细胞外液之中，细胞膜将细胞内容物（包括细胞内液）与细
胞外部环境分隔开来，水分可以自由通过细胞膜，水分子从细胞内流向细胞外，或是从细胞外流向细胞内，主要取决于细胞内、外液中溶质浓度差，即溶液渗透压的高低。在细胞冷冻过程中，随着温度不断下降，细胞外液中，作为各种电解质溶剂的水分首先形成细小的颗粒状冰晶，导致细胞外水份减少，电解质浓度增加，细胞外液渗透压升高，使细胞内外液渗透压失去平衡，水分将从渗透压低的内液通过细胞膜流向渗透压高的外液，于是细胞自身脱水皱缩。用冷冻过程中产生的渗透压的梯度使细胞皱缩，而不损伤细胞——这就是细胞冷冻贮存的基本原理。
由于冷冻降温速率的不同，冰晶的形成会造成细胞的损伤，如快速冷冻时，细胞冷冻太快，细胞内液来不及脱水，形成冰晶，破坏细胞内的超微结构称之为快速冷冻损伤；相反，在慢速冷冻时，细胞外液形成大量的冰晶，细胞外液渗透压突然升高，在尚未降到低温贮存温度前，细胞可能会由于过份暴露在高浓度溶质中或细胞严重脱水皱缩而死亡，称之为慢速冷冻损伤。
而冷冻保护剂由于其高水溶性，可保证在冰晶形成过程中，仍停留在溶液中不被析出，从而稀释细胞外液中溶质的浓度，延缓细胞外液的过分减少及浓度增加的时间，使得细胞顺利通过临界温度阶段。
二 影响精液冷冻贮存的主要因素
影响人类精液冷冻贮存的因素主要有：冷冻程序、冷冻保护剂、复苏速率、贮存方式，及冷冻前精液质量等。
1. 冷冻程序
精子在冷冻过程中，经过以下几个阶段，根据不同阶段的损伤程度采用不同的冷冻速度通过该阶段：① 温度休克阶段，室温～5℃ ，此阶段细胞会遭受温度骤变造成的损害，可以1℃/min的速度通过该阶段；② 冰晶潜热阶段，5～－5℃，该阶段中精浆形成冰晶，释放热量，温度升高，应快速通过该阶段；③ 冰晶形成阶段，－5～－15℃；④ 再结晶阶段，－15～－80℃，从－5～－30℃，尤其是－5～－15℃为致死温度范围，细胞内冰晶形成，温度骤变，往往会造成精子死亡，应以5～7℃/min的速度通过该阶段。⑤ 贮存阶段，－80～－196℃。
2. 冷冻保护剂
（1）具备的基本条件：①对被冷冻的细胞无毒性；②具有高水溶性，保证在冰晶形成过程
中不被析出。
（2）种类：①渗入性冷冻保护剂：甘油、DMSO、丙二醇等；②细胞外冷冻保护剂：蔗糖、卵黄等
（3）常用冷冻保护剂配方：
化学物质 | 用量 |
甘油（AR级） | 14ml |
5%葡萄糖溶液 | 26ml |
2.9%枸橼酸鈉溶液 | 39ml |
蛋黄 | 20ml |
1g/L红霉素溶液 | 1ml |
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将左侧的这些溶液依次置于烧瓶中，搅拌均匀，以1mol/LNaHCO3调整PH值为7.2,配制的保护剂总量为100ml.配好后放－20℃保存，使用期 为3个月；4℃冰箱保存，使用期为 1周。
3. 复苏速率
冷冻过程中，精子发生的一系列变化也会表现在解冻时的反向顺序中，而快速复温（100℃/min左右）可避免精液在溶解前的再次形冰晶成，具体步骤为：将贮存于液氮中的精液冷冻管取出，快速放入37℃的水浴箱中复温即可。
4.贮存方式
现在人们多使用液氮来贮存精液，液氮是一种无色、无味的气体，其沸点为－195.8℃。具有低温、不助燃、不自燃、不易爆炸、来源丰富的优点。其缺点为易蒸发、耗损量大，长期贮存精子时，必需定期添加液氮以补充蒸发的损失。而且，液氮气化后，体积会膨大655倍，因此盛放液氮的容器不能密封，以防放生爆炸。
5. 冷冻前精液质量
一般而言，精液冷冻前的的活率及正常形态率越高，冷冻复苏后的精子活动率也越高，同时，由于个体差异的存在，不同人有不同的冷冻效果。
三 精液冷冻步骤
1. 基本仪器设备及材料
程序冷冻仪、超净工作台、相差显微镜、水浴箱、恒温培养箱、冰箱、酒精灯、培养皿、冷冻管、1ml注射器、冷冻保护剂
2. 人类精液快速冷冻步骤
（1）精液取出后，在37℃的水浴箱中液化；
（2）精液液化后按照WHO的标准进行常规分析，包括精液量、颜色、气味、PH值、液化状况、精子密度、活动率、圆细胞数等，并做好相关记录；
（3）镜检时将冷冻保护剂复温至室温；
（4）将精液与冷冻保护剂按1:1的比例混匀，并分装于冷冻管中；
（5）冷冻管做好标记；
（6）将冷冻管置入4℃冰箱15min；
（7）将冷冻管置入－80℃液氮蒸气中15min；
（8）将冷冻管投入液氮中冻存。
3. 人类精液程序冷冻步骤
前（1）-（5）步骤同快速冷冻一致。
（6）将冷冻管置于程序冷冻仪中，开始程序冷冻。冷冻程序如下
1）开始温度：20℃并平衡5--10分钟；2）20℃→0℃，冷冻速率-1℃/min；3）0℃→-30℃，冷冻速率-6℃/min；4）-30℃→-80℃，冷冻速率-30℃/min
（7）从程序冷冻仪中取出冷冻管，投入液氮中冻存
四 精液冷冻技术在人类辅助生殖技术中的应用
1. 应用于供精者精液的冻存，精液冻存是AID技术开展的重要基础。
2. 用于IVF-ET，对于排精困难的男性，可提前将精液冻存，便于医患双方掌握治疗进展，
以防出现女方一切准备就绪而男方排不出精液的状况。
3. 用于ICSI，并不是每次睾丸或附睾穿刺都能得到精子，因此睾丸附睾精子的冷冻将会避免反复穿刺造成组织损伤，使得ICSI的顺利进行。
4. 用于生殖保险，对于采取绝育手术的患者，如必须进行睾丸切除、附睾手术、影响性功能的手术前，肿瘤病人采取放疗、化疗术前或从事有可能会影响生育力的工作前均可将其精液冷冻贮存，保留生育能力，用于以后的AIH治疗。
第二节 精子库的管理
人类精子库又称为精子银行，是将精子进行低温储存以备将来生育后代所需，同时也可以向男性因素所致的不孕不育夫妇提供志愿者的精液，在我国精子库是一种限制性使用技术，开展的医疗机构首先必须符合区域卫生行政规划，在人员、设备、场地和技术水平等方面也要达到基本要求，更需要建立制度化、机制化的管理体系来规范人类精子库的整个医疗行为，以保证为人民群众提供安全、有效的生殖健康医疗服务，为此我国卫生部颁布了一系列的有关精子库的管理及技术规范的相关文件来对人类精子库的运行实施动态管理，使得人类精子库建设和发展步入了规范化管理时代。
一、精子库设置的基本条件
1. 根据卫生部《人类精子库管理办法》的要求，人类精子库设置必须经卫生部批准，并设置在持有《医疗机构执业许可证》的综合性医院、专科医院或持有《计划生育技术服务执业许可证》的省级以上（含省级）计划生育服务机构内。中外合资、合作医疗机构,必须同时持有卫生部批准证书和原外经贸部(现商务部)颁发的《外商投资企业批准证书》。
2. 人类精子库至少应有能储存1万份精液标本的能力，总使用面积（供精者接待室、取精室、精子库实验室、标本存储室、辅助实验室和档案管理室等区域）不得少于115平方米，其中精子库实验室不少于40平方米和辅助实验室的面积不少于20平方米。设备的要求和场地一样，同样要达到相应的设置（见2003年卫科教发176号文件《人类精子库基本标准：人类精子库仪器设备配制基本标准》的要求）。同时开展人类精子库服务的医疗机构必须有能力为人类精子库技术的开展提供全面支撑，如人类精子冷冻技术及供精者筛查所必需的各项检验及遗传咨询服务等。
3. 人员资质要求 包括人员数量、人员资格和人员技术水平三个方面的要求：1）人员数量：最少要求有5位专职的工作人员，其中，执业医师1人，医学遗传学家1人，实验室工
作人员2人，管理人员1人；2）人员资格和技术水平：临床医师必须是有高级专业技术职称、从事生殖医学专业的执业医师；医学遗传学家应具有临床遗传学经验和中级以上技术职称；实验室技术人员要求能掌握男科实验室操作技能及世界卫生组织精液分析标准程序、生物细胞冷冻保存有关的知识及冷冻保存技术，掌握传染病及各类感染，特别是性病的检测及其它临床检验知识和技能；管理人员则要求具有计算机知识和操作技能并有一定管理能力。
4.工作部门设置
主要分为精液采集部门、精液冷冻部门、精液供给部门、档案管理部门、质量控制部门。
二、精子库的管理
1. 制度化管理
1）要建立合理、可行的有关管理、技术操作规范的指南和准则；
2）要建立合理的分工责任制度，保证每个岗位都有专人负责；
3）自查制度，定时检查所有制度、指南及准则的执行情况，核查这些制度规范是否合理，因此自查制度是制度化管理的核心。
2. 流程规范化管理
1）精液采集管理
精液采集部门负责供精者的发动、招募、筛查和精液采集。确保供精者为22～45周岁的中国公民，必须按《供精者健康检查标准》进行严格筛查，保证所提供精子的质量。
2）辅助实验室管理
辅助实验室主要负责供精者筛选的各项实验检查。各工作人员必须认真执行世界卫生组织《男性学实验室安全指南》，保证试验人员安全，试验结果可靠。
3）精液冷冻部门管理
精液冷冻保存部门负责进行供精者、自精保存者精液的冷冻、保存及废弃销毁等，操作运行须遵守卫生部的相关规定。
4）精液供给部门管理
精液的对外供给必须遵守如下原则：1）只能向由卫生行政主管部门批准开展辅助生殖技术的医疗机构提供冷冻精液；2）供给精液前，申请供精机构应填写《人类精子库供精申请表》。精子库根据《申请表》的具体要求，选择合适的冷冻精液； 3）人类精子库不得提供新鲜精液或2人及2人以上的混合精液。不得提供未经检验或检验不合格的冷冻精液；4）必须对供精者及用精情况进行随访；5）精子库必须根据精液使用反馈信息，以递减方式决定精液发放数量；已使5名妇女妊娠的供者精液，应进入废弃和销毁程序； 8）人类精子库不得提供新鲜精液进行供精人工授精，精液冷冻保存需经半年检疫期并经复检合格后，才能提供临床使用。
5）档案管理部门管理
人类精子库应当建立供精者档案，对供精者的详细资料和精子使用情况进行计算机管理并永久保存，所有资料应备份，文字资料应放置整齐有序，注意防火、防盗，严格遵守保密原则。
